Otimização e avaliação do ensaio de imunofluorescência indireta para pesquisa de anticorpos anti-herpesvírus humano 8 (HHV-8) usando sangue colhido em papel de filtro

Abstract

O presente trabalho objetivou a otimização e a avaliação da coleta de sangue em papel de filtro para ser usada em levantamentos soroepidemiológicos de infecção por herpesvírus humano 8 (HHV-8). Foram utilizados os ensaios de imunofluorescência indireta (IFI) LANA e Lítico para a pesquisa de anticorpos anti-HHV-8 em amostras de sangue colhidas em membrana Schleicher Schuell de 28 pacientes com sarcoma de Kaposi (SK)/AIDS e 10 indivíduos sadios sem SK, dos quais os soros haviam sido anteriormente usados na padronização destas técnicas. Lâminas contendo células da linhagem BCBL-1 estimuladas ou não com éster de forbol, eluatos de sangue e conjugado anti-imunoglobulina humana marcado com fluoresceína foram empregados nas reações sorológicas e, as reações e os critérios de positividade seguiram os previamente estabelecidos na Seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz. Foi detectada fluorescência verde-amarelada na maioria das células nas diluições 1:50 e 1:100. Isto dificultou a leitura da IFI-Lítico, principalmente em diluições baixas, mas não interferiu na IFI-LANA cujo padrão pontilhado no núcleo coexistiu com a fluorescência de membrana. À medida que se seguiram as diluições, houve desaparecimento da inespecificidade e a leitura prosseguiu normalmente. Houve concordância de resultados positivos e negativos, com diferenças mínimas nos títulos de anticorpos. Os resultados obtidos viabilizam a coleta de sangue em papel para estudos epidemiológicos de infecção por HHV-8.

Full text

Otimização e avaliação do ensaio de imunofluorescência indireta para
pesquisa de anticorpos anti-herpesvírus humano 8 (HHV-8) usando
sangue colhido em papel de filtro
Standardization of the indirect immunofluorescence assay to search for
human herpesvirus 8 (HHV-8) antibodies using blood collected on filter
paper
ARTIGO DE ORIGINAL/ORIGINAL ARTICLE
RIALA6/1106
Rev. Inst. Adolfo Lutz, 66(1): 68-72, 2007
Joyce Matie Kinoshita SILVA1, Mariana Cavalheiro MAGRI1, Fabrício JACOB1, Elizabeth de los
SANTOS-FORTUNA1, Adele CATERINO-DE-ARAUJO1*
*Endereço para correspondência: Seção de Imunologia, Instituto Adolfo Lutz, Av. Dr. Arnaldo, 355, 11o andar, CEP 01246-
902, São Paulo, S.P. e-mail:caterino@ial.sp.gov.br
Seção de Imunologia, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, S.P.
Recebido: 17/01/2007 – Aceito para publicação: 25/04/2007
RESUMO
O presente trabalho objetivou a otimização e a avaliação da coleta de sangue em papel de filtro para ser
usada em levantamentos soroepidemiológicos de infecção por herpesvírus humano 8 (HHV-8). Foram
utilizados os ensaios de imunofluorescência indireta (IFI) LANA e Lítico para a pesquisa de anticorpos
anti-HHV-8 em amostras de sangue colhidas em membrana Schleicher Schuell de 28 pacientes com sarcoma
de Kaposi (SK)/AIDS e 10 indivíduos sadios sem SK, dos quais os soros haviam sido anteriormente
usados na padronização destas técnicas. Lâminas contendo células da linhagem BCBL-1 estimuladas ou
não com éster de forbol, eluatos de sangue e conjugado anti-imunoglobulina humana marcado com
fluoresceína foram empregados nas reações sorológicas e, as reações e os critérios de positividade seguiram
os previamente estabelecidos na Seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz. Foi detectada fluorescência
verde-amarelada na maioria das células nas diluições 1:50 e 1:100. Isto dificultou a leitura da IFI-Lítico,
principalmente em diluições baixas, mas não interferiu na IFI-LANA cujo padrão pontilhado no núcleo
coexistiu com a fluorescência de membrana. À medida que se seguiram as diluições, houve desaparecimento
da inespecificidade e a leitura prosseguiu normalmente. Houve concordância de resultados positivos e
negativos, com diferenças mínimas nos títulos de anticorpos. Os resultados obtidos viabilizam a coleta de
sangue em papel para estudos epidemiológicos de infecção por HHV-8.
Palavras-chave. sorologia, papel de filtro, imunofluorescência, herpesvírus humano 8 (HHV-8).
ABSTRACT
The aim of the present study was to standardize the use of blood collected on filter paper in
seroepidemiological studies of human herpesvirus 8 (HHV-8) infection. HHV-8 latent and lytic antibodies
were searched in eluates of blood collected on Schleicher Schuell membrane from 28 KS/AIDS patients
and 10 health individuals without KS, using “in house” immunofluorescence assays (IFAs). Serum samples
from the same individuals were previously evaluated by IFA–LANA and IFA-lytic, and the results were
compared to the results obtained in this study. IFAs were conducted according to criteria established at
Immunology Department of Instituto Adolfo Lutz, using BCBL-1 cells line stimulated or not with phorbol
ester, and FITC-anti human IgG conjugate. Non-specific stainning on IFAs were detected when 1:50
and 1:100 blood eluated dilutions were employed. This unespecificity disappeared on subsequent blood
dilutions. Concordant positive and negative results were obtained between sera and blood samples, but
some minor differences were observed on antibodies title. The results obtained confirmed the use of
blood collected on paper filter for HHV-8 seroepidemiological purposes.
Key words. serology, paper filter, immunofluorescence assay (IFA), human herpesvirus 8 (HHV-8).

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Silva JMK et al. Otimização e avaliação do ensaio de imunofluorescência indireta para pesquisa de anticorpos anti-herpesvírus humano 8
(HHV-8) usando sangue colhido em papel de filtro. Rev Inst Adolfo Lutz, 66(1): 68-72, 2007.
INTRODUÇÃO
Desde a descoberta do herpesvírus humano 8 (HHV-8)1
como sendo o agente etiológico do sarcoma de Kaposi (SK),
vários estudos se seguiram com vistas a identificar populações
e regiões endêmicas desta virose2. Inicialmente, homens que
faziam sexo com homens HIV-soropositivos foram apontados
como transmissores do HHV-8, pois neles foi detectada a forma
epidêmica do SK associada à AIDS3-5. Posteriormente, o vírus
foi encontrado nas outras formas clínico-epidemiológicas do
SK: no SK clássico do mediterrâneo, no SK endêmico africano
e no SK iatrogênico associado à terapia imunossupressora e
corticosteróide2,6-8.
Com a introdução da sorologia para a pesquisa de
anticorpos anti-HHV-8 foi possível mapear populações e
regiões endêmicas do vírus que estavam associadas ou não à
presença de SK9. Curiosamente, ameríndios da Amazônia
brasileira foram apontados como portadores de HHV-8, e neles
não foi detectado o SK10. Da mesma forma, em alguns países
africanos onde o HHV-8 é endêmico, não há muitos casos de
SK. Isto leva a crer que existam fatores presentes no hospedeiro
e/ou parasita que podem estar associados ao risco de
desenvolver doença relacionada ao HHV-811.
Até o presente, não existe um consenso de qual o
melhor método sorológico para o diagnóstico de infecção por
HHV-8, porém devido ao alto custo dos “kits” disponíveis no
mercado, as técnicas “in house” continuam sendo as mais
utilizadas em levantamentos epidemiológicos12-14. A Seção de
Imunologia do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, introduziu
no ano de 2001, a técnica de IFI-LANA e IFI-Lítico15 e com
ela realizou uma série de estudos com populações de diferentes
categorias de risco para adquirir esta virose. Foram analisados
soros de indivíduos sadios e infectados pelo HIV/AIDS16,
pacientes com SK/AIDS17, profissionais sadios da área da
saúde17, indivíduos com deficiência física e mental17, mulheres
portadores do HIV/AIDS18, crianças nascidas de mães HIV-
soropositivas19, crianças hospitalizadas para tratamento
eletivo20, populações indígenas21, pacientes em diálise22 e,
finalmente, profissionais do sexo feminino23.
Mais recentemente, com vistas a auxiliar países africanos
com poucos recursos financeiros e que têm o SK na sua forma
endêmica e epidêmica foi idealizado um estudo para verificar a
possibilidade de utilizar sangue colhido em papel de filtro para
a detecção de anticorpos anti-HHV-8. As vantagens deste
procedimento são: facilidade de coleta, armazenamento,
transporte, baixo custo e menor desconforto e risco para o
paciente. Com base na Portaria do Ministério da Ciência e
Tecnologia (MCT No 523) de 16/08/2005 que prevê apoio
financeiro para intercâmbio técnico-científico entre Brasil e
países africanos de língua portuguesa, foi encaminhado ao CNPq
e aprovada a Missão Exploratória ProÁfrica, que visa detectar a
real magnitude da infecção por HHV-8 em Moçambique. A etapa
preliminar desta pesquisa é verificar a viabilidade da coleta de
sangue em papel de filtro, objeto deste estudo.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados os ensaios de imunofluorescência
indireta (IFI) LANA e IFI-Lítico para a pesquisa de anticorpos
IgG anti-HHV-8 em amostras de sangue colhidas em papel de
filtro (membrana Schleicher Schuell BioScience Inc., USA)
de 28 pacientes com SK/AIDS do Instituto de Infectologia
Emílio Ribas e 10 amostras de sangue de indivíduos
aparentemente sadios, sem SK, colhidas no ano de 1999 e
armazenadas a –70 ºC. Soros dos mesmos indivíduos foram
usados anteriormente na padronização da IFI-LANA e IFI-
Lítico15 e os resultados obtidos comparados aos atuais. Células
da linhagem BCBL-1 latentemente infectadas pelo HHV-8 e,
as mesmas células estimuladas com éster de forbol, foram
usadas para a detecção dos anticorpos LANA e Lítico,
respectivamente. As reações e os critérios de positividade
seguiram os previamente estabelecidos na Seção de Imunologia
do Instituto Adolfo Lutz, sendo considerados positivos na IFI-
LANA os soros que a partir da diluição 1:50 apresentaram
fluorescência verde maçã com padrão nuclear pontilhado em
mais de 90% das células BCBL-1, e na IFI-Lítico, fluorescência
intensa de membrana (nuclear e externa) e difusa em toda a
célula, em aproximadamente 5% das células BCBL-1
estimuladas com éster de forbol15,17.
Para a pesquisa atual, círculos de 6 mm de diâmetro
contendo 10µL de sangue, ou seja 5µL de soro, foram
recortados do papel e eluídos em 200µL de PBS 0,01M, pH
7,2, por 16 horas a 4°C. Posteriormente, foi adicionado 50µL
de PBS contendo leite desnatado a 5% (diluição final 1:50 em
PBS leite 1%) e feita a diluição seriada na razão 2 para titulação
dos anticorpos. Todos os casos foram inicialmente testados para
as diluições 1:50, 1:100 e 1:200. Foi utilizado como conjugado
anti-IgG humana marcada com fluoresceína diluído em azul
de Evans-leite 1%. Quatro profissionais treinados, dois dos
quais não estavam envolvidos no estudo anterior, realizaram a
leitura das lâminas.
A utilização dos soros desta casuística para a
padronização da sorologia para HHV-8 na Seção de Imunologia
do IAL foi aprovada pelos Comitês de Ética em Pesquisa das
Instituições envolvidas, incluindo a coleta de sangue em papel
de filtro (CTC # 35/1999).
RESULTADOS
Durante o processo de padronização das técnicas de IFI-
LANA e IFI-Lítico para pesquisa de anticorpos anti-HHV-8
nos anos de 1999-2000, foi verificado que o uso de leite
desnatado a 1% bloqueava sítios inespecíficos de anticorpos e,
assim, o leite foi usado nas várias etapas de reação, também
para eluatos de papel de filtro.
Os resultados obtidos com eluatos tanto do grupo de
pacientes com SK/AIDS como do grupo sadio mostraram
fluorescência verde-amarelada na maioria das células BCBL-

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(HHV-8) usando sangue colhido em papel de filtro. Rev Inst Adolfo Lutz, 66(1): 68-72, 2007.
1 nas diluições 1:50 e 1:100. Isto dificultou a leitura
principalmente da IFI-Lítico, mas não interferiu na IFI-LANA,
cujo padrão pontilhado no núcleo coexistiu com a fluorescência
de membrana (Figura 1, Painel A e B, respectivamente). À
medida que se seguiram as diluições, houve desaparecimento
da inespecificidade e a leitura prosseguiu normalmente (Figura
1, Painel D e E). Para os casos negativos e do grupo sadio,
houve apenas padrão amarelado que desapareceu com a diluição
do soro (Figura 1, Painel C e F).
Houve concordância de resultados positivos e negativos
nos dois grupos analisados com diferenças nos títulos de
anticorpos em oito casos de SK/AIDS: seis com diferença de
um título (Pt. 10, 14, 28, 31, 34 e 39), um com diferença de
dois títulos (Pt. 32) e um com diferença de três títulos (Pt. 38).
Na maioria dos casos os títulos mais altos foram obtidos com
eluato de sangue (Tabela 1).
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
Nos últimos anos, vários inquéritos soroepidemiológicos
principalmente de doenças parasitárias têm sido realizados usando
sangue colhido em papel de filtro. Este material tem se mostrado
útil para ser empregado em reações de aglutinação,
imunoenzimáticas (ELISA), de imunodifusão (ID) e IFI. Um
estudo comparativo usando soro e eluato de sangue para pesquisa
de anticorpos anti-Toxoplasma gondii mostrou que o eluato
poderia ser usado na pesquisa de toxoplasmose congênita,
reduzindo assim a necessidade de punção sangüínea em crianças
e possibilitando o uso de material estocado em papel de filtro24.
Já no Programa de Controle do Calazar no Brasil, a Fundação
Nacional de Saúde adotou o uso da coleta de sangue em papel
para o controle da leishmaniose visceral canina, com vistas a
introduzir um programa de eliminação de cães sororeativos. Nele
foi feito um estudo comparativo entre soro e eluato, usando as
técnicas de IFI e ELISA. Os resultados obtidos provaram ser o
eluato de sangue útil para inquéritos soroepidemiológicos25. Na
Nicarágua, um estudo em região endêmica de doença de Chagas
mostrou que o uso de sangue colhido em papel de filtro poderia
substituir o soro nas reações de ELISA e IFI, resultando em
sensibilidade de 100% e especificidade de 90% para a pesquisa
de anticorpos específicos26. A mesma estratégia para pesquisa
de anticorpos anti-Plasmodium falciparum foi adotada para
controle de malária na Amazônia brasileira27 e na Índia28.
Recentemente, foi proposto pelo CDC de Atlanta nos EUA, um
protocolo de extração de anticorpos de amostras de sangue
Figura 1. Amostras representativas do padrão de fluorescência
obtido com as reações de IFI-LANA e IFI-Lítico, usando eluato
de sangue colhido em papel de filtro de casos de SK/AIDS.
Painel A e C (soro-reagente e não-reagente na IFI-LANA,
diluição 1:50, aumento x400), Painel B (soro-reagente na IFI-
Lítico, diluição 1:50, aumento x200). Painel D, E e F (mesmos
soros na diluição 1:400).
Tabela 1. Resultados obtidos com a sorologia para HHV-8
usando soro e eluato de sangue colhido em papel de filtro de
28 pacientes com SK/AIDS.
PACIENTE
No
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
16
17
18
23
26
28
31
32
34
35
37
38
39
48
50
IFI-LANA*
25.600
25.600
1.600
200
100
200
-
200
-
200
800
200
200
400
-
1600
-
-
800
25.600
100
1.600
6.400
-
1.600
25.600
-
-
IFI-LÍTICO*
3.200
3.200
800
800
100
800
-
6.400
50
800
3.200
-
50
400
50
25.600
3200
-
800
3.200
400
200
1.600
-
1.600
3.200
-
-
IFI-LANA*
25.600
25.600
1.600
200
100
200
-
200
-
200
800
200
100
400
-
1600
-
-
1.600
51.200
400
1.600
6.400
-
3.200
25.600
-
-
IFI-LÍTICO*
3.200
3.200
800
800
100
800
-
6.400
-
800
3.200
-
100
400
50
25.600
3.200
-
1.600
6.400
800
400
1.600
-
200
1.600
-
-
ELUATO DE SANGUESORO
* Título de anticorpos (recíproca da maior diluição do soro com resultado
reagente).
- (soro não reagente)

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(HHV-8) usando sangue colhido em papel de filtro. Rev Inst Adolfo Lutz, 66(1): 68-72, 2007.
colhidas em papel, para serem utilizadas na sorologia para
sarampo/rubéola pela Organização Mundial da Saúde, em
situações de surtos29.
Até o presente, não foram encontrados relatos de sorologia
para HHV-8 usando sangue colhido em papel de filtro. O presente
estudo mostra que esta prática pode ser adotada para pesquisa
de anticorpos na IFI-LANA e IFI-Lítico e que os resultados
obtidos são concordantes, embora com algumas diferenças no
título de anticorpos. Estas diferenças podem estar relacionadas
ao lote de células e lâminas empregadas na reação, à forma de
armazenamento do soro/sangue e, finalmente, ao critério de
leitura dos técnicos envolvidos na análise. Curiosamente, em
alguns casos, o título de anticorpos detectado em material colhido
em papel de filtro foi superior ao encontrado no soro. Isto pode
ser devido ao processo de congelamento/descongelamento que
os soros sofreram durante as várias etapas de padronização da
IFI-LANA e IFI-Lítico, bem como na avaliação de kits comerciais
de ELISA e IFI, realizados em anos anteriores17, fato que não
ocorreu com o sangue colhido em papel de filtro.
Embora mais estudos sejam necessários para a validação
do método, a facilidade de coleta, armazenamento, transporte,
baixo custo e menor desconforto ao paciente permite a utilização
desta metodologia em inquéritos epidemiológicos de infecção
por HHV-8 e na Missão Exploratória ProÁfrica onde são
parceiros o Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, o Centro de
Referência e Treinamento em AIDS de São Paulo e a
Universidade Eduardo Mondlaine de Maputo, Moçambique.
AGRADECIMENTOS
Suporte: CNPq (Conselho Nacional de Desenvol-
vimento Científico e Tecnológico). Edital Pró-África, Processo
# 490179/2006-1.
Joyce M. K. SILVA (Bolsista do Programa de
Aprimoramento da FUNDAP, área Imunologia no Instituto
Adolfo Lutz de São Paulo), Mariana C. MAGRI (Bolsista de
Mestrado do CNPq e Pós-Graduanda do Curso de Farmácia,
Área Análises Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas
da Universidade de São Paulo), Fabrício JACOB (Bolsista de
Mestrado da CAPES e Pós-Graduando da Coordenadoria de
Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São
Paulo, Área Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública),
Elizabeth SANTOS-FORTUNA (PqC V, Supervisora
FUNDAP), Adele CATERINO-DE-ARAUJO (PqC VI,
Bolsista de Produtividade em Pesquisa do CNPq, Orientadora)
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