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REDVET. Revista electrónica de Veterinaria 1695-7504
2010 Volumen 11 Número 06
Factibilidad del uso de la proteína recombinante VP3 de Gumboro en un ensayo inmunoenzimático tipo ELISA
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Factibilidad del uso de la proteína recombinante VP3 de
Gumboro en un ensayo inmunoenzimático tipo ELISA
Alfonso, A. y Noda, Julia Dirección de Microbiología, Grupo de
Virología Animal. Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria
(CENSA), Apartado 10, San José de las Lajas, La Habana, Cuba.
Correo electrónico: abdulahi@censa.edu.cu
Resumen
Nuestro objetivo fue demostrar la factibilidad del empleo de la proteína
recombinante VP3 del virus de la enfermedad de Gumboro para el
desarrollo de un ELISA indirecto que permita detectar anticuerpos
específicos a esta proteína. Los sueros positivos se obtuvieron por
inoculación experimental. Se empleo el formato de ELISA indirecto y se
titularon los reactantes por el método de tablero de ajedrez. Para la
realización del ELISA indirecto una placa de 96 pozos fue recubierta con la
proteína recombinante VP3 a razón de 5 ug/ml y se emplearon diluciones
de suero y conjugado de 1:100 a 1:600 y de 1:12500 a 1:100000
respectivamente. Los resultados arrojaron una excelente diferenciación
entre los sueros positivos y negativos en las diferentes diluciones, sobre
todo en las diluciones inferiores. Se apreció una disminución progresiva de
la densidad óptica del suero positivo con el aumento de las diluciones del
mismo y del conjugado, a excepción del negativo, demostrando una
reacción específica del analito (IgY) por la proteína VP3. Pudimos
determinar que tanto los reactivos, metodología y protocolos seleccionados
nos permiten distinguir muy bien entre los sueros positivos reactivos a VP3
y los negativos, demostrándose además que dicho ensayo poseía una
tendencia a dar muy poco fondo. Con estos resultados podemos concluir
que el uso de la proteína recombinante VP3 de Gumboro es factible para su
empleo en el desarrollo de un ensayo inmunoenzimático tipo ELISA.
Palabras clave: Gumboro; anticuerpos; ELISA; proteína recombinante;
VP3
Abstract
Our objective was to demonstrate the feasibility of the use of the
recombinante VP3 protein of the Infectious Bursal Disease Virus for the
development of an indirect ELISA for the detection of antibodies against
this protein. Positive sera were obtained by experimental inoculation. We
use the indirect ELISA. Sera and reactants were titled for the chessboard
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method. For the preparation of indirect ELISA, 96-well plate was recovered
with the recombinante VP3 protein at 5 ug/ml and dilutions of sera and
conjugate of 1:100 to 1:600 and of 1:12500 to 1:100000 respectively were
used. The results showed an excellent differentiation among positive and
negative sera in the different dilutions, mainly in the lowest. A progressive
decrease of the optical density (O.D) in the positive serum was appreciated
with the increase of the dilutions of positive serum and the conjugate,
exception the negative, demonstrating a specific reaction of the IgY for the
protein VP3. It could be determined that so much the reagents,
methodology and select protocols allow to differentiate among the positive
sera reactive to VP3 and the negatives, being also demonstrated that this
rehearsal possessed a tendency to give very little background. With these
results it can be concluded that the use of the recombinant VP3 protein of
Gumboro is feasible for its use in the development of a type ELISA
inmunoenzimatic assay.
Key words: Gumboro; antibodies; ELISA; recombinant protein; VP3
La enfermedad de Gumboro es una enfermedad infecciosa, altamente
contagiosa causada por el Virus de la Bursitis Infecciosa Aviar. Afecta
clínicamente a pollos jóvenes, sobre todo entre las 3 y 6 semanas de edad,
ocasionando diarreas acuosas blanquecinas, anorexia, depresión, plumas
erizadas, temblores y postración grave. La lesión más severa en pollos
infectados es la atrofia de la bolsa de Fabricio como resultado de la
depleción linfoide, debido a la necrosis y la apoptosis celular. Esta lesión
causa inmunosupresión, irreversible en pollos infectados antes de las 3
semanas de edad. La morbilidad puede llegar al 100% con una mortalidad
variable, en dependencia fundamentalmente de la virulencia de la cepa, el
estado inmune y la edad de las aves. Las cepas muy virulentas se
caracterizan por alcanzar mortalidades cercanas o superiores al 70%, sin
embargo las cepas variantes no causan mortalidad, pero si una severa
inmunosupresión (1, 2). Esta enfermedad causa severas pérdidas
económicas en la industria avícola en todo el mundo, no solo por la
mortalidad que puede llegar a ocasionar, sino también por los cuadros de
inmunosupresión que predispone al ave a enfermedades virales,
bacterianas y parasitarias y a una mala respuesta vacunal.
El diagnóstico confirmatorio puede ser realizado por serología y en estos
momentos se utilizan más frecuentemente los ensayos inmunoenzimáticos
tipo ELISA, pero otros métodos incluyen la inmunodifusión en gel de agar,
la virus-neutralización, la inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa. Las
ventajas de los ELISA para la detección de anticuerpos a Gumboro son su
alta sensibilidad, especificidad, rapidez, y el poder testar un gran número
de muestras, incluso de forma automática (2). Algunos de estos ELISAs
han sido también utilizados para determinar el título de anticuerpos al día
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de edad y predecir la edad óptima de vacunación (3). La mayoría de estos
ELISAs utilizan virus completo como antígeno de recubrimiento, lo que da
lugar que no puedan diferenciar anticuerpos del serotipo 1 y 2 y mucho
menor diferenciar animales vacunados de infectados (4), donde
precisamente la vacunación es la herramienta primaria usada en la
industria avícola para el control de esta enfermedad. Según Fernández (5),
las estrategias DIVA del ingles (Diferentiating Infected from Vaccinated
Animals) constituyen una de las apuestas más inmediatas en la
investigación de vacunas para el ganado en estos momentos.
Nuestro centro, integrado en las investigaciones de vacunas de nueva
generación sobre la base la ingeniería genética tiene como proyecto la
búsqueda de un candidato vacunal con el empleo de una proteína
recombinante para el control de la enfermedad de Gumboro. Previamente
se han hecho investigaciones relacionadas con la obtención de proteínas
recombinantes con actividad biológica de esta entidad.
Por lo que teniendo en cuenta estas premisas nos dimos a la tarea de
iniciar las investigaciones para desarrollar un ensayo inmunoenzimático
tipo ELISA acompañante de esta vacuna con el empleo de la proteína
recombinante VP3 que nos permita la detección de anticuerpos a esta
proteína con el propósito fundamental de poder diferenciar animales
vacunados de infectados y darle el carácter de vacuna DIVA al candidato,
como estrategia para el control epizootiológico y futura erradicación de
esta enfermedad en el país. Ochoa (6), refiere que los inmunoensayos
deben normalizarse y validarse en estadios tempranos del desarrollo de
todo candidato vacunal para tenerlos a punto para las ulteriores
investigaciones. Por lo que nuestro primer objetivo fue demostrar la
factibilidad del empleo de la proteína recombinante VP3 del virus de la
enfermedad de Gumboro para el desarrollo de un ELISA indirecto que
permita detectar anticuerpos específicos a esta proteína.
Para la realización de este estudio se empleó la proteína recombinante VP3
de Gumboro expresada en E. coli como recubrimiento. Este lote fue
obtenido en el 2005 en el laboratorio de Biología Molecular de nuestro
centro con una pureza de un 90%, purificada por cromatografía de afinidad
con iones metálicos, debido precisamente a la ventaja que tiene la misma
de poseer una cola de histidina que facilita este proceder. La concentración
fue de 0,5mg/ml y por Western-blot se demostró que conservaba su
actividad biológica al ser reconocida por un antisuero anti-gumboro de
referencia proveniente de la OIE. La misma estaba preservada a -20ºC, por
lo que 4 años de conservación nos permitirá adicionalmente determinar
aproximadamente su aplicabilidad para inmunoensayos después de este
período de tiempo.
Se empleó como soporte sólido placas Nunc tipo MaxiSorp de 96 pozos. El
suero positivo fue obtenido en pollos SPF provenientes del CENPALAB de 10
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semanas de edad inoculados con la cepa cubana de referencia BF8 a una
dosis de 10
3
DIEP/200ul/ave vía oculo-nasal y una segunda dosis 2
semanas posteriores con desangrado final a la tercera semana, 21 días
posteriores a la primera inoculación. Como suero negativo se utilizó el
obtenido previo al programa de inmunización. Estos sueros, tanto el
positivo como el negativo fueron testados para Gumboro, Reovirus y
Anemia infecciosa aviar utilizando los ELISAs comerciales IDEXX para estas
entidades y de acuerdo a las instrucciones del fabricante. A pesar que los
animales son SPF se testaron para Reovirus y Anemia infecciosa aviar
porque son las principales entidades virales que más probabilidad tienen de
circular en poblaciones aviares, de acuerdo a Rodriguez (7). Estos sueros
también fueron testados por seroneutralización, pero solo para Gumboro.
El conjugado empleado fue una anti-IgY peroxidasa en conejo proveniente
de SIGMA con un título de 1:25000. Este conjugado fue previamente
prediluido con una solución preservante 1:250 con el objetivo de aumentar
su rendimiento y disminuir la variabilidad inter-ensayo. El sustrato
empleado para la peroxidasa fue el 3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidine (TMB)
y como solución paralizadora ácido sulfúrico 0,5M. La lectura se realizó en
espectrofotómetro SUMA a 450 nm de longitud de onda. La solución de
lavado empleada fue PBS-Tween 20 al 0,05% y como bloqueo PBS con
suero de curiel al 5%. Se realizaron 3 lavados por paso, con 100ul por
pozo para los reactantes y 240ul para el lavado, excepto durante el paso
de bloqueo. Se utilizó el formato ELISA indirecto recubriendo la placa con
la VP3 recombinante a razón de 5ug/ml (0,5ug/pozo) con absorción toda la
noche (16 horas) a 4ºC en atmósfera húmeda. Se bloqueo con 150ul/pozo
por 1 hora a 37ºC. El procedimiento utilizado fue el ensayo de titulación en
tablero de ajedrez del suero y del conjugado. Se aplicaron las diluciones
(1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500 y 1:600) del suero control positivo y
negativo bajo las mismas condiciones de temperatura y humedad. Las
diluciones de conjugado empleadas fueron 1:50, 1:100, 1:200 y 1:400 que
teniendo en cuenta la pre-dilución 1:250 comentada previamente
representa (1:12500, 1:25000, 1:50000 y 1:100000) lo que da la medida
del trabajo con altas diluciones de conjugado. Igualmente se incubó 1 hora
a 37ºC. Este experimento se repitió en 3 ocasiones con el objetivo de
verificar la repetibilidad del ensayo.
El suero negativo demostró ser no reactivo a Reovirus, Anemia y Gumboro
por ELISA en los animales pre-inoculados, igual que para Gumboro por
sero-neutralización. El suero positivo resultó igualmente negativo a
Reovirus y Anemia y positivo a Gumboro por ELISA como se preveía, con
un título de 1:6832. Fue igualmente positivo a Gumboro por
seroneutralización, pero en este caso no se tituló. La obtención de estos
sueros a partir de una colonia de animales SPF y el demostrarse por ELISA
que eran negativos a dos de las principales entidades virales que tienden a
contaminar las colonias de aves SPF como son el Reovirus y la Anemia
infecciosa aviar, debido a su transmisión vertical, demuestra que tanto el
suero positivo como el negativo pueden ser considerados para futuros
análisis como sueros controles después de completados los ensayos de
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repetibilidad preliminar con diferentes sueros que contengan diferentes
títulos de anticuerpos (8). Según la OIE (9), los controles negativos deben
carecer de exposición o infección con el agente en cuestión, al contrario de
los controles positivos que si deben haber sido expuestos o infectados con
dicho agente que se quiere diagnosticar.
Tabla 1: Titulación en tablero de ajedrez para ELISA indirecto con
diluciones de suero y conjugado.
Diluciones de suero
1:100 1:200 1:300 1:400 1:500 1:600
(+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
2,295 0,131 2,151 0,087 2,029 0,096 1,9 0,085 1,793 0,08 1,603 0,079
B
2,233 0,133 2,093 0,089 1,956 0,104 1,805 0,092 1,755 0,086 1,663 0,085
1:50
C
1,774 0,099 1,557 0,084 1,377 0,085 1,234 0,083 1,156 0,082 1,099 0,077
D
1,763 0,097 1,554 0,083 1,374 0,085 1,182 0,083 1,148 0,088 1,09 0,072
1:100
E
1,139 0,078 0,963 0,071 0,838 0,072 0,74 0,072 0,704 0,075 0,667 0,064
F
1,152 0,076 0,969 0,068 0,833 0,07 0,748 0,065 0,734 0,074 0,694 0,063
1:200
G
0,617 0,068 0,519 0,064 0,459 0,065 0,402 0,063 0,396 0,068 0,377 0,061
H
0,613 0,066 0,525 0,063 0,477 0,063 0,437 0,062 0,382 0,066 0,354 0,06
1:400
Diluciones de conjugado
En la tabla 1 se demuestra como a medida que aumenta la dilución de
suero positivo va disminuyendo la absorbancia y como a medida que
aumenta la dilución de suero negativo no cambia la misma. Se aprecia que
el suero positivo reconoce con una alta absorbancia la VP3 recombinante
en casi todas sus diferentes diluciones, siendo siempre superior a la del
negativo. Ello demuestra que está ocurriendo una reacción realmente
específica del analito, es decir de los anticuerpos anti-VP3 presentes en el
suero. Este es el primer resultado donde se demuestra que nuestra
proteína recombinante VP3 es reconocida en un ensayo inmunoenzimático
tipo ELISA por suero obtenidos a partir de animales infectados con el virus
de la enfermedad de Gumboro. Además pudimos comprobar que dicha
proteína recombinante, después de 4 años de conservación, fue capaz de
conservar su actividad biológica, al ser reconocida eficientemente por
sueros anti-gumboro, por lo que podría ser utilizada en este tipo de ensayo
hasta 4 años, como mínimo, después de su obtención.
En todas las diluciones de suero con conjugado diluido 1:50 y 1:100 el
suero control positivo tuvo valores de absorbancia superiores a 1,0 y el
suero negativo en todas las combinaciones de diluciones de suero y
conjugado se mantuvo inferior a 0,14. Según Ochoa (6), se espera de un
ensayo inmunoenzimático tipo ELISA la mayor diferenciación entre el suero
positivo y negativo con el objetivo de aumentar la detectabilidad del
sistema diagnóstico.
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En el gráfico número 1 se aprecia que las mejores diluciones de suero
fueron 1:100 y 1:200 con diluciones de conjugado de 1:50 y 1:100 que
representa tomando en consideración la pre-dilución del conjugado de
1:250, una dilución de trabajo de 1:12500 y 1:25000 respectivamente, lo
que da la medida que se obtienen buenos resultados con altas diluciones
del conjugado. De forma gráfica se puede apreciar muy bien como decrece
la absorbancia con el aumento de las diluciones del positivo para cada una
de las diluciones de conjugado, demostrando que existe una reacción
específica. El suero control negativo se mantiene prácticamente inalterable,
apreciándose además que da muy bajos valores de fondo, muy cercanos a
0,1.
Gráfico 1. Dosis respuesta. Mejor dilución de suero
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2,2
2,4
50 100 200 400
Diluciones de conjugado
Absorbancia (D.O)
SC+1:100
SC-1:100
SC+1:200
SC-1:200
SC+1:300
SC-1:300
SC+1:400
SC-1:400
SC+1:500
SC-1:500
SC+1:600
SC-1:600
Gráfico 2. Dosis respuesta. Mejor dilución de conjugado
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
2,2
2,4
100 200 300 400 500 600
Diluciones de suero
Absorbancia (D.O)
SC+ Conj 1:50
SC- Conj 1:50
SC+ Conj 1:100
SC- Conj 1:100
SC+ Conj 1:200
SC- Conj 1:200
SC+ Conj 1:400
SC- Conj 1:400
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En el gráfico 2 se observa que la mejor dilución de conjugado estaba entre
1:50 (1:12500) y 1:100 (1:25000) para todas las diluciones de suero
control positivo (desde 1:100 hasta 1:600) con valores de absorbancia
superiores a 1,0. Igualmente se aprecia que la absorbancia del suero
negativo de mantuvo a un nivel basal para cada una de las diluciones de
conjugado en las diferentes diluciones de suero que confirma todo lo
planteado anteriormente sobre la especificidad del ensayo, por tanto su
factibilidad.
Con estos resultados pudimos determinar que tanto los reactivos,
metodología y protocolos seleccionados nos permiten distinguir muy bien
entre los sueros positivos reactivos a VP3 y los negativos, demostrándose
además que dicho ensayo poseía una tendencia a dar muy poco fondo, algo
muy recomendado para los ensayos inmunoenzimáticos tipo ELISA de
acuerdo a los criterios planteados por Jacobson (10). Este bajo fondo pudo
estar justificado por la utilización de una proteína recombinante purificada,
que aumenta a su vez la especificidad del ensayo como refiere la OIE (8) y
Jacobson (10).
Con estos resultados podemos concluir que el uso de la proteína
recombinante VP3 de Gumboro es factible para su empleo en el desarrollo
de un ensayo inmunoenzimático tipo ELISA para la detección de
anticuerpos específicos a la misma.
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Cornell University, Ithaca, New York, USA. This paper has been
published in the “Manual of Standards for Diagnostic Tests and
Vaccines”, p. 8-15 by OIE, France 1996 and is included as an excerpt
in this TECDOC with the permission of the OIE. 1996
REDVET: 2010, Vol. 11 Nº 06
Recibido 28.10.09 / Ref. prov. NOV0908_REDVET / Aceptado 10.05.10
Ref. def. 061002_REDVET / Publicado 01.06.2010
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