Content uploaded by Dmitry Yu. Ignatov
Author content
All content in this area was uploaded by Dmitry Yu. Ignatov on Jan 02, 2017
Content may be subject to copyright.
ОСОБЕННОСТИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ НИТРОСИНЕГО ТЕТРАЗОЛИЯ
НЕЙТРОФИЛАМИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА. I. ВЛИЯНИЕ PH
Герасимов И.Г., Игнатов Д.Ю., Котельницкий М.А.
Активность нейтрофилов крови 14 здоровых добровольцев (8 женщин и 6
мужчин 21 - 37 лет) исследовали по реакции восстановления нитросинего
тетразолия (НСТ) при pH 7,0, 7,3 и 7,6 (K-фосфатный буфер). Зависимость доли
активированных нейтрофилов от времени реакции описана кинетическим
уравнением с константами k1 и k2, характеризующими соответственно скорости
поглощения и восстановления нейтрофилами НСТ. Между k1 и k2 обнаружена
сильная положительная корреляция (r = 0,99; p < 0,0001), указывающая на
зависимость скорости восстановления НСТ нейтрофилами от скорости его
поступления в клетки. Скорости последовательных стадий процесса
максимальны при pH 7,3 (что соответствует физиологическому значению pH
крови) и снижаются при закислении или защелачивании среды. Отношение k1/k2
не зависит от pH (7,0-7,6) и времени (0-6 ч) термостатирования крови до начала
реакции. Нейтрофилы, наиболее активно восстанавливающие НСТ
(потенциальные фагоциты), обладают меньшей, чем нейтрофилы другого
класса, проницаемостью мембран для НСТ, и их активность увеличивается при
закислении среды in vitro и, по-видимому, in vivo, однако не изменяется в
случае нефагоцитирующих нейтрофилов. Активация нейтрофилов приводит к
повышению pH среды, что вместе с увеличением количества активированных
потенциальных фагоцитов очевидно имеет физиологическое значение.
П р и н я т ы е с о к р а щ е н и я: АФК - активные формы кислорода; НСТ
- нитросиний тетразолий; ДАН - доля активированных нейтрофилов; Нк - доля
нейтрофилов, интенсивно генерирующих АФК; Нс - доля нейтрофилов, менее
активно продуцирующих АФК; Н0, Н1, Н2 и Н3 - доли нейтрофилов с
активностью 0, 1, 2 и 3 балла, соответственно.
Одно из звеньев цепи фагоцитоза нейтрофилами - генерацию активных
форм кислорода (АФК) - оценивают по способности этих клеток
восстанавливать нитросиний тетразолий (НСТ) in vitro (Маянский и др., 1981;
Герасимов, Калуцкая, 2000; Герасимов, Игнатов, 2001). В реакции
восстановления НСТ участвуют ионы водорода (H+) (Маянский и др., 1981), что
делает ее pH-зависимой (Нестеров, 1991; Лойда и др., 1982). Показано, что
продукция нейтрофилами АФК также pH-зависима и усиливается при
закислении среды (Trevani et al., 1999). Таким образом, способность
нейтрофилов восстанавливать НСТ явно зависит от pH.
Как показано нами ранее (Герасимов, Игнатов, 2001), в процессе
восстановления НСТ in vitro, наряду с активацией нейтрофилов, имеет место их
инактивация вследствие взаимодействия с субстратом, в качестве которого
выступает, например, поверхность лабораторной посуды. Такая инактивация
характерна только для нейтрофилов одного класса (Нк) - потенциальных
фагоцитов, интенсивно продуцирующих АФК. Нейтрофилы другого класса (Нс)
не контактируют с субстратом, не инактивируются, продуцируют АФК в
меньшей мере и, по-видимому, выполняют в фагоцитозе вспомогательные
функции, например, контролируют действие вазоактивных медиаторов и
комплемента (Паркер, 1989). Взаимодействие клеточной мембраны с
субстратом во многом обусловлено водородными связями, а, следовательно, pH-
зависимо и, вероятно, инактивация Нк в результате такого взаимодействия в
свою очередь зависит от pH.
С целью выявления особенностей активации нейтрофилов исследовали
кинетику восстановления ими НСТ в зависимости от pH среды.
Материал и методика
Исследовали активность нейтрофилов крови 14 здоровых добровольцев (6
мужчин и 8 женщин 21 - 37 лет) в реакции восстановления НСТ. Кровь брали
натощак из локтевой вены, гепаринизировали (5 мкл/мл) и термостатировали
при 37 oC в течение 0-6 ч. Реакцию восстановления НСТ нейтрофилами
проводили как в работе Герасимова и Калуцкой (2000), термостатируя
реакционную смесь при 37 oC в течение 60 мин. Состав реакционной смеси: 0,3
мл крови, 0,09 мл водного раствора НСТ (0,3 %), 0,01 мл водного раствора
продигиозана (5 %) и 0,2 мл K-фосфатного буфера (0,2 М; pH 7,0, 7,3 или 7,6).
Пробы клеточной взвеси (0,01 мл, ~ 2·104 нейтрофилов) отбирали на 5-ой, 10-ой
мин реакции и далее через каждые 10 мин, измеряли их pH (биологическим pH-
метром ОР212, 37 oC) с точностью ±0,05 и микроскопировали (об. 90Х, ок. 7Х)
под иммерсией (терпеновое масло). В двух мазках средней плотности, вы-
полненных из одной пробы, подсчитывали долю активированных нейтрофилов
(ДАН, %), содержащих включения диформазана, с допускаемым расхождением
между параллельными не более 11 %. По количеству диформазана нейтрофилы
относили к одной из 2 групп (Герасимов, Игнатов, 2001): Нс - с активностью 1
(Н1) или 2 (Н2) балла и Нк - с активностью 0 (Н0) или 3 (Н3) балла, которые соот-
ветствуют неактивным или активированным Нк. Погрешность
полуколичественной оценки содержания в нейтрофилах диформазана имеет тот
же порядок, что и измерение его концентрации инструментальными методами
(Virella et al., 1990; De Toni et al., 1997), но микроскопирование может позволить
выявить различия, не обнаруживаемые, например, фотометрически (De Toni et
al., 1997).
Использовали следующие реактивы: гепарин ("Биохеми", Австрия), НСТ
(ч. д. а., "Диа-М", Россия), продигиозан ("Мосхимфармпрепараты", Россия),
нейтральный красный, KН2РО4 и NaНРО4·12Н2О (ч. д. а., "Реахим", Россия).
Для оценки изменения pH крови, вызванного выделением СО2, применили
следующую методику. Одну пробирку Эппендорфа заполняли кровью, другую -
прокипяченной для удаления СО2 тридистилированной водой, так, чтобы при
закрывании часть жидкости вытеснялась и соединяли между собой трубкой с
внутренним диаметром 1 мм и длинной 5 мм. Объем воздуха в трубке был на 3
порядка меньше, чем объемы жидкостей в пробирках, то есть количеством СО2,
находящимся в системе вне крови, можно было пренебречь. Собранную систему
термостатировали (37 oC) на водяной бане 60 мин. Измеряли pH воды и крови
до и после термостатирования.
Средние и их доверительные интервалы рассчитывали с доверительной
вероятностью p < 0,05. Проводили регрессионный и корреляционный анализы,
используя пакет статистических программ "STATISTICA for Windows".
Результаты и обсуждение
Типичные кривые изменения ДАН и pH среды в процессе восстановления
НСТ при разных pH представлены на рис. 1. Как видно из рисунка, процесс
имеет медленную и быструю стадии. В условиях, когда НСТ в реакционной
смеси в избытке (Герасимов, Калуцкая, 2000), а его поступление в клетку -
промежуточный этап на пути образования диформазана, схему процесса можно
представить
k1 k2
[НСТ]e → [НСТ]i → [диформазан], (1)
где [НСТ]e и [НСТ]i - концентрации НСТ вне- и внутри клетки,
соответственно, k1 и k2 - соответственно константы скоростей поглощения
нейтрофилами НСТ и его восстановления до диформазана, с-1, [диформазан] –
концентрация диформазана, оцененная по ДАН. При этом скорость образования
диформазана очевидно определятся скоростью медленной стадии процесса -
поступлением НСТ в клетку. Чтобы подтвердить это положение оценили
соотношение [НСТ]e и [НСТ]i, а также скорость восстановления НСТ в
нейтрофилах. В соответствии со схемой (1) и согласно Семиохину с
сотрудниками (1986), [НСТ]i = (k1/[k2 - k1]) ·[НСТ]e· (exp[-k1t] - exp[-k2t]).
Оказалось, что рассчитанные значения [НСТ]i в процессе реакции на порядок
и ниже, чем [НСТ]e. При этом, изменением [НСТ]e, которая в реакционной
смеси в избытке, можно пренебречь. Следовательно, концентрация НСТ в
клетке существенно ниже, чем во внеклеточной среде, что указывает на
поступление НСТ в клетку, как на стадию определяющую скорость его
восстановления нейтрофилами. С другой стороны, известно, что концентрация
супероксидного радикала (О2·-) в различных типах покоящихся клеток, не
превышает 10-8 мМ (Владимиров и др., 1991). Однако при респираторном
взрыве происходит быстрое образованию О2·- в большом количестве (Маянский
и др., 1981). Если концентрации НСТ и О2·- ([О2·-]) в клетке сопоставимы, то
реакция их взаимодействия имеет второй порядок, причем скорость такой
реакции меньше, чем в случае избытка О2.-. Скорость восстановления НСТ
(VНСТ) в реакции второго порядка рассчитали по уравнению (Семиохин и др.,
1986): VНСТ = k(2) · [НСТ]i· [О2·-], где k(2) = 6,7·107 мМ/·с (Нестеров, 1991). При
использованной [НСТ]e = 0,61 м /л значение [НСТ]i ~ 0,01 мМ, а VНСТ - не менее
0,25 мМ/с. При максимальном содержании НСТ в клетке (0,01 мМ) время его
восстановления с рассчитанной по литературным данным VНСТ не превышает 25
с. Последняя величина существенно меньше времени восстановления НСТ
нейтрофилами 3600 с в исследованных условиях in vitro. Следовательно,
скорость восстановления НСТ нейтрофилами ограничена скоростью его
поступления в клетку.
В соответствии со схемой (1), зависимость ДАН от времени (t, с) описали
уравнением, для двух последовательных реакций первого порядка, придав k1
смысл константы скорости проникновения НСТ в клетку:
ДАН = ДАН∞ (1 - [k2/k2-k1] · exp[-k1t] + [k1/k2-k1] · exp[-k2t]), (2)
где ДАН∞ - ДАН при t → ∞, %. Вынося k2/(k2-k1) за скобки и вводя обозначение
ДАН∞ (k2/[k2-k1]) = a, получаем:
ДАН = ДАН∞ + a · (exp[-k1t] + [k1/k2] · exp[-k2t]). (3)
Как видно из рис. 1, кривые зависимостей ДАН от времени S-образны.
Скорость увеличения ДАН (тангенс угла наклона касательной к кинетической
кривой) в начале реакции возрастает, некоторое время остается постоянной,
после чего уменьшается (рис. 1). При этом максимальная скорость реакции
достигается не сразу, очевидно ввиду задержки наработки нейтрофилами АФК
(Root et al., 1975; Segal, Coade, 1978). Уменьшение скорости процесса, вероятно,
обусловлено несколькими причинами, основные из которых следующие.
Восстановление НСТ проходит при условии его избытка, и скорость процесса
определяется количеством нейтрофилов способных к активации, исчерпание
каковых в процессе реакции закономерно приводит к уменьшению скорости. Из
(3) видно, что второе слагаемое правой части уравнения, и, следовательно,
скорость процесса стремятся к нулю при ДАН → ДАН∞. Кроме того, в реакции
восстановления НСТ до диформазана расходуются ионы водорода (H+)
(Маянский и др., 1981), что приводит к уменьшению концентрации H+ ([H+]) и,
вероятно, к замедлению процесса. Повышение pH реакционной смеси может
быть обусловлено и выделением из нее СО2, как это происходит в случае
цельной крови in vitro (Хейль и др., 2001). Снижение [H+] (повышение pH)
действительно имеет место в процессе реакции (рис. 1). При этом зависимость
pH от времени гиперболическая, и вершина гиперболы соответствует примерно
10 мин процесса, после чего pH изменяется медленнее. S-образная зависимость
ДАН от времени имеет точку перегиба, также соответствующую примерно 10
мин, и скорость процесса вслед за тем уменьшается. Таким образом, время
начала уменьшения скоростей изменений обоих показателей совпадает, что
подтверждает взаимосвязь между ними. На эту же взаимосвязь указывает факт
обратной зависимости предельных значений ДАН от pH реакционной смеси в
начале реакции (рис. 1): сдвиг pH в кислую сторону приводит к увеличению
количества активных нейтрофилов in vitro, что согласуется с данными из
литературы (Trevani et al., 1999) и, очевидно, имеет физиологический смысл для
ситуации in vivo в очагах воспаления. Не исключено также влияние pH на
скорость процесса восстановления НСТ посредством изменения степени
протонирования последнего и(или) проницаемости клеточных мембран.
Для того, чтобы определить роль восстановления НСТ нейтрофилами в
изменение pH реакционной смеси оценили вклад в него выделения СО2.
Измерив изменения pH в соединенных между собой пробирках с кровью и
водой, показали, что после 60 мин термостатирования увеличение pH крови
(0,11±0,061) в пределах погрешности равно уменьшению pH воды (0,08±0,026).
Следовательно, СО2, выделяющийся из крови в процессе термостатирования,
практически полностью переходит в воду, что приводит к одинаковому по
величине и противонаправленному изменению pH обеих жидкостей. Как видно
из рис. 1, увеличение pH реакционной смеси в реакции восстановления НСТ,
составляет около 0,2 единиц, то есть примерно в 2 раза больше, чем при
термостатировании цельной крови. Следовательно, повышение pH реакционной
смеси обусловлено как выделением из нее СО2, так и расходованием H+ в
реакции восстановления НСТ.
Обратим внимание, что защелачивание крови вследствие выделении СО2
возможно исключительно in vitro, а вследствие функционирования
нейтрофилов, - вероятно, также и in vivo. Последний феномен может иметь
физиологическое значение, заключающееся в увеличении pH в очагах
воспаления, где закисление среды приводить к инактивации нейтрофилов
(Lardner., 2001).
Обработав экспериментальные данные в координатах уравнения (3), при
pH исходных буферных растворов 7,0, 7,3 и 7,6 нашли значения его констант,
средние величины которых представлены на рис. 2. Как видно из рисунка, с
увеличением pH величины ДАН∞ и Н3 (активированные Нк) снижаются. Этот
эффект, как и характер зависимостей ДАН и pH реакционной смеси от времени
реакции, указывает на взаимосвязь между ДАН и pH. При этом сдвиг на
среднюю величину Нс шкал ДАН∞ и Н3 позволяет увидеть связь между двумя
последними показателями. Обратим внимание, что ДАН∞ зависит от времени
теромстатирования крови до начала реакции: увеличивается, достигает
максимума не позднее, чем через 4 ч., после чего снижается. Изучение причин
этого эффекта может стать предметом специального исследования.
Изменения k1 и k2 в зависимости от pH однонаправлены, их значения
максимальны при pH 7,3, и достоверно выше, чем при pH 7,6 (p < 0,05) или 7,0
(p < 0,1). Следовательно, скорость поглощения нейтрофилами НСТ максимальна
при pH 7,3, находящемся в диапазоне физиологических значений крови, и
снижается при закислении или защелачивании среды. Зависимые от pH
изменения обусловлены уменьшением скорости определяющей стадии процесса
- поглощения НСТ нейтрофилами. Следовательно, pH влияет на процесс, в пер-
вую очередь, посредством изменения проницаемости мембран нейтрофилов для
НСТ. Действительно, между значениями константы скорости проникновения
НСТ в клетку и брутто-константы скорости реакций восстановления НСТ
имеется сильная положительная корреляция (r = 0,99; p < 0,0001). Отношения
этих констант при pH буферных растворов 7,0, 7,3 и 7,6 равны соответственно
0,933±0,0088, 0,941±0,011 и 0,934±0,0096, не зависят (p > 0,05) от pH в
исследованном диапазоне его значений и времени предварительного
термостатирования, составляя в среднем 0,938±0,0066.
Как установлено нами ранее (Герасимов, Игнатов, 2001), за 60 мин
реакции восстановления НСТ все Нс активируются и идентифицируются как
нейтрофилы с активностью 1 и 2 балла (Н1 и Н2), а Нк - с активностью 0 и 3
балла (Н0 и Н3). В случае Н1 и Н2 значения k1, k2 и k1/k2 не различаются (p > 0,1),
не зависят от pH и в среднем для Нс отношение k1(Нс)/k2(Нс) = 0,983±0,0021.
Последняя величина выше (p < 0,05), чем у активированных Нк, для которых
независимо от pH отношение k1(Нк)/k2(Нк) = 0,965±0,0052. В отличие от Нс,
значения k1(Нк) и k2(Нк) при pH 7,3 выше (p < 0,05), чем при 7,0 или 7,6, то есть
Нк pH-зависимы, а Нс pH-независимы. Последнее положение подтверждают
сильные положительные корреляции между k1 и k1(Нк) или k2 и k2(Нк) (r = 0,78 и
0,76; p < 0,0001) при том, что аналогичные корреляции для всех Нс
малозначимы (p > 0,2). Приведенные факты еще раз подтверждают функци-
ональную неоднородность нейтрофилов, которая, в частности, обусловлена
разной проницаемостью мембран Нс и Нк для НСТ. В самом деле, константа k1,
и, следовательно, проницаемость клеточных мембран для НСТ, в случае Нс
больше в среднем в 2,00±0,34 раза (p < 0,01), чем у Нк, что согласуется с
полученными ранее результатами (Герасимов, Игнатов, 2004).
Различия между Нк и Нс выявлены и при анализе их ДАН. Количество Нс
по завершении реакции составляет 42,1±4,3 (pH 7,0), 38,6±3,9 (pH 7,3) и 39,4±4,0
% (pH 7,6), находится в диапазоне полученных ранее значений, который по
уточеннным данным составляет 25 - 45 % (Герасимов, Игнатов, 2004), не
зависит от pH (p > 0,1) и в среднем равно 39±3,5 %, тогда как доля
активированных Нк увеличивается (p < 0,05) с уменьшением pH (рис. 2). Влия-
ние pH на активность Нк определяет наблюдаемые изменения ДАН∞ при разных
pH и подтверждается независимой от pH сильной корреляцией между
количеством активированных Нк и ДАН∞ (r = 0,71; p < 0,0001) при том, что Нс и
ДАН∞ коррелируют слабо (p > 0,4). Таким образом, при закислении среды in
vitro увеличивается исключительно доля активированных Нк, которые являются
потенциальными фагоцитами (Герасимов, Игнатов, 2001). Изменение числа
активированных Нк достоверно (p < 0,05) при снижении pH от 7,6 до 7,0 и более
выражено при сдвиге pH от физиологических величин в кислую, но не в
щелочную сторону, аналогично ДАН∞ (рис. 2). Эта закономерность, очевидно,
имеет физиологическое значение, заключающееся в pH-зависимом изменении
количества активных фагоцитов, в частности, в очагах воспаления, где, как
известно, среда закислена.
Таким образом, скорость восстановления нейтрофилами НСТ
определяется скоростью его поступления в клетки. Последняя максимальна при
pH 7,3 (что соответствует физиологическому значению pH крови), снижается
при закислении или защелачивании среды в диапазоне pH 7,0-7,6 и различна для
Нс и Нк. Отношение констант скоростей последовательных стадий процесса
восстановления НСТ не зависит от pH среды, времени термостатирования крови
до начала реакции и также различается в случае Нс и Нк. Кроме того, количество
Нс, активированных по завершении реакции, не зависит от pH, тогда как
количество потенциальных фагоцитов (активированных Нк) - увеличивается при
закислении среды in vitro и, по-видимому, in vivo. При этом активация
нейтрофилов приводит к повышению pH среды, что вместе с увеличением
количества потенциальных фагоцитов может иметь физиологическое значение.
С п и с о к л и т е р а т у р ы
Владимиров Ю. А., Азизова О. А., Деев А. И., Козлов А. В., Осипов А. Н., Рощупкин
Д. И. 1991. Свободные радикалы в живых системах. Итоги науки и техники, сер. Биофи-
зика. 29. М.: ВИНИТИ. 252.
Герасимов И. Г., Игнатов Д. Ю. 2001. Функциональная неравнозначность
нейтрофилов крови человека: генерация активных форм кислорода. Цитология. 43 (5) :
432 – 436.
Герасимов И. Г., Игнатов Д. Ю. 2004. Особенности активации нейтрофилов in vitro.
Цитология. 46 (2) : 155 - 158.
Герасимов И. Г., Калуцкая О. А. 2000. Кинетика реакции восстановления
нитросинего тетразолия нейтрофилами крови человека. Цитология. 42 (2) : 160 - 165.
Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. 1982. Гистохимия ферментов: лабораторные
методы. М.: Мир. 272 с.
Маянский А. Н., Пазюк Е. А., Макарова Т. П., Паршакова Р. А., Пикуза О. И. 1981.
Механизм и диагностические возможности реакции восстановления нитросинего
тетразолия нейтрофилами человека. Казанский мед. журнал. 62 (4) : 64
- 68.
Нестеров П. В. 1991. Итоги науки и техники. М.: Винити. 252 с.
Семиохин И. А., Страхов Б. В., Осипов А. И. 1986. Кинетика гомогенных
химических реакций. М.: Изд-во Моск. ун-та. 232 с.
Паркер Ч. В. 1989. Медиаторы: высвобождение и функции. В кн.: Иммунология.
М.: Мир. 3: 170 - 247.
Хейль В., Коберштейн Р., Цавта Б. 2001. Референтные пределы у взрослых и детей.
Преаналитические предосторожности. М.: Лабпресс. 176 с.
De Toni S., Piva E., Lapolla A., Fontana G., Fedele D., Plebani M. 1997. Respiratory
burst of neutrophils in diabetic patients with periodontal disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 832 : 363
- 367.
Lardner A. 2001. The effects of extracellular pH on immune function. J. Leukoc. Biol.
69 : 522 - 530.
Root R. K., Metcalf J., Oshino N., Chance B. 1975. H2O2 release from human
granulocytes during phagocytosis. I. Documentation, quantitation, and some regulating factors.
J. Clin. Invest. 55 : 945 - 955.
Segal A. W., Coade S. B. 1978. Kinetics of oxygen consumption by phagocytosing human
neutrophils. Biochem. Biophys. Res. commun. 84 : 611 - 617.
Trevani A. S., Andonegui G., Giordano M., Lopez D. H., Gamberale R., Minucci F.,
Geffner J. R. 1999. Extracellular acidification induces human neutrophil activation. J. Immunol.
162 (8) : 4849 - 4857.
Virella G., Thompson T., Haskill-Strowd R. 1990. A new quantitative nitroblue
tetrazolium reduction assay based on kinetic colorimetry. J. Clin. Lab. Anal. 4 (2) : 86 - 89.
