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Etude structurelle en Microscopie Confocale Raman du
cartilage produit par ingénierie tissulaire
Jean N’Dre
To cite this version:
Jean N’Dre. Etude structurelle en Microscopie Confocale Raman du cartilage produit par ingénierie
tissulaire. Médecine humaine et pathologie. Université Montpellier; Université Félix Houphouët-
Boigny (Abidjan, Côte d’Ivoire), 2021. Français. �NNT : 2021MONTT001�. �tel-03342131�
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ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
THÈSE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR
DE L’UNIVERSITÉ DE MONTPELLIER
En BIOLOGIE SANTE
École doctorale :
Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (CBS2) et
Odontologie et Matières fondamentales
Unité de recherche :
Laboratoire Bioingénierie et Nanosciences UR_UM104
UFR Odontostomatogie Abidjan, Côte d’Ivoire
En partenariat international avec
Université Félix HOUPHOUET BOIGNY (UFHB), COTE D’IVOIRE
Présentée par N’DRE Jean N’DRE
Le 26 mars 2021
Sous la direction des
Pr. Frédéric CUISINIER et Pr. Yolande KOFFI-GNAGNE
Devant le jury composé de
Mme la Professeure DOSSO Mireille, PUPH, Université FHB Abidjan
Mr. le Professeur YAO GNANGORAN Victor, PUPH, Université de Bouaké
Mr. le Docteur Youri ARNTZ, MCU, Université de Strasbourg
Mr. le Professeur DJEREDOU Kouadio Benjamin, PUPH, UFHB Abidjan
Mme le Docteur Danièle NOEL, HDR, Université de Montpellier
Mme le Docteur Hamideh SALEHI, HDR, Université de Montpellier
Présidente
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Examinateur
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE
CONFOCALE RAMAN DU CARTILAGE PRODUIT
PAR INGENIERIE TISSULAIRE
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ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE
CONFOCALE RAMAN DU CARTILAGE PRODUIT
PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Thèse
pour l'obtention du Diplôme de Doctorat d’Université
Domaine “Biologie Santé”
Mention “Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé”
Présentée et soutenue le 26 Mars 2021
par
N’DRE N’DRE Jean
Sous la Direction des :
Professeur Frédéric CUISINIER, PUPH
Directeur Laboratoire Bioingénierie et Nanosciences LBN EA4203, Montpellier
Professeure Yolande KOFFI-GNAGNE, MCA
Directrice de la Faculté Dentaire Abidjan, Côte d’Ivoire
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ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Préambule
Le travail qui suit est le fruit d’une collaboration entre le Laboratoire Bioingénierie et
Nanosciences (LBN EA4203, désormais UR_UM104 depuis une date récente) et l’Equipe
Danièle de l’Institut de Médecine Régénératrice et Biothérapies (IRMB) du CHU de
Montpellier, dont les travaux sont axés sur la « Biologie de la cellule souche mésenchymateuse
et thérapies du cartilage » dans la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans
la régénération des maladies ostéo-articulaires.
Dans cette collaboration, l’équipe de l’IRMB a produit et fournit tous les échantillons (les
cellules et les tissus cartilagineux) qui ont servi à la conduite de cette étude. Les analyses
immunohistochimie et moléculaire ont été réalisé également à l’IRMB. Au LBN, notre travail
a consisté à caractériser les échantillons reçus à partir de la microscopie confocale Raman.
Cette thèse a été réalisée dans le cadre d’une cotutelle entre les universités de Montpellier
(FRANCE) et Félix Houphouët BOIGNY d’Abidjan (COTE D’IVOIRE). Selon les clauses de
la convention, le travail a été effectué durant ces trois années par période alternée de 6 mois
entre les deux universités
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ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
RESUME
Le cartilage articulaire est un tissu conjonctif, non innervé et non vascularisé, qui recouvre
les extrémités des os au sein des articulations. Les fortes contraintes auxquelles est soumis le
cartilage provoquent souvent l’altération de la matrice articulaire. Les défauts du cartilage
articulaire sont généralement associés à la douleur et à une perte de la mobilité articulaire, et
ont un impact sur la qualité de la vie, y compris le bien-être physique, social et économique. En
raison du défaut de régénération ou de cicatrisation spontanée du cartilage, le recours à des
techniques d’ingénierie tissulaire semble une voie prometteuse pour répondre aux besoins
clinques des patients souffrant d’arthrose et de troubles de l’articulation temporo-mandibulaire
(TATM). Pour optimiser l’ingénierie du tissu cartilagineux, des techniques (nanométriques)
non invasives, non destructives et à haute résolution sont nécessaires, afin d’évaluer la qualité
et l’arrangement structurel du cartilage fabriqué in vitro. L’objectif de notre étude était de suivre
la maturation du cartilage artificiel sous charges mécaniques avec des méthodes innovantes de
microscopies, dont la microscopie confocale Raman, une technique d’analyse sans contact, non
destructive et sans aucune préparation de l’échantillon. Nous avons, à partir des spectres et des
images hyperspectrales Raman, caractériser les différences morphologiques des chondrons
suivant les différentes zones de la matrice du cartilage et établir une cartographie représentative
de la distribution spatiale des composants biochimiques de ladite matrice sur toute sa
profondeur. Le calcul de l’épaisseur de la matrice péricellulaire a mise en évidence des
variations croissantes dépendantes de la profondeur (zone superficielle est = 2,7±0,8, zone
intermédiaire = 3,6±1,1et la zone profonde = 4,9±1,8, p<0,001). Sur la base des données
spectrales Raman, il a été possible de suivre en temps réel les mécanismes sous-jacents au
développement de tissus cartilagineux par ingénierie tissulaire, notamment la dédifférenciation
des chondrocytes et les cellules souches mésenchymateuses (CSM) différenciées en
chondrocytes. Les résultats ont été comparés à des tests immunohistologiques et de réaction en
chaine polymérase (RT-PCR). En comparant le cartilage dégradé versus le cartilage normal, il
a été possible de caractériser les modifications subtiles de la structure moléculaire du tissu
cartilagineux précédant les modifications morphologiques de la matrice dans l’arthrose. Ces
résultats montrent à la fois la capacité et la sensibilité de la microscopie confocale Raman a
caractérisé la structure du cartilage articulaire et fournit des informations précieuses pouvant
servir de base dans la conception de tissus cartilagineux par ingénierie tissulaire et un outil
diagnostic pour détecter de façon précoce les modifications subcellulaires liées à l’arthrose.
Mots clés : Cartilage articulaire, ingénierie tissulaire, microscopie confocale Raman
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ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
ABSTRACT
Articular cartilage is connective tissue, non-innervated and non-vascularized, that
covers the ends of the bones within the joints. The high stresses to which the cartilage is
subjected often lead to the alteration of the articular matrix. Defects in articular cartilage are
generally associated with pain and loss of joint mobility, and have an impact on quality of life,
including physical, social and economic well-being. Due to the lack of spontaneous
regeneration or healing of cartilage, the use of tissue engineering techniques appears to be a
promising avenue to address the clinical needs of patients with osteoarthritis and
temporomandibular joint disorders (TMD). To optimize cartilage tissue engineering, non-
invasive, non-destructive, high-resolution (nanometric) techniques are needed to evaluate the
quality and structural arrangement of cartilage manufactured in vitro. The objective of our study
was to follow the maturation of artificial cartilage under mechanical loads with innovative
microscopy methods, including confocal Raman microscopy, a non-contact, non-destructive
analysis technique without any sample preparation. Using Raman spectra and hyperspectral
images, we have been able to characterize the morphological differences of the chondrons
according to the different zones of the cartilage matrix and to establish a representative mapping
of the spatial distribution of the biochemical components of the said matrix over its entire depth.
Calculation of the thickness of the pericellular matrix revealed increasing depth-dependent
variations (superficial zone is = 2.7±0.8, intermediate zone = 3.6±1.1 and deep zone = 4.9±1.8,
p<0.001). On the basis of Raman spectral data, it was possible to follow in real time the
mechanisms underlying the development of cartilage tissue by tissue engineering, in particular
the dedifferentiation of chondrocytes and mesenchymal stem cells (MSCs) differentiated into
chondrocytes. The results were compared to immunohistological and polymerase chain reaction
(RT-qPCR) assays. By comparing degraded cartilage versus normal cartilage, it was possible
to characterize the subtle changes in the molecular structure of cartilage tissue preceding the
morphological changes of the matrix in osteoarthritis. These results show both the ability and
sensitivity of confocal Raman microscopy to characterize the structure of articular cartilage and
provide valuable information that can be used as a basis for tissue-engineered cartilage tissue
design and a diagnostic tool for early detection of subcellular changes related to osteoarthritis.
Keywords : Articular cartilage, tissue engineering, Raman confocal microscopy
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ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
TABLE DES MATIERES
RESUME .................................................................................................................................... 4
ABSTRACT ............................................................................................................................... 5
DEDICACES ET REMERCIEMENTS ..................................................................................... 8
LISTES DES ABREVIATIONS .............................................................................................. 11
INTRODUCTION GENERALE .............................................................................................. 12
1 LE CADRE THEORIQUE ET PROBLEMATIQUE ....................................................... 17
1.1 Cadre théorique .......................................................................................................... 17
1.1.1 Le Cartilage articulaire et sa constitution ........................................................... 17
1.1.2 La substance fondamentale du cartilage articulaire ........................................... 21
1.1.3 Organisation zonale ............................................................................................ 33
1.1.4 Développement du cartilage ............................................................................... 36
1.1.5 Physiopathologie et épidémiologie du cartilage arthrosique .............................. 38
1.1.6 Stratégies thérapeutiques des lésions cartilagineuses ......................................... 42
1.2 Les techniques d’évaluation du cartilage articulaire et des constructions de génie
tissulaire ................................................................................................................................ 54
1.2.1 Les moyens classiques ....................................................................................... 54
1.2.2 Microscopie confocale Raman ........................................................................... 58
1.2.3 Impacts sur la sphère oro-faciale ........................................................................ 67
1.3 Problématique ............................................................................................................ 73
2 METHODES EXPERIMENTALES ................................................................................ 75
2.1 Source des échantillons ............................................................................................. 76
2.2 Préparation des échantillons pour les mesures microscopiques ................................ 77
2.2.1 Méthode de fixation et congélation des échantillons ......................................... 77
2.2.2 Méthode de fixation des échantillons sur la lame CaF2 ..................................... 79
2.3 Microscopie multiphotonique (MMP) ....................................................................... 79
2.4 Microscopie à force atomique (AFM) ....................................................................... 81
2.5 Microscope confocal Raman ..................................................................................... 83
2.5.1 Méthodes d’analyse des échantillons ................................................................. 85
2.5.2 Analyse du signal Raman ................................................................................... 85
2.5.3 Traitements des données spectrales .................................................................... 86
2.5.4 Prétraitement des données spectrales ................................................................. 87
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ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
2.5.5 Analyse des données .......................................................................................... 92
2.5.6 Analyses multivariées ........................................................................................ 92
3 RESULTATS ET DISCUSSIONS ................................................................................... 97
3.1 Caractérisation de la matrice du cartilage articulaire : Cartographie des principaux
marqueurs de la matrice du cartilage articulaire à partir de la Microscopie Confocale Raman
98
3.1.1 Introduction ........................................................................................................ 99
3.1.2 Matériel et méthodes ........................................................................................ 100
3.1.3 Résultats et Discussion ..................................................................................... 105
3.1.4 Conclusion partielle 1 ....................................................................................... 123
3.2 Caractérisation des mécanismes sous-jacents au développement de tissus cartilagineux
par ingénierie tissulaire : dédifférenciation des chondrocytes et différenciation des cellules
souches mésenchymateuses humaines (hCSMs) en chondrocytes ..................................... 124
3.2.1 Introduction ...................................................................................................... 125
3.2.2 Matériels et Méthodes ...................................................................................... 126
3.2.3 Analyses statistiques ........................................................................................ 129
3.2.4 Résultats ........................................................................................................... 129
3.2.5 Discussion ........................................................................................................ 137
3.2.6 Conclusion partielle 2 ....................................................................................... 145
3.3 Caractérisation de cartilage articulaire arthrosique humain .................................... 146
3.3.1 Introduction ...................................................................................................... 147
3.3.2 Matériel et méthodes ........................................................................................ 148
3.3.3 Analyse statistique ............................................................................................ 151
3.3.4 Résultats et Discussion ..................................................................................... 151
3.3.5 Conclusion partielle 3 ....................................................................................... 158
4 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ...................................................... 159
5 REFERENCES ............................................................................................................... 163
6 LISTES DES FIGURES ET TABLEAUX ..................................................................... 187
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ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
DEDICACES ET REMERCIEMENTS
JE DEDIE CE TRAVAIL,
AU DIEU TOUT-PUISSANT
Pour la force qu’Il m’a accordé pour tenir jusqu’au bout de cette thèse malgré les nombreux
obstacles. Qu’à travers ce travail, oh mon JESUS, ton Précieux NOM soit magnifié et glorifié.
Merci mon JESUS pour ta grâce dans ma vie.
A MA PETITE FAMILLE,
Mon Epouse KOFFI ADJOUA MARIE MICHELE et à nos merveilleux enfants QETOURA
AHONON MARIE PENIELLE BERAKA et son petit frère MIELISSAGNON CHRIST
MAEL EVAN, je tiens à vous traduire toute mon affection. Vous avez porté le poids de
l’éloignement et vous avez tenu jusqu’au bout, malgré les pleurs à chaque fois que je devais
prendre un vol… vous m’avez toujours accompagné de vos prières. Nous y sommes arrivés par
la grâce de DIEU. Ce travail est le VOTRE ! Trouvez ici, mes chers ADORES, l’expression de
tout mon AMOUR.
A mon Père N’DRE KOUADIO PAUL, qui très tôt m’a encouragé à aller le plus loin possible
dans les études. Tout ce temps, tu m’as soutenu à tous les niveaux. Aujourd’hui où je couronne
mes formations avec une thèse d’université, je voudrais tout simplement te dédié le fruit de ce
travail. Que le Tout-puissant te garde le plus longtemps possible pour profiter de l’ombre de
l’arbre que tu as planté.
IN MEMORIUM
A ma DEFUNTE MERE, KOFFI AHONON Brigitte, Oh combien nous étions proches !
Voilà deux soutenances de thèse que je réalise dans ma vie de l’élève que tu aimais
accompagner à l’école. Tout ceci se passe sans voir et toucher ton bébé. Je sais que Tu es
toujours auprès de moi et Tu aurais sans doute voulu embrasser ton enfant, mais la Vie te
maintient de l’autre côté de la rive. Je te dédie tout ce travail et demande au Bon DIEU te
prendre dans sa plénitude pour contempler avec LUI la grâce dont IL me comble. Reposes en
Paix Très chère MERE
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ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Au Professeure TRE YAVO Mireille,
Oh d’où nous sort cette pandémie à corona virus ? Lors de notre première rencontre où j’ai
profité pour vous suggérer de m’accompagner dans mon aventure, vous avez aussitôt dit oui
sans tenir compte de vos diverses occupations à la Fac de Médecine en tant Directrice du
Département d’Histologie et d’embryologie, entre autres. Voilà qu’au moment où nous
échangeons à propos de la tenue de cette soutenance, que ce virus nommé covid-19 est venu
vous terrasser. Vous êtes partie sans avoir sûrement eu le temps d’ouvrir le dernier mail que je
vous avais envoyé. Nous voilà au terme de ce travail ! Que le Bon DIEU vous accepte auprès
de LUI pour vous reposer de tout le travail que vous avez abattu durant votre passage sur terre.
MES REMERCIEMENTS
Au Professeur CUISINIER, Directeur de thèse, qui les moments les plus difficiles m’a
accueilli dans son laboratoire pour réaliser mon stage de Master 2. Tout le temps de cette thèse,
au-delà de la connaissance scientifique que vous inspirez et vous transmettez à tous ceux qui
vous fréquentent, vous m’avez enseigné une vertu capitale de la Vie : L’HUMILITE ! Vous
m’avez fait confiance en me confiant ce travail qui m’a permis de sortir de mon champ et de
m’ouvrir à d’autres connaissances. Vous avez été très attentif à tous mes besoins et vous avez
toujours réagi positivement. Cette aventure au LBN, à vos côtés, m’a enseigné la VIE. Vous
êtes un Grand Homme. Par ces petits écrits, je vous exprime toute ma reconnaissance et ma
gratitude.
Au Professeure KOFFI-GNAGNE Yolande, Co-directrice, chère Professeure, nous y voilà !
Un parcours parsemé d’obstacles certes, mais le Tout-puissant nous a toujours donné les forces
nécessaires pour surmonter tout ce qui se présentait à nous. Alliés sur le plan ethnique, vous
n’avez manqué aucune occasion pour me manifester votre soutien face à certaines difficultés
qui se dressaient sur mon chemin. Sachez chère Maitre que je vous serai toujours reconnaissant
pour tout le soutien à m’apporter. Que le DIEU TOUT-PUISSANT a qui vous êtes attaché,
vous comble de ses bénédictions. Merci beaucoup pour votre soutien indéfectif et
inconditionnel. Veuillez trouver ici l’expression de toute ma reconnaissance et ma gratitude.
DIEU VOUS COMBLE !
A Hamideh SALEHI, mon encadrante ! Hami, oh combien tu as été spéciale tout le temps de
la thèse ! Grande motivatrice, toujours rassurante, disponible et très maternelle parfois. Tu m’as
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ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
permis de me familiariser au Raman et de tirer profit. Un nouveau et vaste domaine qui m’a
ouvert sur d’autres connaissances. Nous avons passé de bons moments en compagnie de cet
outil Raman dans l’anti-chambre du LBN. Une pièce, quand on y est, on semble parfois coupé
de tout et on passe inaperçu au LBN. Mais, il nous a appris de nouvelles choses et des choses
intéressantes. Merci beaucoup pour ton coaching, pour ta gentillesse et cet amour de la science.
Danièle NOEL et Marie MAMMUS (Equipe IRMB)
Ce travail que nous pouvons présenter aujourd’hui est le fruit de votre collaboration et votre
grande disponibilité. Vous avez toujours répondu positivement et avec promptitude à nos
sollicitations. Je tiens à vous remercier de tout mon cœur pour tout le soutien que vous m’avez
apporté pour que cette thèse aille jusqu’à son terme.
A tous les membres du LBN,
Ne pouvant remercier individuellement tous ceux qui m’ont entouré de leur affection au cours
de cette thèse, je tiens par ces quelques lignes, vous traduire mes remerciements et toute ma
gratitude. Contrairement aux idées reçues, une thèse n'est pas le résultat d'un travail purement
personnel. Au-delà d'être une expérience scientifique incroyable, c'est également une aventure
humaine inoubliable qui m'a permis de rencontrer et côtoyer des personnes extraordinaires, qui
ont contribué, de près ou de loin, à l'aboutissement de ce travail. C'est donc naturellement et en
toute sincérité que je remercie l'ensemble des équipes du LBN, et plus particulièrement Ivan
avec qui j’ai beaucoup travaillé sur d’autres thématiques. Je n’oublie pas ces petites histoires
drôles que tu aimes raconter et qui permettaient d’évacuer les stress à travers les rigolades. A
tous, merci pour ces bons moments partagés au cours de cette aventure scientifique.
Cette thèse est le fruit d'une collaboration entre deux laboratoires : le Laboratoire Bioingénierie
et Nanosciences et l’Institut de Médecine Régénératrice et Biothérapies (IRMB), notamment
l’équipe Danièle, principalement. Cependant, ce travail nous a ouvert à d’autres collaborations.
A ce titre, je voudrais exprimer ici toute ma reconnaissance et ma gratitude à tous les membres
du Laboratoire Charles Colomb (LCC), particulièrement au Professeur Csilla, aux Docteurs
Thiery et Béla qui m’ont apporté leurs expertises dans la réalisation de certaines
expérimentations, et l’Institut de Neuroscience de Montpellier (INM), notamment Chantal
RIPOLL qui a été toujours présente toutes les fois que nous l’avons sollicité. A tous et
individuellement, je tiens à vous dire GRAND MERCI pour votre soutien et votre apport
considérable.
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ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
LISTES DES ABREVIATIONS
ACP
Analyse des composantes principales
AFM
Microscope force atomique
ATM
Articulation temporo-mandibulaire
CMC
Carboxyméthylcellulose
CSMs
Cellules souches mésenchymateuses
DPSCs
Cellules souches de la pulpe dentaire
FTIR
Spectroscopie Infrarouge à transformée de Fourier
GAG
Glycosaminoglycanes
ICA
Implantation de chondrocytes autologues
IFOP
FTIR couplée à une sonde optique infrarouge
INM
Institut de Neurosciences Montpellier
IRMB
Institut de Médecine régénérative et biothérapies
IRM
Imagerie par Résonance magnétique
LBN
Laboratoire Bioingénierie et Nanosciences
LCC
Laboratoire Charles Coulomb
MC
Matrice cartilagineuse
ME
Microscopie électronique
MEC
Matrice extracellulaire
MCR
Microscopie Confocale Raman
OCT
Tomographie par cohérence optique
PBS
Solution saline tamponnée au phosphate
PGs
Protéoglycanes
UFR
Unité de formation de recherche
12
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
INTRODUCTION GENERALE
Le cartilage articulaire est un tissu conjonctif unique qui, tout comme l’os, est présent
dans de nombreux sites du corps des vertébrés, notamment au niveau des articulations où il
fournit une interface sans frottement entre les os et dissipe ainsi les charges lors de la
locomotion. La capacité du cartilage à remplir ses diverses fonctions est directement liée à son
organisation zonale complexe en fonction de la profondeur. La plupart des études sur la
morphologie et la biologie du cartilage articulaire décrivent une structure élaborée et hautement
ordonnée, constituée principalement de trois zones : superficielle, moyenne et profonde, selon
la forme différente des cellules, la composition biochimique de la matrice extracellulaire (MEC)
et l’orientation des fibrilles de collagène 1–4. L’organisation structurelle et la distribution
spatiale des principaux composants sur toute la profondeur du tissu lui confèrent ses propriétés
biomécaniques et l’amortissement des chocs.
La perturbation de cet équilibre est le début de l’initiation et de la progression des
maladies dégénératives, telles que l’arthrose, un trouble impliquant des articulations mobiles,
caractérisé par un stress adhésif et la dégradation de la matrice extracellulaire, résultant de
macro, et de microdommages qui activent des réponses restauratrices adaptatives anormales, y
compris les voies pro-inflammatoires du système immunitaire 5. En raison de sa particularité à
ne pas être innervé, ni vascularisé, le cartilage se régénère peu et cicatrice difficilement de façon
spontanée, notamment à l’âge adulte. Les lésions du cartilage sont irréversibles et peuvent
causer des dommages irréparables, pouvant aboutir à l’arthrose, une maladie débilitante
associée à une perte de la fonctionnalité de l’articulation. Toutes les stratégies d’ingénierie
tissulaire du cartilage consistent à régénérer un tissu de remplacement du cartilage qui soit
mécaniquement fonctionnel et réparer cliniquement les défauts de cartilage articulaire dans le
cas d’arthrose. Le défi majeur actuel consiste à développer des substituts biologiques qui soient
la réplique fidèle du tissu natif de sorte à faciliter l’intégration et les fonctions mécaniques de
celui-ci une fois implanté dans l’environnement natif.
Avec les dernières avancées de la recherche, il est connu aujourd’hui que les cellules
ont la capacité de se réorganiser en structures complexes spécifiques aux tissus, avec un
minimum de facteurs de croissance inductifs 6. Cependant, le manque d’organisation structurée
et de taille du tissu raisonnable constitue un obstacle majeur à la réalisation d’une fonctionnalité
véritablement in vivo. La capacité de caractériser fidèlement l'organisation biochimique et la
distribution de la MEC cartilagineux est essentielle pour non seulement comprendre les
processus physiopathologiques sous-jacents de l’initiation et de la progression des maladies
13
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
dégénératives, notamment l'arthrose, et développer ainsi de nouvelles stratégies de réparation
du cartilage pour traiter la dégénérescence et restaurer la fonctionnalité des articulations.
A ce jour, deux sources de cellules progénitrices sont exploitées pour la réparation des
lésions cartilagineuses pour des applications cliniques : les chondrocytes et les cellules souches
mésenchymateuses. Le principe consiste à encapsuler des cellules chondrogéniques dans un
échafaudage polymère in vitro et supplémentés avec des facteurs de croissance pour induire la
formation de la MEC cartilagineux. Le cartilage artificiel est réimplanté dans le défaut
cartilagineux généralement situé dans l'espace intra-articulaire, dans lequel des indices
chondro-inducteurs en termes de cytokines et de stimulations mécaniques existent pour
favoriser la chondrogenèse spontanée des cellules implantées et maintenir leur phénotype et
leur fonction chondrogéniques. Les chondrocytes et les cellules souches mésenchymateuses
humaines. La qualité de la matrice est appréciée sur la base de la présence des principaux
composants de la matrice : les glycosaminoglycanes (GAGs, en particulier l’aggrécane) et le
collagène, notamment le collagène de type II.
Histologiquement, les techniques de caractérisation du GAG et du collagène se limitent
souvent à des dosages biochimiques et une coloration des tissus. Bien que ces techniques soient
capables d’apprécier ou quantifier la distribution de collagènes et de glycosaminoglycanes
spécifiques, ces méthodes restent de nature qualitative ou semi-quantitative, nécessitant un
étiquetage et se prêtant difficilement à des analyses approfondies précises de la distribution des
composants de la MEC 7,8.
Ces dernières années, de nombreuses autres méthodes d'imagerie non-invasive,
notamment la microscopie confocale par fluorescence, la microscopie à lumière polarisée
(PLM), la tomographie par cohérence optique (OCT), la génération du second harmonique
(SHG), la spectroscopie infrarouge à transformer de Fourier (FT-IR) ont été développées pour
des applications plus directes dans le diagnostic de l’arthrose 9–13. Par exemple, le microscope
confocale par fluorescence permet de suivre certaines molécules. L’un des inconvenients de
cette technique reside dans l’utilisation de marqueurs fluorescents qui peuvent modifier le
mécanisme des activités liées aux composés chimiques à cause de la taille des fluorophores qui
sont souvent de plus grande que les molécules étudiées. Une autre difficulté, c’est l’existence
de photo-blanchiment. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR) est une
technique d'imagerie chimique utilisant un rayonnement infrarouge transmis ou diffusé pour
obtenir des images. Ce rayonnement provient des états de vibration des molécules. La difficulté
avec cette technique est sa résolution spatiale de longueur d'onde infrarouge (10-20 μm) qui
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ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
semble élever pour observer des structures subcellulaires. De plus, l'eau parait opaque dans
l'infrarouge, de sorte que les molécules biologiques sont impossibles à étudier. Or, une
sensibilité moléculaire élevée est une condition indispensable pour améliorer non seulement le
diagnostic de l'arthrose, mais également pour permettre une meilleure compréhension des
changements biochimiques au cours du développement et de la progression de l'arthrose pour
une meilleure prise en charge.
La spectroscopie Raman est une technique d'imagerie non-invasive et sans étiquette qui
offre un potentiel unique pour quantifier la distribution des produits de la MEC dans les tissus
cartilagineux. Cette technique spectroscopique fournit une «empreinte» spectroscopique
représentant l'ensemble de la composition moléculaire des échantillons d'intérêt 14, sur la base
de la diffusion inélastique de la lumière (ou effet Raman). De plus, sa haute résolution permet
non seulement d’observer la morphologie des cellules et des tissus, mais d’extraire une richesse
d’informations biomoléculaires (c’est à dire une conformation biochimique spécifique des
protéines, des glucides, des lipides, des acides nucléiques, etc..) dans des cellules et des tissus
utilisant des biomolécules endogènes comme contraste et avec une résolution spatiale
submicrométrique. De plus, comme la diffusion Raman peut être décrite par un tenseur de
polarisabilité, contrôler la polarisation de l’incident et la lumière détectée permet d’extraire des
informations structurelles 15.
Le plus intéressant, chaque spectre unique comporte une quantité d'information se
rapportant à l'endroit où le spectre est enregistré. L'intensité et le profil des pics Raman
fournissent des indications sur les quantités relatives d'espèces chimiques présentes dans
l'échantillon, ainsi que sur leurs environnements de liaison 16. De ce fait, les mesures de
spectroscopie Raman peuvent être capables de fournir une mesure de la concentration relative
de constituants moléculaires dans une région tissulaire localisée. En raison de sa compatibilité
avec l’eau, la spectroscopique Raman autorise l’analyse des échantillons de tissus non fixés et
hydratés, permettant ainsi l'élimination des techniques laborieuses de préparation d'échantillons
et d'éviter les artefacts de fixation chimiques. De plus, cette technique spectroscopique Raman
offre l’avantage de réaliser des images rapides, sans artefact et à haute résolution de la matrice
et d’en extraire une foule d’informations sur l’organisation structurelle et la distribution des
GAGs et du collagène. L’une des complexités de cette technique réside dans l’analyse et
l’interprétation des signaux qui se chevauchent dans le spectre Raman du cartilage. Dans le
cartilage, la MEC est fortement dominé par les signaux de collagène alors que les GAG sont
enfouis et difficiles à résoudre. A cet effet, diverses techniques d’analyses uni ou multivariées
15
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
ont été associées à la spectroscopie Raman pour mettre en évidence les principaux
biomarqueurs du cartilage. Les nombreuses études qui ont été réalisées jusque-là, aucune n’a
fourni une cartographie de l’organisation structurelle et de la distribution des composants
principaux de la matrice cartilagineuse, à part quelques informations en vrac sur pour établir un
diagnostic précoce de l’arthrose ou sur quelques changements biochimiques.
Le but de notre étude était de suivre la maturation du cartilage articulaire produit par
ingénierie tissulaire. De toute évidence, il est difficile voire impossible de savoir si nous avons
produit un cartilage si nous ne savons pas de quoi le cartilage est fait. Notre démarche
scientifique a consisté à caractériser la matrice du cartilage articulaire, en évaluant
l’organisation structurelle et la concentration des biomolécules et en identifiant les principaux
biomarqueurs et leur distribution spatiale sur toute la profondeur tissu. Secondairement, nous
nous sommes intéressés à l’évaluation de la maturation du cartilage produit par ingénierie
tissulaire. Ainsi, la production de collagène de type II et de GAG a été quantifier dans des
constructions de cartilage par ingénierie à partir d’échafaudage et, à l’inverse les phénomènes
de dédifférenciation des chondrocytes ont été appréciés. Ces derniers résultats ont été comparés
à des analyses de quantification de l’expression des gènes des composants principaux du
cartilage grâce à des tests de réaction en chaine polymérase et immunohistochimiques réalisés.
En sommes, les travaux décrits dans cette thèse se sont concentrés sur l'utilisation de la
microscopie confocale Raman pour étudier la microstructure du cartilage articulaire et la
caractérisation de ses principaux composants moléculaires sur des explants de cartilage
articulaire natif humain et des constructions de tissu cartilagineux par ingénierie tissulaire. La
première partie de ce travail est consacrée au cadre théorique et problématique du notre sujet
qui passe en revue certaines notions fondamentales. Cette partie est consacrée à une revue de
la littérature qui présente une description anatomique et physiopathologique du cartilage
articulaire, les différentes stratégies thérapeutiques engagées jusqu’à ce jour. Faut-il le préciser,
il existe trois types de cartilage (hyalin, élastique et fibrocartilage). Une description brève du
cartilage élastique et fibrocartilagineux a été cependant faite, pour marquer la différence entre
ces trois types de cartilage. Au-delà, tout le travail, a concerné essentiellement le cartilage
articulaire hyalin. Pour répondre à notre objectif, le choix des moyens efficaces et pertinents
d’évaluation semble essentiel pour l’évaluation du cartilage articulaire et les constructions de
tissu cartilagineux par ingénierie tissulaire. A ce titre, en rappelant les moyens actuels,
différents moyens d’investigation du cartilage articulaire et des constructions de matrices
cartilagineuses sont décrits, avec un point d’honneur sur les techniques de microscopie
16
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
innovante, telles que la microscopie confocale Raman, les microscopies multiphotonique
(MMP) et à force atomique (AFM) pour leur caractère non-invasif et non destructif, ne
nécessitant pas de marquage spécifique des tissus étudiés et capable de déterminer à la fois la
composition chimique, les interactions moléculaires et les propriétés biomécaniques sur des
échantillons micrométriques à haute résolution.
La seconde partie de notre étude concerne les méthodes expérimentales. Elle vise à
décrire notre protocole d’étude et les moyens d’analyse associés. Dans cette partie, nous
présentons les types et le traitement des échantillons utilisés et le système d’acquisition et de
traitement des données spectrales. A ce stade, il faut préciser que les spectres Raman
contiennent diverses bandes Raman qui se chevauchent. De sorte qu’il est difficile d’inspecter
et d’interpréter visuellement les données spectrales. En effet, la microscopie Raman fournit des
informations spécifiques sur les vibrations moléculaires au sein des groupes fonctionnels, ce
qui entraîne des absorptions des bandes caractéristiques dans les spectres qui sont corrélées à
la composition. Par conséquence, des méthodes d’analyses chimiométriques, telles que
l’analyse de la composante principale (ACP), l’analyse discriminante linéaire (en abrégée LDA
en anglais), l’analyse des grappes ou k-means clustering analysis en anglais (KMCA) et la
dérivée seconde, ont été décrites et utilisées pour traiter les spectres Raman et faciliter ainsi
l’interprétation des données à la lumière des données spectroscopiques référencées,
biologiques, anatomiques et physiopathologiques du cartilage articulaire.
La troisième partie rapporte les résultats de nos différentes expérimentations discutées
à la lumière de la littérature. Les résultats sont présentés sous forme d’article de revue en cours
de soumission et sont axés sur : (1) l’évaluation des mécanismes sous-jacents au développement
de tissus cartilagineux par ingénierie tissulaire, notamment sur les processus de
dédifférenciation des chondrocytes et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses
humaines (hCSM), (2) caractérisation de la matrice du cartilage articulaire et la cartographie
des principaux marqueurs de la matrice cartilagineuse à partir de la Microscopie Confocale
Raman et enfin (3) la différenciation entre le cartilage dégradé versus le cartilage non dégradé
(normal).
Ces trois parties de notre étude sont en adéquation et démontrent le potentiel de la
microscopie confocale Raman en tant technique à haute résolution et non invasive pour sonder
et discriminer les caractéristiques biochimiques entre différentes types cellulaires, suivre la
maturation du cartilage artificiel et identifier de subtiles différences au sein de la matrice du
cartilage, essentielles à la compréhension de la pathophysiologie du tissu.
17
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1 LE CADRE THEORIQUE ET PROBLEMATIQUE
1.1 Cadre théorique
1.1.1 Le Cartilage articulaire et sa constitution
Le cartilage est un tissu conjonctif tout comme l’os, présent dans de nombreux sites du
corps des vertébrés, y compris les articulations articulaires entre les os, la cage thoracique,
l'oreille, le nez, les bronches et les disques intervertébraux (Figure.1).
Le cartilage articulaire est un tissu hautement spécialisé dont la fonction principale est
de fournir une interface sans frottement entre les os et de dissiper la charge lors de la
locomotion. En général, les cartilages du corps peuvent être classés en trois types différents en
Figure 1 : Différentes localisations du cartilage dans le corps humain (source : Cartilage
and Bones September 27, 2011 https://antranik.org/cartilage-and-bones/)
18
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
fonction des propriétés biochimiques : cartilage élastique, fibreux et hyalin. Bien que tous ces
cartilages partagent des caractéristiques générales, ils diffèrent par l'histomorphologie, la
composition biochimique et les propriétés biomécaniques. Cependant, il existe une relation
intrinsèque et forte entre les différentes fonctions que ces cartilages remplissent dans le corps
et les caractéristiques des tissus. Parlant de cartilage articulaire, sa fonction de tissu porteur et
dissipateur de stress a un effet direct sur sa composition biochimique, sa structure et son
comportement biomécanique, comme en témoignent ses propriétés de traction, de cisaillement
et de compression.
1.1.1.1 Le cartilage élastique
Le cartilage élastique se distingue des autres types de cartilage par une matrice contenant
de grandes quantités d'élastine tissées dans un maillage de collagène 17,18, qui existe sous forme
de fibre hautement ramifiée, lui permettant ainsi de conserver la forme de la structure qu'il
compose tout en lui assurant une grande flexibilité, comme c'est le cas pour le pavillon de
l'oreille externe, le larynx et l'épiglotte. Le cartilage élastique tire son nom de la grande
flexibilité présente dans le tissu en raison de la teneur en élastine, mais se développe chez le
fœtus à partir d'un précurseur de cartilage hyalin 19. Les fibres d'élastine peuvent souvent avoir
des concentrations suffisamment élevées pour non seulement conférer une couleur jaunâtre au
cartilage élastique, mais également empêcher la coloration d'autres composants de la matrice
du cartilage élastique (par exemple, le collagène de type II et les glycosaminoglycanes (GAG)).
Les chondrocytes du cartilage élastique sont plus nombreux que dans les autres cartilages et
sont orientés entre les fibres d'élastine. Une des particularités du cartilage élastique est qu’il est
recouvert de périchondre, contrairement aux autres types de cartilages.
Figure 2 : Cartilage élastique
Chondrocyte
dans leur
lacune
Fibres
élastiques de la
MEC
19
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CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1.1.1.2 Le fibrocartilage
Le fibrocartilage diffère du cartilage hyalin par la présence de grosses fibres de
collagène de type I disposées plus ou moins parallèlement dans le sens des contraintes qu'elles
subissent et, dans une moindre mesure, de collagène de type II. Ces faisceaux de collagène
confèrent une grande capacité à ce type de cartilage pour résister à des contraintes de traction
élevées. La teneur en GAG du fibrocartilage est souvent très inférieure à celle du cartilage
hyalin. Les chondrocytes du fibrocartilage (fibrochondrocytes) sont dispersés parmi les
faisceaux de tissu conjonctif; ce sont ces faisceaux qui aident à absorber les charges
mécaniques. Le fibrocartilage se trouve dans le corps au niveau de la symphyse pubienne, de
l'anneau fibreux du disque intervertébral, du ménisque du genou 20 et du disque de l'articulation
temporo-mandibulaire 21. Contrairement au cartilage élastique et hyalin, le fibrocartilage
manque généralement d'une couverture du périchondre. Dans les stratégies d’ingénierie
tissulaire, le fibrocartilage peut constituer un tissu de réparation du cartilage articulaire
endommagé bien qu'il ne possède pas les propriétés biomécaniques adéquates pour fonctionner
en tant que remplacement du cartilage articulaire à long terme. Cette structure qui se rapproche
de celle du tissu conjonctif dense orienté, lui permet de résister à des forces de traction et de
compression.
Figure 3 : Fibrocartilage
Chondrocyte
dans leur lacune
Fibres de
collagène dans
la MEC
20
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1.1.1.3 Le cartilage hyalin
Le cartilage hyalin est le plus représenté dans le corps humain et le mieux caractérisé
des différents types de cartilage. Il est plus localisé au niveau des articulations, de la trachée et
de la cage thoracique, essentiel pour la respiration, l'ouïe et la locomotion. Sur le plan
macroscopique, le cartilage articulaire hyalin apparaît, à l’ouverture d’une articulation, blanc
nacré brillant ou légèrement blanc translucide, lisse à l’œil nu, ferme mais légèrement
dépressible à la palpation (Figure 4). Avec l’âge, il varie d'un blanc bleuâtre à un tissu
légèrement jaunâtre-blanc cassé. A la périphérie de l’articulation, il se poursuit par une zone de
transition avec la couche fibreuse de la capsule synoviale et avec le périoste épiphysaire. Son
épaisseur est variable selon l’articulation ; elle est plus importante aux articulations des
membres inférieurs, plus chargées. Elle est maximale sur la rotule où il atteint jusqu’à 7
millimètre (mm). Dans une articulation donnée, l’épaisseur du cartilage est maximale dans les
zones supportant le maximum de charges. Les cartilages articulaires sont un peu plus épais chez
l’homme que chez la femme, ils ne s’amincissent pas avec l’âge.
La surface du cartilage articulaire joue un rôle important dans la physiologie de ce tissu
puisque c’est elle qui reçoit en premier les pressions, c’est elle qui est soumise aux forces de
cisaillement. Elle est le filtre sélectif à travers lequel passe les substances nutritives venant du
liquide synovial, seule source d’alimentation des chondrocytes, dans des conditions
Figure 4 : (A) Image macroscopique du cartilage articulaire des condyles fémoraux bovins
juvéniles, démontrant la nature scintillante du cartilage hyalin. (Kyriacos AA et coll, 2016),
(B) Image microscopique du cartilage montrant les chondrocytes dans leurs logettes
A
B
21
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CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
physiologiques. Elle joue enfin un rôle majeur, avec le fin film du liquide synovial qui la
recouvre, dans la lubrification de l’articulation. C’est à son niveau qu’apparaissent les premiers
signes histologiques de la désorganisation structurale de l’arthrose. Sur le plan microscopique,
le cartilage hyalin est décrit comme un tissu homogène sans vaisseau et sans nerf, dans lequel
sont dispersées des cellules (chondrocytes) enchâssées dans des logettes (les chondroplastes),
avec une orientation particulière à mesure qu’on s’éloigne de la surface articulaire.
A l’opposé de la surface, le cartilage est intimement en contact avec l’os sous-chondral
dont on distingue bien la structure. Ces cellules vivent en milieu anaérobie et ne que
représentent environ 2-10% du volume total du cartilage 22, seules responsables de la synthèse
et du renouvellement de la matrice cartilagineuse.
Le cartilage articulaire hyalin est composé de protéines et de macromolécules
spécialisées qui permettent au tissu de fonctionner dans les environnements biomécaniques
rigoureux des articulations articulaires, comme le genou, la hanche et l'épaule. Les principales
caractéristiques biochimiques comprennent la présence prédominante de collagène de type II et
de grandes quantités de protéoglycanes 23. Les collagènes et les protéoglycanes interagissent
avec un environnement fluide chargé pour donner au cartilage articulaire son caractère
biomécanique unique.
1.1.2 La substance fondamentale du cartilage articulaire
La matrice du cartilage est constituée d’une matrice extracellulaire composée en
majorité de collagène (principalement le type II) qui confère au tissu sa forme et sa résistance
et des protéoglycanes (dont le principal est l’aggrécane), assurant une résistance aux contraintes
mécaniques 24. Au voisinage des cellules individuelles, la MEC est organisée en zone
immédiatement péricellulaire et en une matrice interterritoriale entre les cellules.
1.1.2.1 La matrice extracellulaire et sa composition
La matrice extracellulaire est une substance qui existe chez tous les animaux
pluricellulaires dans les espaces extracellulaires. Elle constitue la principale composante des
tissus conjonctifs. Dans le cartilage articulaire, la MEC est subdivisée en deux
compartiments matriciels : matrice territoriale (MT), formant la majeure partie de la MEC et la
matrice interterritoriale (MIT) entre les cellules. La MEC est composée en majorité de collagène
(50-60% du poids sec), de protéoglycanes (15-30% du poids sec) et d’eau (H2O) 25.
22
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Tableau I : Composition fractionnelle approximative du cartilage hyalin 26
Composants
Fraction (%)
Eau
Collagène de type II
Protéoglycanes
Autres collagènes spécifiques du cartilage (IX, X, XI)
Autres protéines
Sels inorganiques
80
10
8
<1
<1
<1
La majeure partie du collagène est constituée par le collagène de type II (environ 90-
95%), fait de fines fibrilles et, des types mineurs VI, IX et XI (ensemble 5%) dans le cartilage
minéralisé complété par des quantités mineures de collagène de type X, le collagène typique du
cartilage hypertrophique. La nature micro-fibrillaire de la matrice de collagène confère les
propriétés de résistance à la traction et la viscoélasticité de ce tissu. Les protéoglycanes, dont la
plus importante est l’aggrécane sont impliqués dans la liaison des molécules d’eau et
fournissent une résistance à la compression du cartilage et à l’amortissement des chocs. Ils
confèrent également au tissu cartilagineux une turgescence élastique et participent aussi à la
transmission des signaux, à la différenciation et la prolifération cellulaire.
1.1.2.1.1 Le collagène
Le collagène est la protéine structurale par excellence chez les vertébrés. Chez les
mammifères, il s’agit même de la protéine la plus abondante 27,28 puisqu’on la retrouve dans
toutes les matrices extracellulaires. Cette ubiquité du collagène provient de sa capacité à former
divers assemblages hiérarchisés à partir d’une seule et même molécule (tropocollagène). La
superfamille des collagènes est constituée des protéines présentant une séquence peptidique
caractéristique. Ils sont constitués de séquences d'acides aminés répétitives (glycine, proline,
hydroxyproline, etc.) et présentent une structure caractéristique en triple hélice. La superfamille
des collagènes compte près de 23 types de collagène, assemblés à partir de 41 chaînes α
génétiquement distinctes et subdivisée en deux classes :
- Les collagènes fibrillaires (collagène I, II, III, V, XI) qui s’assemblent en fibrilles
puis en fibres,
- Les collagènes des membranes basales, (collagène IV).
23
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Figure 5 : Structure triple hélicoïdale du collagène. (A) Vue de l'axe moléculaire (α-carbones
uniquement), montrant les chemins des chaînes polypeptidiques individuelles et les
emplacements des résidus dans les triplets Gly-X-Y (G = Gly; de (Beck et Brodsky, 1998), avec
permission). (B) Vue de côté (molécule inclinée vers le lecteur en haut; représentation
remplissant l'espace), montrant la torsion hélicoïdale à droite 29
Le collagène de type II est un composant majeur du cartilage assurant l'intégrité
structurelle du tissu. Le procollagène de type II est synthétisé sous deux formes (IIA et IIB)
générées par épissage différentiel de l’exon 2 dans le transcrit du gène primaire. La forme IIA
contient un grand domaine (69 amino-acides) riche en cystéine du propeptide NH2-terminal,
tandis que la forme IIB n'en contient pas. Dans une étude réalisée par Sandell et ses
collaborateurs (1991), ils ont pu montrer que ces deux formes étaient exprimées spatialement
au cours du développement et une distribution distincte au cours de la chondrogenèse avec le
type IIB principalement exprimé par les chondrocytes, tandis que la forme IIA est exprimée
dans les cellules chondroprogénitrices (cellules entourant le cartilage des préchondrocytes) 30.
Il apparait clairement que la localisation cellulaire distincte des deux procollagènes de type II
différents indique qu'ils peuvent jouer des rôles fonctionnels différents dans des tissus distincts.
Dans le cartilage articulaire, 90 à 95% du collagène est de type IIB. Il est considéré,
avec l'aggrécane, comme le principal marqueur du phénotype chondrocytaire et est l'un des
Chaine C
Chaine B
Chaine C
24
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
collagènes fibrillaires 31. Une molécule de collagène de type II est composée de trois chaînes,
α1, associées pour former une triple hélice (Figure 5). Après la synthèse, les molécules de
collagène de type II se rejoignent pour former des fibrilles qui se rejoignent ensuite par des
ponts covalents pour former des fibres de collagène. Ces fibres sont organisées en un réseau
maillé serré qui s'étend à travers le tissu et fournit au cartilage articulaire sa rigidité et sa
résistance à la traction, et contribue également à la cohésion tissulaire en piégeant
mécaniquement les grandes PGs. L'orientation des fibres de collagène varie à travers la
profondeur du cartilage articulaire, la zone superficielle contenant des fibres disposées
tangentiellement, la zone profonde contenant des fibres orientées radialement et la zone
médiane ayant à la fois une structure en arcade et des fibres orientées de façon aléatoire qui
forme la transition entre les autres zones 32 Le collagène de type II interagit avec les
chondrocytes par l'intermédiaire de membres de la famille des intégrines et du récepteur du
collagène non-intégrine, le récepteur du domaine discoïdine-2 (DDR2; un récepteur tyrosine
kinase; examiné par Leitinger et Hohenester (2007) 33. Il est nécessaire à la survie des cellules,
comme le démontre l'utilisation de souris nulles Col2al 34.
Dans le cartilage, il existe également d'autres types de collagène fibrillaire et globulaire,
tels que les types V, VI, IX et XI, dits mineurs, car constituant seulement 10% du tissu de
collagène. Le collagène non fibrillaire de type VI, plus abondamment retrouvé dans la matrice
péricellulaire, présente des concentrations péricellulaires élevées par rapport à la matrice
extracellulaire globale et interagit directement avec le chondrocyte via ses interactions avec un
Figure 6 : Les différents types de collagènes du cartilage
25
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
grand nombre de molécules matricielles. Les molécules de collagène de type IX sont liées par
covalence aux fibres de collagène de type II 35 et connectent le réseau maillé des fibrilles de
collagène aux PGs. Les molécules de collagène de type XI sont localisées au sein des fibres de
collagène de type II et assurent la cohésion des fibres. Ces collagènes dont le rôle est
incomplètement connu, semble cependant capital dans le maintien de la structure entre les PGs
et le collagène de type II, ainsi que dans la limitation de la croissance du collagène de type II.
Ils semblent également jouer un rôle dans le développement fœtal 36,37, leur nombre diminuant
au cours de la vie adulte. Les collagènes de types IX et XI sont présents à la surface des
chondrocytes et lient les cellules à la matrice environnante. Le type IX joue un rôle particulier
dans la régulation du diamètre des fibres de type II et permet probablement la formation des
fines fibres de collagène présentes dans la matrice péricellulaire. Le type X est le plus répandu
dans la plaque de croissance et est nécessaire à l'ossification endochondrale 38. Cependant, on
ne le trouve généralement pas dans le cartilage articulaire normal, sauf dans l'arthrose. A côté
de ceux-ci, on trouve aussi les collagènes de type V, XII et XIV, mais en très faible quantité.
1.1.2.1.2 Les protéoglycanes
Les protéoglycanes sont un sous-groupe de glycoprotéines contenant des chaines
polysaccharidiques spécialisées liées, appelées glycosaminoglycanes (GAG), qui sont de longs
polymères linéaires constitués de répétitions disaccharidiques spécifiques (Lodish B et coll,
2005). Les PG sont des molécules qui consistent en un axe protéique liant une ou plusieurs
chaînes de glycosaminoglycane (GAG) 39. Les chaînes GAG sont de longues chaînes de charges
négatives (groupes carboxylate ou sulfate), qui repoussent les autres charges négatives et
attirent les cations. La plupart de ces chaînes latérales glucidiques sont constituées de
chondroïtine sulfate (CS) et de sulfate de kératane (KS) 40. A l'extrémité N-terminale, il existe
deux domaines globulaires (appelés G1 et G2), le domaine G1 se liant de manière non covalente
à l’hyaluronane (HA). Cette liaison est stabilisée par une protéine compagnon appelée protéine
de liaison protéoglycane, qui contient 345 acides aminés 41. Le sulfate de chondroïtine et le
sulfate de kératane sont les chaînes les plus courantes. Le sulfate de chondroïtine est un
glycosaminoglycane relativement spécifique du cartilage et est composé d'environ 25 à 30
dimères de sucre (N-acétyl-galactosamine et acide glucuronique).
26
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Le sulfate de kératane est un disaccharide récurrent de la N-acétyl-glucosamine et du
galactose, plus petit (5 à 6 dimères) et plus largement distribué dans le corps que le sulfate de
chondroïtine. Par leur capacité à se lier aux facteurs de croissance, ces molécules régulent la
biodisponibilité, la stabilité et l'activité biologique, et jouent des rôles importants en tant que
modulateurs de la prolifération et de l'adhésion cellulaire. Les PG extracellulaires sont
principalement représentées par l'aggrécane 42, qui a un poids moléculaire élevé (entre 1500 et
4000 kDa). Une centaine de molécules d'aggrécane peuvent se lier à un polymère d'acide
hyaluronique, via la protéine de liaison (LP), formant un agrégat moléculaire de masse
moléculaire élevée. Les propriétés biologiques d'Aggrécane reposent en partie sur son caractère
anionique et en partie sur les multiples propriétés interactives de ses différents domaines avec
la matrice extracellulaire (MEC) et les composants de surface de la membrane. Les grands
agrégats confèrent principalement une résistance à la compression en raison de leur nature
hydrophile, car ils attirent une grande quantité d'eau dans l'espace intra et intermoléculaire.
D'autres PGs sont bien caractérisés et comprennent la décorine, la fibromoduline, le syndécane
et le biglycane 43. Leurs rôles sont liés à leur interaction avec d'autres composants de la matrice
(fibronectine, collagène, cytokines, TGFβ, etc.) dans la régulation de la stabilité, de la
biodisponibilité et de l'activité biologique 44.
Les protéoglycanes représentent environ 40% du poids sec du cartilage et présentent une
remarquable hiérarchie structurelle. Le protéoglycane prédominant dans le cartilage est
l’Aggrécane. Il représente 50 à 85% de la totalité des protéoglycanes du cartilage articulaire
45,46, en fonction de l'origine et de l'âge. Il s’agit d’une grosse molécule d'agrégation qui
s'assemble avec l'hyaluronane en de très grands agrégats, illustrant les structures complexes que
Figure 7 : Structure d’un protéoglycane
27
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
les protéoglycanes forment parfois. L’épine dorsale de l’agrégat de protéoglycanes du cartilage
est une longue molécule d’hyaluronane à laquelle de multiples molécules d’aggrécane sont liées
de manière étroite mais non covalente. Ces agrégats confèrent au cartilage ses propriétés
uniques de type gel et sa résistance à la déformation, indispensables à la répartition de la charge
dans les articulations portantes. Outre l'aggrécane, le cartilage articulaire contient d'autres
protéoglycanes tels que la décorine, le perlécane, le lumicane, le biglycane et la fibromoduline
45.
1.1.2.1.3 Le rôle de l'eau au sein du tissu cartilagineux
En volume, l'eau est toujours le composant le plus important et joue un rôle central dans
les propriétés biomécaniques du cartilage articulaire. L'absorption d'eau dans les tissus est
principalement influencée par les molécules de protéoglycanes emprisonnées dans la structure
entre les fibres de collagène de la MEC. Ce protéoglycane contient des molécules de GAG
poly-anioniques qui absorbent des ions de sels du liquide synovial, ce qui entraîne une pression
osmotique élevée dans les interstices de la MEC. La compartimentation du contenu ionique
dans la MEC tissulaire conduit à un équilibre de Gibbs-Donnan 47, responsable de la forte
pression de gonflement du cartilage articulaire. Les fibres de collagène ont une association
Figure 8 : Structure d’un glycosaminoglycane (GAG). Les GAG ont des charges
négatives sur leurs sulfates carboxylés et peuvent ainsi capter les ions Ca++ et Na+ qui,
eux-mêmes, attirent l'eau. Ces protéoglycanes constituent un véritable gel hydrophile qui
occupe un volume considérable par rapport à son contenu glucidique et l'eau constitue
ainsi 70-75 % du poids humide du cartilage articulaire adulte.
28
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
moins prononcée avec l'eau. Lorsque le tissu est porteur, de l'eau s'échappe des interstices de la
MEC et, à son tour, l'affinité des molécules de GAG pour l'eau augmente (en raison d'une
pression osmotique croissante) 46. La pression osmotique élevée provoque le retour du tissu à
sa forme initiale lorsque le cartilage est déchargé et la propriété de traction élevée du collagène
résiste à la dilatation de la MEC. L'eau est principalement associée aux molécules d'aggrécane
ou se trouve dans les interstices de la MEC en tant que composant en vrac. L'eau représente 65
à 80% de la masse du cartilage articulaire, la proportion la plus élevée se trouvant près de la
surface. La forte teneur en eau du cartilage articulaire offre des propriétés d’incompressibilité
et, associée à son organisation structurelle caractéristique, facilite ses propriétés de protection
contre les contraintes. En spectroscopie Raman, les modes de vibration d'étirement qui
subissent une liaison hydrogène avec de l'eau apparaissent à une fréquence inférieure à celle
des modes d'étirement qui ne sont pas impliqués dans la liaison de l'hydrogène, en raison d'une
réduction de la constante de force entre une liaison donnée lors de l'engagement d'une liaison
hydrogène dans l'eau. Alors que les modes de courbure apparaissent à une fréquence plus élevée
lorsqu'ils sont impliqués dans la liaison hydrogène par rapport aux modes de courbure non liés
à l'hydrogène, étant donné qu'il y a une diminution de la masse effective d'un atome
d'hydrogène. De plus, le microenvironnement des groupes fonctionnels qui produisent ces
modes de vibration peut changer lors de l'hydratation, ce qui entraîne l'apparition de modes de
vibration différents dans les spectres Raman. Ainsi, la spectroscopie Raman fournit des
informations structurelles relatives à l'association de groupes moléculaires avec de l'eau.
1.1.2.2 Le chondron
Un chondron (typique) se compose d'un chondrocyte et de sa matrice péricellulaire
(MPC) environnant. La combinaison du chondrocyte et de cette matrice péricellulaire a été
appelée le chondron et représente la principale unité structurelle, fonctionnelle et métabolique
du cartilage articulaire 48,49, avec des différences morphologiques qui varient selon
l’architecture zonale du collagène 50. Le terme «chondron» a été inventé il y a près d'un siècle,
mais c'est une série d'études réalisées par Poole qui a introduit les chondrons à la biologie du
cartilage 51. L'une de ses fonctions est de protéger le chondrocyte d'une déformation sévère sous
charge 52.
29
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1.1.2.2.1 La matrice péricellulaire (MPC)
Dans le cartilage, la MPC est mieux étudié sous forme de chondrons. Dans le cartilage
articulaire, les chondrocytes sont entourés d'une région étroite appelée matrice péricellulaire
(MPC) qui, avec la cellule incluse, est appelée chondron 49. Cette région se distingue
biochimiquement, structurellement et mécaniquement de la matrice extracellulaire (MEC) 53.
La matrice péricellulaire est caractérisée par le fait qu'elle présente de fines fibres de collagène
(10-15 nm de diamètre); de concentrations élevées de protéoglycanes et d’hyaluronane; et la
présence de fibronectine 54, de collagène de types VI et IX, de protéine de liaison, de biglycane,
de décorine et de laminine 52,55. Cependant, les composants qui s'assemblent dans la
macromolécule d'aggrécane restent séparés, ce qui suggère que la matrice péricellulaire pourrait
jouer un rôle dans l'assemblage de la macromolécule. Le collagène de type IX régule le diamètre
des fibres de type II 56 et permet probablement la formation des fines fibres de collagène
présentes dans la matrice péricellulaire. Le collagène de type VI, composant clé de la matrice
péricellulaire, présente des concentrations péricellulaires élevées par rapport à la matrice
extracellulaire globale et interagit directement avec le chondrocyte. La fonction exacte de la
matrice péricellulaire n’est pas bien comprise, même si des preuves solides indiquent qu’elle
contribue à protéger l’intégrité physique des chondrocytes articulaires lors du chargement en
compression 57 et qu’elle fournit un emplacement confiné pour l’assemblage des composants
de la matrice. De nombreuses études antérieures suggèrent que les propriétés mécaniques de la
MPC, par rapport à celles du chondrocyte et de la matrice extracellulaire (MEC), pourraient
influer de manière significative sur les environnements contrainte-déformation,
physicochimiques et à écoulement fluide de la cellule.
1.1.2.2.2 Les chondrocytes
Les chondrocytes dérivent des cellules souches mésenchymateuses différenciées au
cours du développement embryonnaire, et sont répartis de façon éparse dans la MEC. Ils ne
représentent que 10% du volume du cartilage articulaire. Les chondrocytes différenciés suivent
un processus programmé de maturation cellulaire, qui est maintenu, à un degré variable, selon
les groupes d'âge et les sites anatomiques 58. Ces variations dans le comportement biologique
des chondrocytes conduisent à la production de différents types de cartilage caractérisés par des
différences de fonction marquées. Par exemple dans le cartilage à plaques de croissance, les
chondrocytes ont un potentiel de prolifération considérable et maintiennent un très haut taux de
renouvellement de la protéine matricielle, tandis que dans le cartilage articulaire, notamment
30
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
chez l'adulte, les chondrocytes se divisent plus lentement et, produisent de grandes quantités de
protéines matricielles, qui s'accumulent de manière complexe dans la matrice extracellulaire
22,59. La couche superficielle est la plus cellulaire et le nombre de cellules diminue avec l’âge
du patient 22,58,59. Ces cellules fonctionnent principalement en anaérobie. Leur fonction
principale est de produire des molécules en remplacement de la matrice dégradée, et maintenir
ainsi l’homéostasie de la MEC 60.
En microscopie électronique, les chondrocytes se présentent sous une forme sphérique
ou ovoïde, et mesurent environ 20 à 40 µm de diamètre 58. Ils sont noyés dans la matrice
cartilagineuse sans contact intercellulaire direct. Les chondrocytes possèdent un noyau central
développé, des mitochondries et des vacuoles lysosomiales. Le réticulum endoplasmique des
cellules et l'appareil de Golgi sont prédominants. En outre, beaucoup contiennent des réserves
de lipides et de glycogène ainsi que des vésicules de sécrétion. Certains chondrocytes ont des
cils qui s'étendent de la cellule à la MEC et sont supposés jouer un rôle dans la détection de
l'environnement mécanique de la cellule, car les chondrocytes sont connus pour modifier les
propriétés de la matrice en réponse au chargement 61. Les chondrocytes ne migrent pas et se
multiplient peu ou pas dans un cartilage normal. En situation physiologique, les chondrocytes
maintiennent un équilibre dynamique entre la synthèse et la dégradation des protéines
structurales de la matrice cartilagineuse. Cette homéostasie est assurée par de nombreux
facteurs : contraintes mécaniques 62, facteurs de croissance tels que le transforming growth
Noyau
Matrice cartilagineuse
Chondrocyte logé dans
son chondroplaste
Figure 9 : Chondrocyte de cartilage articulaire en microscope électronique (ME)
31
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
factor (TGF) bêta, le fibroblast growth factor (FGFb), l’Insulin-like growth factor (IGF). Le
rôle de ces différents facteurs est de réguler les synthèses chondrocytaires des :
- protéines matricielles (collagènes, protéoglycanes, glycoprotéines de structure);
- protéases (métalloprotéases, aggrécanases, cathepsines);
- inhibiteurs de protéases (inhibiteurs tissulaires de métalloprotéases, activateur du
plasminogène).
Il faut noter qu’il s’agit d’un des rares tissus à fonctionner en hypoxie. Il existe un gradient
hypoxique qui varie de 10 % de teneur en oxygène en surface à 1 % en profondeur. Il a été
toutefois montré que les chondrocytes des couches les plus superficielles pouvaient avoir en
partie un fonctionnement aérobie par diffusion des gaz (O2) présents dans le liquide synovial.
1.1.2.3 Interactions entre les chondrocytes et la matrice 61
Les propriétés biologiques et mécaniques uniques du cartilage articulaire dépendent de
la conception du tissu et des interactions entre les chondrocytes et la matrice qui maintiennent
le tissu. Les chondrocytes forment le cadre macromoléculaire de la matrice tissulaire à partir de
trois classes de molécules : les collagènes, les protéoglycanes et les protéines non-
collagéniques. Les collagènes de types II, IX et XI forment un maillage fibrillaire qui donne au
tissu sa forme, sa rigidité et sa résistance à la traction. Le collagène de type VI fait partie de la
matrice entourant immédiatement les chondrocytes (appelée matrice péricellulaire) et peut aider
les chondrocytes à se fixer à la structure macromoléculaire de la matrice. Les grands
protéoglycanes agrégateurs (aggrécanes) confèrent au tissu sa rigidité à la compression et sa
résilience et contribuent à sa durabilité. Les petits protéoglycanes, y compris la décorine, le
biglycane et la fibromoduline, se lient à d'autres macromolécules matricielles et contribuent
ainsi à stabiliser la matrice. Ils peuvent également influencer la fonction des chondrocytes et
lier les facteurs de croissance. La matrice protège les cellules contre les dommages mécaniques
dues à une utilisation normale de l'articulation, détermine les types et les concentrations de
molécules qui atteignent les cellules et aide à maintenir leur forme et le phénotype
chondrocytaire. La matrice agit également comme un transducteur de signal pour les
chondrocytes. Par exemple, la compression de la surface articulaire déforme la matrice et peut
déformer directement les chondrocytes. Elle transmet aux chondrocytes des signaux résultant
de la charge mécanique de la surface articulaire et les chondrocytes répondent à ces signaux en
altérant la matrice.
32
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Figure 10 : Arrangement régional et zonal du cartilage articulaire. (A) Spécialisation
régionale du cartilage articulaire (les matrices péricellulaires, territoriales et interterritoriales
autour des chondrocytes), (B) Organisation zonale distincte du cartilage articulaire de la
surface articulaire à la zone calcifiée). Abréviations ChS = sulfate de chondroïtine, Coll =
collagène, COMP = protéine de matrice oligomère cartilagineuse, DS = sulfate de dermatane,
FGF-2 = facteur de croissance des fibroblastes-2, FGFR = récepteur du FGF, HS = sulfate
d'héparane, KS = sulfate de kératane. 63
En effet, la charge du tissu due à l'utilisation de l'articulation crée des signaux
mécaniques, électriques et physico-chimiques qui aident à diriger l'activité synthétique et
dégradante des chondrocytes. Tout au long de la vie, le tissu subit un remodelage interne
continuel à mesure que les cellules remplacent les macromolécules matricielles perdues par
dégradation. Les données disponibles indiquent que le renouvellement normal de la matrice
dépend de la capacité des chondrocytes à détecter des altérations de la composition
macromoléculaire et de l'organisation de la matrice, y compris la présence de molécules
dégradées, et à réagir en synthétisant les types et quantités appropriés de nouvelles molécules.
Une diminution sévère et prolongée de l'utilisation de l'articulation entraîne des
altérations de la composition de la matrice et éventuellement une perte de la structure tissulaire
et des propriétés mécaniques, tandis que l'utilisation de l'articulation stimule l'activité
synthétique des chondrocytes et éventuellement le remodelage tissulaire interne. Aussi, le
vieillissement entraîne-t-il des altérations de la composition de la matrice et de l'activité des
chondrocytes, notamment la capacité des cellules à répondre à divers stimuli tels que les
A : Régions Cartilagineuses
B : Zones du Cartilage
Péricellulaire
Territoriale
Interterritoriale
Plus superficielle
Tangentielle
Milieu
Profonde
Calcifiée
33
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facteurs de croissance. Les altérations peuvent augmenter la probabilité de dégénérescence du
cartilage. Des études expérimentales ont montré qu'une diminution anormale persistante de la
charge articulaire ou de l'immobilisation d'une articulation diminue la concentration de
protéoglycanes dans le cartilage articulaire et leur degré d'agrégation et modifie les propriétés
mécaniques du cartilage. En tout état de cause, le chargement peut également provoquer des
changements persistants dans l'organisation moléculaire de la matrice, modifiant la réponse des
chondrocytes à un chargement ultérieur. Ainsi, la matrice peut non seulement transduire et
transmettre des signaux, mais elle peut également enregistrer l'historique de chargement du tissu
et modifier la réponse des cellules sur la base de l'historique de chargement.
1.1.3 Organisation zonale
Le cartilage articulaire présente une composition tissulaire stratifiée, une organisation
zonale, une surface lisse et un ancrage ferme à l’os sous-chondral, qui contribuent à sa capacité
unique à supporter des charges articulaires, retenir l’eau, se déformer et rebondir sous un
mouvement glissant 64. Le cartilage articulaire est connu pour être inhomogène à la fois dans sa
morphologie interne et dans la distribution de ses composants moléculaires à travers le tissu
65,66. Il peut être divisé en trois zones (superficielle, moyenne et profonde) en fonction des
différences entre la morphologie de la matrice et la biochimie. Dans chaque zone, il y a trois
territoires distincts: la cellule, la région péricellulaire (MPC), la région territoriale (MT) et la
région interterritoriale (MIT). Les matrices territoriales et interterritoriales forment la matrice
extracellulaire (MEC). Les régions péricellulaires et territoriales fournissent des moyens pour
la fixation des chondrocytes à la MEC et la protection des cellules pendant le chargement.
De façon particulière, il existe une distribution variable du collagène et de l'aggrécane
avec une profondeur allant de la surface synoviale à la section transversale de l'interface
cartilage-os. La région péricellulaire contient presque exclusivement des protéines de liaison
non collagéniques. Une partie de la région territoriale est composée de fibrilles de collagène
qui suivent l'enveloppe péricellulaire, mais peuvent s'étendre pour englober deux chondrocytes
ou plus. Plus loin des cellules, le collagène territorial est moins aligné et les fibrilles se croisent
pour former une structure en panier autour du ou des chondrocytes. La région interterritoriale
est marquée par une augmentation du diamètre des fibrilles et de l'orientation des fibres de
manière plus parallèle. Cette région est principalement responsable des propriétés mécaniques
du tissu 61.
34
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CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1.1.3.1 Zone superficielle
La zone superficielle ou tangentielle du cartilage articulaire comprend les 10 à 20% du
tissu. C’est la zone la plus mince et est composée de deux couches distinctes. Une feuille
acellulaire composée principalement de fibres de collagène de petit diamètre et densément
tassées, orientées parallèlement à la surface du cartilage 67. Au fond de celle-ci, la deuxième
couche est composée de chondrocytes atténués dont les grands axes sont parallèles à la surface
articulaire. La matrice contient plus de collagène et une teneur relativement faible en
protéoglycanes, ainsi qu'une faible perméabilité 65, ce qui permet aux forces de compression de
se redistribuer radialement à travers le cartilage 68. Cette zone de cartilage articulaire est
responsable de la croissance apparente et semble contenir des cellules progénitrices. Les
cellules de la zone superficielle sécrètent des protéines spécialisées, telles que la protéine de la
zone superficielle (SZP) censées améliorer les propriétés d'usure et de friction du tissu 69. Il
existe également de grandes quantités de fibronectine et d'eau. L'exsudation des fluides et les
contraintes de compression s'alignent avec le cisaillement, ce qui est directement lié à la
distribution des fibrilles de collagène dans la zone. La zone superficielle est également
importante pour la résistance à la compression du tissu et éventuellement pour l'isolement du
cartilage du système immunitaire 61,70.
Figure 11 : Cartilage articulaire avec son organisation interne : les cellules (à droite) et
les fibres de collagène (au milieu) sont
organisées dans le cartilage en zones
superficielles, moyennes et profondes, constituées respectivement de 10 à 20%, 40 à 60%
et 20 à 50% de la profondeur globale des tissus.
10-20%
40-60%
20-50%
35
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CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1.1.3.2 Zone de transition ou intermédiaire
La zone moyenne, ou zone de transition, occupe environ 40 à 60% de l'épaisseur totale
du tissu. La zone médiane comprend des chondrocytes sphériques disposées de manière
aléatoire et se caractérise par des fibrilles de collagène de type II plus grandes, plus de
protéoglycanes et moins de collagène et d’eau que dans la zone précédente. Les fibres de
collagène de cette région présentent une structure en arcade parsemée de fibres orientées de
manière aléatoire 71. La teneur en protéoglycanes atteint son maximum dans la zone médiane.
Les fibrilles interterritoriales sont alignées de manière oblique ou aléatoire sur la surface
articulaire, et non parallèles comme dans la zone superficielle 61,70.
1.1.3.3 Zone radiale ou profonde
La zone profonde, comprenant 20 à 50% de l'épaisseur totale, est la dernière couche de
tissu purement hyalin avant d'atteindre l'os. Sa structure en collagène est caractérisée par de
grosses fibres formant des faisceaux orientés perpendiculairement à la surface articulaire et
ancrées dans l'os sous-chondral sous-jacent 65. La teneur en protéoglycanes est beaucoup plus
basse que dans la zone moyenne 72 et la densité cellulaire est également la plus faible des trois
zones cartilagineuses 73. Les cellules de la zone profonde se regroupent souvent dans une
organisation en colonnes. Elles sont légèrement allongées et orientées dans la direction des
fibres de collagène, perpendiculairement à la surface articulaire. Ces cellules présentent une
activité synthétique élevée dix fois supérieure à celle des chondrocytes de la zone superficielle.
De plus, dans cette zone, l'orientation des fibres interterritoriales change à nouveau, de sorte
qu'elles sont maintenant alignées perpendiculairement à la surface de l'articulation. Les fibres
s'étendent jusque dans la zone de démarcation, une ligne basophile de composition inconnue
qui indique le début du tissu calcifié 61,70. Bien que le débit de fluide dans cette zone soit
relativement faible, des forces de cisaillement importantes sont ressenties entre les types de
tissus adjacents lors des contacts des surfaces articulaires, le cartilage ne pouvant se dilater
contre le tissu osseux.
1.1.3.4 Ligne de démarcation et la zone cartilagineuse calcifiée
La mince zone cartilagineuse calcifiée appelée est une ligne de ciment minéralisé
délimitant l'interface cartilagineuse non calcifiée et calcifiée 74. Elle sert de transition entre le
cartilage hyalin mou et l'os et, les chondrocytes sont élargis mais très rares dans cette région.
36
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CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Comme pour les autres constituants, la concentration en protéoglycanes dans le cartilage
articulaire est la plus faible en surface et maximale autour des chondrocytes dans la zone
profonde 75, ce qui peut être démontré par une coloration plus dense à l'hématoxyline bleue
autour des lacunes. Une importante contrainte de cisaillement peut être produite dans cette zone
en raison de l’interface entre le cartilage mou et un os beaucoup plus ferme 76. Les chondrocytes
ici sont plus petits, avec presque pas de réticulum endoplasmique. À certains endroits, ils
semblent complètement entourés de MEC calcifiée, indiquant qu'ils ont très peu d'activité
métabolique 61,70. Dans la couche cartilagineuse calcifiée, les chondrocytes sont au repos, moins
nombreux, produisent du collagène de type X et expriment la phosphatase alcaline. Sous cette
région du cartilage se trouve l'os sous-chondral, qui constitue le point d'ancrage ultime du
cartilage dans son ensemble.
1.1.4 Développement du cartilage
La compréhension de l’origine et du développement des tissus est au cœur d’une
pratique efficace en ingénierie tissulaire 77. En effet, selon les idées reçues et largement
acceptée, la régénération des tissus naturels récapitule les processus de développement 78. De
ce fait, une étude embryologique peut donner un aperçu des processus et des modèles de
régulation qui régissent le type et la fonction des tissus, en plus de jeter les bases d'une
compréhension de la dégénérescence et des dommages observés dans les tissus du corps
humain. La chondrogenèse se produit à la suite de la condensation des cellules
mésenchymateuses, qui expriment les collagènes I, III et V et la différenciation cellulaire des
chondroprogéniteurs avec l'expression de collagènes II, IX et XI spécifiques du cartilage. Un
milieu d'hormones et de facteurs paracrines régit une interaction complexe de prolifération et
de différenciation des chondrocytes, et le processus peut être divisé en cinq étapes, les trois
premières étant principalement cruciales pour la formation du cartilage 79.
La différenciation se poursuit et s’accompagne d’un accroissement de la taille des
cellules qui deviennent hypertrophiques. La zone d’hypertrophie, dont la taille varie au cours
du développement fœtal, serait, selon certains auteurs, le moteur essentiel de la croissance
osseuse 80. L'un des épicentres du développement du cartilage squelettique est la plaque de
croissance qui produit les os longs via le gabarit du cartilage au cours d'un processus appelé
ossification endochondrale. Les chondrocytes localisés à l’extrémité de l’épiphyse sont
immatures et définissent la zone de réserve. Au fur et à mesure que progresse la condensation
des cellules mésenchymateuses en chondrocytes, il devient possible d’identifier certaines zones
37
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
correspondant à des sous-populations de chondrocytes à différents stades de différenciation.
Après cette étape, le profil d'expression des cellules change et le collagène de type X et la
fibronectine sont sécrétés, ce qui permet la minéralisation par infiltration de carbonate de
calcium et d'ostéoblastes pour la formation d'os. L'infiltration vasculaire ouvre la voie à la
différenciation terminale et au développement osseux, entraînant l'apoptose des chondrocytes
et la différenciation ostéoblastique (Figure 12). Il est important de noter que ce processus est
spécifique aux régions articulaires des os et est suivi du remplacement éventuel par du tissu
osseux.
En somme, la chondrogenèse est un processus étroitement contrôlé dans lequel plusieurs
facteurs régulent les stades discrets du programme de différenciation. La compréhension des
mécanismes d'engagement cellulaire et de la différenciation ultérieure en une lignée particulière
est importante dans le développement de traitements thérapeutiques des lésions squelettiques
basées sur des techniques de transplantation des CSMs
Figure 12 : Formation et régulation par des facteurs transcriptionnels des lignées
chondrocytaire et ostéoblastique81
38
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1.1.5 Physiopathologie et épidémiologie du cartilage arthrosique
La pathogénie du cartilage articulaire implique des facteurs biochimiques et génétiques,
ainsi que le stress mécanique qui contribuent à la lésion dans l'arthrose du cartilage en perturbant
les associations matrice-chondrocytes et, en modifiant les réponses métaboliques du chondrocyte
49,82 (Figure 13). L’arthrose survient habituellement dans des conditions de surcharge excessive
d’une matrice cartilagineuse normale ou de surcharge normale d’une matrice cartilagineuse
vulnérable. Il est maintenant admis que la destruction arthrosique du cartilage est le résultat d’un
déséquilibre entre anabolisme et catabolisme de la matrice extracellulaire 83. Le déséquilibre est
provoqué par:
- Une synthèse accrue de protéases (et plus particulièrement de certaines métalloprotéases)
qui ont pour substrat les protéines collagèniques et non collagèniques de la matrice 84; une
diminution de la synthèse d’inhibiteurs naturels des protéases (les TIMP);
- Une inhibition de synthèse de la matrice fonctionnelle par le chondrocyte arthrosique;
Ce déséquilibre est accentué par une apoptose chondrocytaire accélérée 85 et une activation
chondrocytaire par le tissu synovial. Les chondrocytes une fois activés deviennent aptes à
synthétiser différentes protéases mais également différents médiateurs proinflammatoires 86.
Plusieurs protéases sont à l’origine de la destruction du cartilage observée au cours du processus
arthrosique. Les métalloprotéases (MMP) constituent qualitativement la famille prédominante car
elles sont activées à pH neutre c’est-à-dire activent directement dans les milieux extracellulaires et
en particulier dans la matrice cartilagineuse. I1 existe une douzaine de MMP différentes dont
certaines restent liées aux membranes cellulaires (MT-MMP) 87. Elles sont synthétisées par les
chondrocytes et les synoviocytes sous l’effet de cytokines. L’aggrécanase enzyme qui clive la
liaison Glu373- Ala374 du domaine interglobulaire de l’aggrécane joue également un rôle majeur
dans la dégradation de la matrice. Elles appartiennent à la famille des métalloprotéases et plus
spécifiquement des ADAMTS (Disintegrin and Métalloprotéinase with TromboSpondin) 88,89.
D’autres enzymes ayant pour substrat le collagène de type II et les protéoglycanes sont
synthétisées par le chondrocyte. Elles ne sont actives qu’a pH acide telles que les aspartate protéases
(cathepsine D) et les cystéines protéases (cathepsines B, H, K, L et S) stockées dans les lysosomes
chondrocytaires puis libérées dans le microenvironnement péricellulaire. En dehors des protéases
il ne faut pas oublier l’importance théorique des enzymes capables de dégrader les chaînes
glucidiques présentes en grande quantité dans les PG.
39
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Les cytokines pro-inflammatoires et en particulier 1’IL-1 et le TNF-α synthétisés par
les chondrocytes et les synoviocytes activent ces mêmes cellules par leur liaison à des récepteurs
spécifiques par l’intermédiaire de voies de signalisation spécifiques aux cytokines.
L’IL-1 apparaît comme la cytokine la plus impliquée dans les processus de dégradation du
cartilage dans l’arthrose comme l’on confirmé différents travaux expérimentaux:
La suppression des lésions du cartilage dans l’arthrose expérimentale grâce à la thérapie
génique par l’IL-1ra (antagoniste des récepteurs de l’IL-1) ;
L’augmentation des lésions du cartilage dans l’arthrose induite chez des souris déficientes
en IL-1b ;
La diminution des lésions du cartilage chez des souris déficientes en IL-1b uniquement
dans l’arthrose induite légère et instable.
L’IL-1 provoque une diminution d’expression des collagènes de type II et IX tout en
augmentant la synthèse des collagènes de type I et III 90.
D’autres cytokines destructrices, telles que l’IL-17 ou l’IL-18 peuvent intervenir sur le
cartilage.
En somme, la destruction de la matrice extracellulaire (MEC) constitue l’événement
initial à la dégradation du cartilage observé dans l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde ainsi que
dans d'autres maladies dégénératives. Pendant les phases d’initiation, les chondrocytes
présentent une réponse proliférative transitoire (croissance clonale), une synthèse accrue de la
matrice cartilagineuse lors d'une tentative de réparation précoce et une synthèse accrue des
cytokines cataboliques et des enzymes dégradant la matrice. Des cytokines cataboliques
peuvent également être générées par les cellules de type fibroblaste et macrophage de la
synoviale en réponse aux produits de dégradation du cartilage endommagé. La perte locale de
protéoglycanes et le clivage du collagène de type II se produisent initialement à la surface du
cartilage, entraînant une augmentation de la teneur en eau et une perte de résistance à la traction
dans la matrice du cartilage à mesure que la lésion progresse. L'implication des
métalloprotéinases matricielles (MMP) dérivées des chondrocytes dans la dégradation des
collagènes cartilagineux et des protéoglycanes dans l'arthrose est bien établie.
Cette dégradation du cartilage dans les pathologies ostéo-articulaires, s’accompagne
d’une rupture du filet collagénique permettant une hyperhydratation et une plus grande
expansion des PGs, qui de surcroit, ont un poids moléculaire réduit. Ainsi, les mouvements
d’eau induits par les charges ne s’exercent plus majoritairement vers le liquide synovial, mais
40
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
dans toutes les directions. Aussi, les mouvements inverses, lors de la suppression des charges,
se font également de façon désordonnée. De ce fait, l'arthrose a été définie comme une maladie
dégénérative de l'articulation synoviale provoquée par une augmentation du cisaillement et de
la pression hydrostatique entre deux os adjacents, ce qui conduit finalement à une grave
perturbation du cartilage. Ce déséquilibre peut être initié par de multiples facteurs : génétiques,
congénitaux, métaboliques et traumatiques.
A ce jour, l’arthrose est la pathologie articulaire la plus fréquente dans le monde, et
concerne plus de 80 % des sujets âgés de plus de 65 ans 91, apparaissant de loin la principale
cause de morbidité dans tous les pays développés. D’un point de vue clinique, l'arthrose est la
seconde cause d'invalidité après les maladies cardio-vasculaire et représente ainsi un véritable
problème de santé publique tant dans les pays industrialisés que ceux en voie de développement
de par le vieillissement des populations et l’obésité croissante. Son impact économique est
retentissant en raison des dépenses imposées et de l’handicap engendré.
Selon les estimations du National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin
Diseases (NIAMS, http://www.niams.nih.gov/), plus de 20 millions d’américains souffrent
Figure 13 : Représentation schématique des circonstances pathogéniques impliquées
dans l’apparition de la maladie de l’arthrose. Image empruntée à Henrotin Y.dans
« Approche expérimentale de la pathogénie et du traitement de l'arthrose. In: Faculté
de Médecine. Liège: Université de Liège; 2003 ».
41
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
actuellement d’arthrose. Les statistiques suggèrent que près de 1 million d'américains sont
touchés chaque année par des lésions chondrales 92. Selon les prévisions, d'ici 2030, 20%
(environ 72 millions d’américains) auront atteint leur 65ème anniversaire et donc de potentiels
sujets à risque pour cette maladie.
D’autres estimations plus prudentes annoncent 35 à 40 millions d’européens qui
souffriraient d’arthrose. En France, plus particulièrement, 5 et 10 millions de personnes
souffrent d’arthrose, un nombre en constante augmentation en raison de l’allongement de la
durée de vie et de certains facteurs de risque de plus en plus répandus dans la population tels
que l’obésité. Son retentissement socio-économique est très important. Les économistes de la
santé chiffrent le coût (direct et indirect) de l’arthrose en France à plus de 1,6 milliard d’euros
en 2005 93. Elle est responsable annuellement de 9 millions de consultations qui génèrent 14
millions d’ordonnances, 300 000 examens radiologiques au moins, 100 000 journées
d’hospitalisations. Au total, l’arthrose représente 0,8% des dépenses de santé en France.
Les données épidémiologiques actuelles estiment que l’arthrose est la première cause
de consultation associée à la limitation fonctionnelle et à l’incapacité physique. Selon Brooks
(2006) 94, l’arthrose est une cause importante d’années de vie corrigées de l’incapacité dans les
pays développés et en voie de développement. En raison des tendances à la hausse de
l’espérance de vie et de l’obésité chez les jeunes, les statistiques prévoient une augmentation
constante de la prévalence de l’arthrose 95,96, sans compter l’incidence de blessures sportives
augmente. La mise à jour la plus récente des chiffres de la charge mondiale de la maladie (GBD
2013) a estimé que 242 millions de personnes vivaient dans le monde avec une arthrose
symptomatique et limitant l'activité de la hanche et / ou du genou, soit 13 millions avec des
années vécues avec un handicap (YLD). Ces chiffres sont probablement une sous-estimation
du fardeau mondial réel de l'arthrose, car ces taux ne prennent en compte que l'arthrose de la
hanche et du genou, et non l'arthrose sur d'autres sites.
42
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1.1.6 Stratégies thérapeutiques des lésions cartilagineuses
1.1.6.1 Stratégies conventionnelles
La nature avasculaire du cartilage articulaire, fait de lui un tissu qui se régénère peu et
cicatrice difficilement de façon spontanée, notamment à l’âge adulte 97,98. Il est intéressant que
préciser que la circulation est une partie essentielle au processus normal de guérison. De ce fait,
l'absence d’innervation et de vascularisation du cartilage peut supprimer les réponses normales
associées à la guérison 99,100. Par ailleurs, les lésions du cartilage articulaire sont-elles
fréquemment associées à un handicap et à des symptômes tels que des douleurs articulaires, des
phénomènes de blocage et une réduction ou une perturbation de la fonctionnalité de
l’articulation, évoluant généralement vers des formes graves d'arthrose 101–103. Étant donné la
multitude d'origines possibles, le traitement des lésions de la surface articulaire incluait des
procédures cliniques allant de la thérapie de conservation à la chirurgie invasive 77,104.
1.1.6.1.1 Thérapie de conservation
A l’origine, l'arthrose est une maladie dégénérative principalement non inflammatoire,
souvent liée à l'âge et/ou à un traumatisme. Cependant, la progression des processus dégradants
finissent par entraîner la destruction irréversible du cartilage articulaire et d'autres tissus des
articulations, occasionnant des phénomènes inflammatoires et douloureux. Le traitement
pharmacologique standard comprend des agents de contrôle de la douleur et de l'inflammation,
tels que les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) par voie orale ou locale, les
analgésiques y compris les opioïdes, les corticostéroïdes intra-articulaires et le groupe des
médicaments symptomatiques à action lente pour l'arthrose tels que le sulfate de glucosamine,
le sulfate de chondroïtine, la diacéréine, les insaponifiables extrait de soja et d'avocat administré
par voie orale et acide hyaluronique intrarticulaire. Malheureusement, aucune des
pharmacothérapies développées à ce jour ne s'est avérée efficace pour régénérer le cartilage.
Comme le souligne Steven et ses collaborateurs (2006), des médicaments efficaces sont
désespérément nécessaires 105.
43
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1.1.6.1.2 Techniques chirurgicales
1.1.6.1.2.1 Lavage et débridement par chondroplastie
Le lavage et le débridement arthroscopiques sont souvent utilisés pour soulager les
douleurs articulaires. Le lavage implique l'irrigation de l'articulation pendant l'arthroscopie. Ce
rinçage de l'articulation semble soulager la douleur bien que le mécanisme en soit incertain 106.
La procédure peut éliminer les débris de l'espace articulaire, soulageant ainsi la douleur. Le
débridement est l'ablation arthroscopique des tissus endommagés de l'articulation, qui soulage
également la douleur et, lorsqu'elle est utilisée en conjonction avec un lavage, le soulagement
de la douleur semble durer plus longtemps 107. Le débridement arthroscopique et le lavage ont
un rôle palliatif dans le traitement des lésions chondrales de petite ou d’épaisseur partielle dans
lesquelles l'objectif est de préserver le cartilage environnant intact restant. Ces deux procédures
sont utilisées en routine pour soulager les douleurs articulaires et se sont avérées efficaces pour
traiter les premiers stades de l'arthrose 108,109. Cependant, le lavage et le débridement n'induisent
pas la réparation du cartilage articulaire. En tout état de cause, les patients sont informés que
les résultats ne sont pas prévisibles mais peuvent améliorer leurs symptômes 110. Dans certaines
études, les auteurs ont pu montrer que le soulagement de la douleur observé après les procédures
de débridement et de lavage ne peut être qu'un effet placebo après une chirurgie 111,112.
1.1.6.1.2.2 Techniques de microfracture et de stimulation de la moelle osseuse
De nombreuses procédures arthroscopiques utilisées pour induire la réparation du
cartilage articulaire tirent parti de la réponse de réparation intrinsèque, observée lors de la
pénétration de l'os sous-chondral dans les défauts de pleine épaisseur. Ces procédures de
stimulation médullaire comprennent le forage ostéochondral, l'abrasion, l'arthroplastie et la
microfracture. L’idée est de faciliter la délivrance de cellules progénitrices à partir de la moelle
osseuse pour former un tissu cicatriciel de type fibrocartilage sur le défaut. Ces techniques sont
généralement appliquées sur des défauts de grade 3 ou 4 d'Outerbridge allant de 2 à 3 cm2, mais
nécessitent pour la circonstance un bord cartilagineux intact essentiel pour contenir le caillot de
guérison 110. L'os exposé est débridé de tout cartilage instable et de la coiffe cartilagineuse
calcifiée. Les perforations sont pratiquées à environ 3 mm d'intervalle et 2 à 4 mm de
profondeur dans l'os sous-chondral et sont pour la plupart pratiquées sur des sujets jeunes de
moins de 35 ans avec des lésions de moins de 400 mm2 113. Le résultat clinique de ces procédures
est mitigé, en raison de la nature imprévisible du tissu de réparation formé, mais aussi de l'âge
44
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
et des niveaux d'activité du patient 114–116. Les suites opératoires exigent que les patients
bénéficiant de telles techniques, soient sur une machine à mouvement passif continu et un palier
au toucher assisté par béquille pendant 6 à 8 semaines 116
1.1.6.1.2.3 Transfert d'autogreffe ostéochondrale / mosaïqueplastie
Cette procédure consiste à prélever des bouchons ostéochondraux d'une région non
porteuse (généralement la trochlée ou le périmètre autour de l'échancrure intercondylienne) et
à les transférer sur des défauts d'épaisseur totale du cartilage articulaire. La lésion est préparée
par forage et débridement pour laisser un site receveur cylindrique propre sans fragments
Figure 14 : Représentation schématique de la technique de microfracturation. (A) Le
plancher d'un défaut chondral est perforé à plusieurs endroits à l'aide d'un instrument
pointu ou d'un foret à fibre étroite. Par cette action, l'espace médullaire de l'os sous-
chondral est ouvert. Le sang s'infiltre dans le défaut portant des MSC locales dérivées de la
moelle osseuse - et y forme un hématome (reproduit avec permission de Hunziker et al,
2015). (B) Situation clinique de lésion de grade 4 sur un condyle fémoral médial. À gauche:
lésion avant la préparation. Droite: Lésion après débridement et microfracture avec des
saignements à la surface de la moelle osseuse. (Cheung Sunny et Benjamin Ma C., 2011).
Lésion
Hématome
Cartilage
articulaire
Os
Moelle
osseuse
Cartilage
calcifié
A
B
45
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
lâches. Chaque bouchon donneur est ensuite inséré dans le site receveur, perpendiculairement
au contour articulaire, et par ajustement serré. En règle générale, plusieurs bouchons de 6 à 8
mm de diamètre sont utilisés pour combler la lésion de manière «pavée» comme on peut le
constater sur la figure ci-dessous. Les sites donneurs se remplissent de fibrocartilage au fil du
temps, tandis que le site de greffe forme une surface de glissement congruente avec le cartilage
hyalin transplanté. Sur le plan clinique, des bons résultats sont parfois enregistrés. Le problème
demeure avec l'incertitude de la morbidité du site donneur à long terme, l'exactitude de
l'implantation concernant la congruence des surfaces cartilagineuses et la liaison de la zone
chondrale au cartilage adjacent.
Figure 15 : Représentation schématique du principe de la
mosaïqueplastie. Des bouchons cylindriques de tissu
ostéochondral sont percés à partir d'une zone non portante
de l'articulation du genou (à l'aide d'un instrument
chirurgical spécial), puis ajustés à la presse, côte à côte,
dans la zone endommagée. Le nombre de bouchons retirés
dépendra du diamètre de surface du site accepteur. Les sites donneurs dénudés sont soit remplis
de tissu ostéochondral qui est retiré du site accepteur endommagé lors de sa préparation
chirurgicale pour les bouchons, soit laissés vides. Vu de dessus, les bouchons ajustés forment
une mosaïque de profils circulaires qui sont entrecoupés d'espaces vides; d'où le nom de
"mosaïqueplastie". (Reproduit avec permission de Hunziker et al, 2015). (B) Mosaïque de
bouchons obtenus à partir de la trochlée (Cheung Sunny et Benjamin Ma C., 2011).
Lésion
Cartilage
Os
Bouchons ostéochondraux
A
B
46
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1.1.6.1.2.4 Allogreffe ostéochondrale
Semblable au transfert d'autogreffe ostéochondrale, cette technique utilise à la place des
bouchons de donneur de cadavres frais de taille correspondante. Cette procédure est réservée
aux défauts chondraux supérieurs à 2,5 cm2 et nécessite la disponibilité d'une allogreffe fraîche
ou conservée au froid pour une viabilité maximale des chondrocytes. Le timing est également
important car la viabilité des chondrocytes diminue significativement 14 jours après le stockage
117. Cette technique est généralement indiquée pour les lésions plus importantes. Dans ces
situations, il n'est pas rare que des procédures de réalignement, telles qu'une ostéotomie tibiale
élevée (HTO), soient effectuées en même temps pour protéger le compartiment affecté.
En résumé, il ressort que les techniques chirurgicales exploitent la réponse de réparation
spontanée par une stimulation de la moelle osseuse en exposant le tissu cartilagineux lésé aux
Figure 16 : Séquence sagittale (en haut à gauche) et coronale (en haut à droite)
pondérée en T2 montrant un grand défaut chondral du condyle fémoral médial.
Vues arthroscopiques de la lésion en flexion (milieu gauche) et en extension
(milieu droit). Une arthrotomie montrant le site receveur préparé (en bas à
gauche) et l'allogreffe ostéochondrale transférée (en bas à droite). Reproduit avec
la permission de Cheung et al, 2011
47
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
espaces médullaires. La réponse de réparation spontanée est basée sur des saignements induits
chirurgicalement des espaces osseux sous-chondraux et la formation ultérieure de caillots
sanguins. Cependant, la réponse de cicatrisation qui en résulte est très variable et non
reproductible, et le tissu qui se forme est de nature fibreuse 118 et non durable 119,120, traduisant
la nécessité d’exploiter d’autres voies thérapeutiques.
1.1.6.2 Thérapies cellulaires
Historiquement, le traitement des lésions de la surface articulaire incluait des procédures
cliniques allant de la thérapie de conservation à la chirurgie invasive 77,104. Par exemple dans la
microfracture, des trous sont pratiqués dans l'os exposé afin de permettre à la moelle osseuse
contenant des cellules souches de s'écouler de l'os au cartilage dans l'espoir d'une différenciation
en cartilage. Cependant, les attentes n’ont pas été tout à fait reluisantes en raison de la formation
de fibrocartilage qui, comparé au tissu hyalin, a une durabilité et une fonctionnalité réduites
121,122. Par conséquent, plusieurs options différentes de cellules progénitrices ont été proposées
comme candidates à l’ingénierie du cartilage articulaire, à savoir les chondrocytes, les cellules
souches mésenchymateuses (CSM) de différentes sources 123,124, des cellules souches
pluripotentes (induites) 125 et même des fibroblastes. A ce jour, deux sources de cellules
progénitrices sont exploitées pour la réparation des lésions cartilagineuses pour des applications
cliniques : les chondrocytes et les cellules souches mésenchymateuses. Le principe consiste à
implanter le cartilage artificiel dans le défaut cartilagineux généralement situé dans l'espace
intra-articulaire, dans lequel des indices chondro-inducteurs en termes de cytokines et de
stimulations mécaniques existent pour favoriser la chondrogenèse spontanée des cellules
implantées et maintenir leur phénotype et leur fonction chondrogéniques.
1.1.6.3 Implantation de Chondrocytes Autologues (ICA)
Les chondrocytes sont les cellules cartilagineuses résidentes essentielles à la production
de matrice extracellulaire (MEC) spécifique du cartilage. Par conséquent, ils représentent un
choix raisonnable de cellules progénitrices pour l'ingénierie du cartilage. L'ICA est l'une des
stratégies de réparation cellulaire les plus utilisées pour le cartilage articulaire. Cette technique
a été introduite en 1987 par un groupe de chercheurs Suédois suivant les principes généraux de
réparation tissulaire. Cependant, c’est en 1994 que Brittberg et ses collaborateurs ont publié
les premiers rapports cliniques montrant des résultats satisfaisants pour les lésions isolées du
condyle fémoral. Cette approche allie à la fois traitement chirurgical et des méthodes in vitro.
48
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Le principe de la technique de l’ICA consiste à réaliser une biopsie du cartilage
articulaire sain par arthroscopie à partir d'un emplacement bas ou non porteur de l'articulation
malade. Le tissu cartilagineux est ensuite digéré par voie enzymatique pour libérer les
chondrocytes, qui sont ensuite expansés en culture monocouche afin d’augmenter le nombre
(générant ainsi plus de 10 millions de cellules parmi les quelques centaines de milliers
contenues dans la biopsie). Les chondrocytes expansés sont ensuite réimplantés sur le site du
défaut cartilagineux directement sous forme de suspension cellulaire, sous un lambeau périosté
suturé chirurgicalement, qui est généralement retiré du tibia médial 126,127. Les cellules
ensemencées sont ensuite censés déposer une MEC pour réparer le site de la lésion 128,129.
Depuis lors, plusieurs études ont suivi, documentant à la fois la production d'une surface
articulaire de type hyalin et de bons résultats dans la majorité des patients avec un suivi à moyen
et long terme. Les indications de traitement ont été élargies 130,131 et cette technique cellulaire a
suscité un intérêt croissant dans le monde entier 127,132–134.
Figure 17 : Représentation schématique du développement de tissus cartilagineux par
ingénierie tissulaire. La combinaison de cellules, d'échafaudages et de facteurs de croissance
pourrait être soit directement injectée dans la lésion, soit davantage cultivée dans des
bioréacteurs in vitro pour former un nouveau tissu. Le néocartilage serait finalement implanté
dans la lésion 135.
Cellules souches
Ensemencement
Prolifération
Culture 3D
Implantation des
cellules (ICA)
Isolement
des tissus
Échafaudages
Néocartilage
Facteurs chondrogéniques
(TGF, BMP, IGF)
Facteurs anti-inflammatoires
(TIMPs, IL-Ira)
Bioréacteur
Stimulation
mécanique
49
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Les premiers résultats obtenus ont très vite permis de considérer l’ICA comme une
référence en matière de réparation, y compris pour d'autres interventions chirurgicales qui sont
utilisées pour le traitement des lésions chondrales. Au niveau clinique, de très bons résultats ont
été également obtenus, car ces techniques semblaient procurer un soulagement symptomatique
aux patients. Certaines études ont d’ailleurs établi une forte corrélation entre la qualité des tissus
produits et le soulagement symptomatique du patient contre l'enflure et la douleur, mettant un
point d’honneur sur l'importance de la qualité des tissus dans la régénération du cartilage.
Au plan histologique, des déceptions ont très vite été soulignées, car en réalité, le tissu
produit est bien moins inférieur au cartilage hyalin natif, étant de nature fibrocartilagineuse,
avec une fonctionnalité et une durabilité limitées 136,137. Ce problème a été plutôt lié au fait que
les chondrocytes excessivement expansés ont tendance à perdre leur capacité à se différencier
138, adoptant plutôt un phénotype dédifférencié. En raison de l’isolement des chondrocytes de
leur environnement naturel tridimensionnel (3D), puis expansés dans des conditions de culture
monocouche in vitro, conduit inévitablement les chondrocytes à adopter une autre morphologie
qui leur permettent d'adhérer au plastique afin de survivre. Ce changement phénotypique est
caractérisé par la dédifférenciation rendant les chondrocytes incapables à se différencier après
des longues cultures cellulaires, une fois réimplantés dans le défaut cartilagineux. Au lieu de
produire des protéoglycanes spécifiques du cartilage et du collagène de type II, les chondrocytes
expansés produisent plutôt des protéoglycanes non spécifiques et de collagène de type I 139,140.
De ce fait, la matrice du cartilage perd ses propriétés biomécaniques ordinaires et sa résilience.
D’autres limitations ont été associées à la difficulté de prélèvement de quantité
importante de cellules à greffer et à leur mise en œuvre, à la réparation parfois médiocre du
tissu lésé et la variabilité de la réponse des patients. De plus, une délamination post-opératoire
des lambeaux a été rapportée, même après les sutures 141. Ce qui exige parfois l’immobilisation
temporaire (partielle ou complète) de l'articulation pendant la période de récupération.
Récemment des chercheurs ont opté pour l’utilisation des chondrocytes
«hétérotopiques» non articulaires tels que les chondrocytes nasoseptaux ou les chondrocytes
auriculaires comme source de cellules alternatives, car seraient plus faciles à récolter, associés
à une morbidité plus faible au site du donneur et possédant un taux de prolifération plus élevé
142,143. Cependant, il reste à déterminer si les chondrocytes hétérotopiques produiraient du
cartilage avec le type souhaité (tel que le cartilage hyalin) et fonctionneraient lors de la
cicatrisation des défauts.
50
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
A ce jour, le problème de la dédifférenciation des chondrocytes semble être résolu par
l’utilisation des moyens de culture favorisant leur prolifération et leur différenciation, tels que
la culture en suspension avec un microporteur 3D 18,144, du tri des chondrocytes, de la
stimulation par la cytokine 97, ou de la réduction de la teneur en tension d’oxygène. Plus
récemment, une variante de l'approche ACI associée à une matrice (la technique dite MACI) a
été introduite 145. Selon cette technique MACI, les chondrocytes autologues sont inclus dans
une matrice (par exemple, collagène ou hyaluronane) plutôt que suspendus dans un fluide,
évitant ainsi la nécessité d'un lambeau périosté. Cependant, l'utilisation d'une matrice introduit
un nouvel ensemble de problèmes, tels que les problèmes de bio-incompatibilité,
d'inflammation et de dégradation. Toutefois, il faut souligner que ces avancées cliniques ont
conforté la volonté de progrès dans les techniques d'ingénierie des tissus cartilagineux.
1.1.6.4 Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs)
Pour surmonter les limitations des chondrocytes, les CSMs sont devenues
progressivement la cible de nombreux chercheurs. En effet, les CSMs sont des progénitrices
multipotentes, non hématopoïétiques, qui peuvent être isolées à partir de la moelle osseuse,
principalement, et d’autres tissus notamment la graisse, la pulpe dentaire et le muscle. Elles ont
été identifiées pour la première en 1924 par un chercheur russe Alexander Maximow qui, à
partir de l’histologie a identifié un type de précurseur dans le mésenchyme capable de se
différencier en une variété de types de cellules sanguines 146, bien que le terme cellule souche
mésenchymateuse n’existe pas. C’est bien plus tard dans les années 1960 (c’est dire 40 ans
après) que les chercheurs Ernest McCulloch et James Till ont pu identifier les qualités clonales
des cellules de la moelle osseuse 147,148. Il faudra encore une décennie pour mettre au point un
test ex vivo permettant d'examiner la nature clonale des cellules multipotentes de la moelle 149.
Cette analyse a été mise au point par l’équipe de chercheurs de Friedenstein dans les années
1970, malgré que les cellules stromales d’intérêt (maintenant appelées cellules souches
mésenchymateuses) aient été désignées sous le terme de fibroblastes formant des colonies
(CFU-f) 150. Depuis lors, les recherches et les expérimentations se sont succédées et permis de
mieux caractériser la plasticité des cellules de la moelle osseuse et de déterminer les moyens de
leur différenciation en types de cellules matures capables d’être manipulée par des stimuli
environnementaux.
Plus tard, la découverte des capacités de différenciation ostéoblastique, chondrocytaire
et adipocytaire de cette population adhérente au plastique, et leur capacité
51
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
d’autorenouvellement ont ensuite conduit Caplan à proposer en 1991 la dénomination de «
cellules souches mésenchymateuses » 151. En raison de leur adhérence à la boîte de culture, ils
peuvent être développés en culture tout en conservant leur multipotence 152. Par conséquent, les
CSM en culture peuvent être induites pour générer des chondrocytes, myocytes, adipocytes,
ostéoblastes (ostéocytes) et ténocytes 153,154.
Figure 18 : Représentation schématique du processus de différenciation des cellules souches
mésenchymateuses (CSM) en trois lignées différentes : Myocytes, chondrocytes, ostéocytes,
adipocytes et cellules neurales.
Des études récentes ont démontré que les CSM peuvent interagir avec les cellules
immunitaires, conduisant à la modulation d'un certain nombre de fonctions effectrices 154. Les
propriétés immunomodulatrices des CSM peuvent être exploitées pour le traitement des
affections inflammatoires et rhumatismales 155. Les CSM peuvent migrer vers les sites de lésion,
induire une tolérance périphérique et inhiber la libération de cellules souches pro-
inflammatoires. L’une des particularités des CSMs, c’est qu’elles génèrent facilement des
colonies dérivées d'une seule cellule qui peuvent être fortement développées et différenciées en
une variété de types de cellules, y compris les chondrocytes 151. En plus de leur potentiel de
réparation du cartilage, les CSMs possèdent des propriétés anti-inflammatoires qui les rendent
aptes à la thérapie cellulaire dans les maladies ostéoarticulaires 78. De sorte que, une fois
administré in vivo, les CSM peuvent induire une tolérance périphérique et migrer vers les tissus
Cellules neurales
Auto-renouvèlement
Moelle osseuse
52
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
lésés où ils ont la capacité d'exercer des propriétés immunosuppressives 156 et d'inhiber la
libération de cytokines pro-inflammatoires et favoriser la survie des cellules existantes et la
réparation des tissus endommagés 154. Ils sont cliniquement explorés comme une nouvelle
thérapeutique pour traiter une variété de maladies à médiation immunitaire 157. Les MSC sont
très prometteuses pour une utilisation dans la réparation et la reconstruction des tissus
mésenchymateux endommagés ou malades 152. En raison des applications potentielles des CSM
dans l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative, elles apparaissent comme une option
intéressante pour la régénération du tissu cartilagineuse.
Pour le développement de systèmes de chondrogenèse in vitro, de nombreux facteurs de
croissance et de différenciation impliqués dans la régulation du développement du cartilage et
de l'homéostasie du cartilage articulaire mature ont été identifiés (cinq familles de facteurs
particulièrement pertinents pour la formation du cartilage79) pour faciliter la différenciation des
CSMs adultes et améliorer ainsi la réparation du cartilage in vivo. Dans le cadre de notre travail,
nous nous résumerons à la famille des facteurs de croissance transformant bêta (TGF-β) 158, qui
ont été utilisés dans la différenciation des CSMs.
La chondrogenèse est régulée par l'interaction de membres appartenant aux principales
classes d'agents morphogènes du développement, notamment la superfamille des TGF-β. La
famille des TGF-β est un grand groupe de protéines de régulation cellulaire structurellement
apparentées, nommée d'après son premier membre, TGF-β1, décrit à l'origine par Assoian RK
et al (1983)159. Il s’agit d’un peptide multifonctionnel qui contrôle la prolifération, la
différenciation et d'autres fonctions dans de nombreux types de cellules 160. Ce peptide est
constitué de 112 résidus d’acides aminés dérivés par clivage protéolytique du C-terminal d’une
protéine précurseur. Ces protéines interagissent avec une famille conservée de récepteurs de
protéine kinase spécifiques de la sérine / thréonine à la surface des cellules et génèrent des
signaux intracellulaires à l'aide d'une famille de protéines conservées appelées SMAD. Les
SMADs phosphorylés s'associent à SMAD 4 et se transloquent dans le noyau, où ils participent
à la transcription génique 161. Ainsi, les molécules de TGFβ stimulent in vitro les chondrocytes
pour produire une MEC compatible avec le cartilage articulaire, tout en agissant contre l'activité
catabolique des médiateurs inflammatoires, tels que l'interleukine 1 (IL1) 162.
Il faut rappeler que la famille du TGF-β comprend cinq membres (TGF-β1–5), qui sont
principalement produits dans les os et le cartilage. Divers membres ont été testés en tant
qu'inducteurs chondrogéniques au cours de l'ingénierie du cartilage in vitro, soit seuls ou en
association avec des échafaudages tridimensionnels, ou soit en tant que facteurs solubles ou
53
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
même comme approche de thérapie génique. La communauté scientifique est d’accord pour
dire que les milieux supplémentés avec le TGFβ induisent la prolifération et la différenciation
chondrogénique des cellules souches/progénitrices mésenchymateuses, conduisant à la fois à
une régulation à la baisse des gènes du collagène de type I, puis à une régulation à la hausse des
gènes du collagène de type II et de l'aggrécane 163. Avec les TGFβ-2 et TGFβ-3, ces molécules
provoquent un dépôt plus précoce et plus important du collagène de type II et une accumulation
deux fois plus importante de protéoglycanes 164, contrairement au TGFβ-1. D'autre part, les
ligands du TGFβ inhibent la maturation des chondrocytes hypertrophiques et stabilisent le
phénotype pré-hypertrophique des chondrocytes 165. C’est pourquoi, afin de différencier les
cellules souches mésenchymateuses humaines en chondrocytes hypertrophiques, il est conseillé
de retirer le TGFβ du milieu 165. Ces morphogènes interagissent les uns avec les autres pour
contrôler de nombreux aspects de la biologie cellulaire, notamment la prolifération, la
différenciation, la sécrétion de la MEC et l’apoptose des cellules.
Néanmoins, l’utilisation des CSMs comme source alternative de cellules pour la
réparation du cartilage articulaire présente également plusieurs limites, telles que : un faible
nombre de cellules de CSM dans la moelle osseuse ou d’autres tissus du donneur; la nécessité
de les caractériser avec soin; la présence de plusieurs sous-populations de cellules; le contenu
de cellules déjà engagées; la procédure de différenciation chondrogénique qui prend du temps;
l'instabilité du phénotype chondrogénique; et la différenciation incontrôlée dans d'autres
lignées, en particulier eu égard à l'influence des médiateurs inflammatoires dans le cartilage
lésé 143. De plus, le néocartilage fabriqué à partir de CSM serait épigénétiquement moins
semblable au cartilage autologue que le cartilage artificiel produit à partir de chondrocytes
primaires 166. En raison de ces limitations, il est difficile de mettre en place une réglementation
sûre pour utiliser les CSMs dans une application clinique étendue.
De toute évidence, il existe un besoin crucial d’évaluer en profondeur les
caractéristiques moléculaires du cartilage articulaire pour comprendre les changements
biochimiques et adapter les constructions de génie tissulaire. Dans le contexte de l'ingénierie
tissulaire, la surveillance des propriétés biologiques des cellules et / ou de ses modifications
associées fournit des informations importantes concernant l'état des cellules, telles que la
viabilité et l'état fonctionnel de la cellule 167. L’analyse d’une telle organisation
microstructurelle est d'un grand intérêt pour comparer diverses constructions de tissus et
déterminer les facteurs les plus pertinents qui permettent le développement de tissu issus des
constructions géniques le plus proche du tissu natif.
54
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1.2 Les techniques d’évaluation du cartilage articulaire et des constructions
de génie tissulaire
Pour évaluer la santé, la pathologie et l'efficacité thérapeutique du cartilage articulaire, il
est impératif que des méthodologies d'évaluation appropriées soient développées et utilisées 23.
La demande clinique toujours croissante de tissus et de cellules de remplacement a conduit à
une expansion rapide des capacités de recherche dans le domaine de l'ingénierie tissulaire et de
la médecine régénérative. L'examen histopathologique reste la technique de choix pour le
diagnostic des échantillons de tissus malades, bien qu'il soit très subjectif et repose sur un
ciblage de biopsie à l'aveugle 168. La surveillance de la croissance des tissus en culture cellulaire
reste un défi majeur malgré les techniques analytiques actuelles qui permettent d’évaluer de
nombreux facteurs tels que l'expression de l'ARN, l'expression des protéines
intracellulaires/extracellulaires et les composants exogènes. Récemment, la spectroscopie
Raman a fourni une technique d'analyse rapide, puissante et non destructive et sans marquage
pour l'identification objective et la classification des maladies 169–171. En particulier, les
changements dans la structure chimique et la composition moléculaire qui se produisent à la
suite d'une maladie peuvent être évalués qualitativement à partir du spectre Raman. L’un de ses
développements les plus intéressants est l’application dans les cellules et les tissus. L’imagerie
cellulaire Raman permet l’observation de ces changements biochimiques intracellulaires et
extracellulaires.
Dans cette partie, après une brève description des techniques dites conventionnelles, nous
nous intéresserons davantage sur les techniques optiques innovantes, en particulier la
microscopie confocale Raman, dont nous nous sommes servis pour la conduite de nos travaux.
Les techniques microscopies multiphotonique et à force atomique (AFM) sont décrites dans le
chapitre de matériel et méthodes.
1.2.1 Les moyens classiques
La morphologie globale du cartilage articulaire est utilisée depuis longtemps pour
discerner la santé et la pathologie des tissus. De ce fait, plusieurs techniques d’imageries allant
de l’arthroscopie à l’IRM ont été développées pour évaluer cliniquement la qualité du tissu
cartilagineux en fonction de la quantité du dommage et de l’état pathologique. La morphologie
macroscopique peut être évaluée par arthroscopie, bien que des changements microscopiques
ou infimes de la santé du cartilage ne soient souvent pas visibles lors d'une inspection
55
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
macroscopique. Contrairement aux simples radiographies qui ne donnent qu’une image
indirecte de l’épaisseur du cartilage articulaire, l’IRM par exemple donne une vision directe
sans utiliser les rayons X et sans nécessiter d’injection d’un produit de contraste. Avec le
progrès des technologies, elle fournit désormais une vision de plus en plus précise du cartilage.
A côté de ces nouvelles découvertes, d’autres techniques telles que l’arthroscanner
(arthrographie par injection d’un produit de contraste dans l’articulation suivie d’un examen
tomodensitométrique à rayons X) et l’arthro-IRM (arthrographie suivie d’une IRM) ont été
développées et autorisent une vue en coupes fines et en trois dimensions du cartilage dont les
contours sont soulignés par le produit de contraste injecté. Dans le cadre de la recherche, l’IRM
fournit non seulement une information sur la morphologie du cartilage, mais aussi sur sa
composition. Ainsi, différentes séquences IRM reflètent son contenu en eau, l’organisation du
réseau de fibrilles de collagène et l’état des protéoglycanes qui le composent. Cependant,
lorsqu’il est question d'examen très précoce de modifications de la composition de l'arthrose
dans l'AC, ni l'IRM ni le scanner ne fournissent une sensibilité adéquate.
Dans le cadre de la recherche, cependant, une pléthore de techniques d'évaluations
histologiques, ultrastructurales et biochimiques ont vu le jour et permettent de caractériser le
cartilage articulaire, avec des méthodes supplémentaires en développement continu. Ces
techniques permettent par exemple de visualiser des objets subcellulaires tels que l'ADN. Ainsi,
des marqueurs tels que le bleu d'Alcian, le bleu de toluidine, la safranine O (avec Fast Green)
et le rouge Sirius (dans l'acide picrique saturé) sont régulièrement utilisés, ainsi que des
combinaisons telles que le pentachrome de Movat et l'hématoxyline et l'éosine pour démontrer
histologiquement l'emplacement du glycosaminoglycane, du collagène et d'autres composants
de la matrice extracellulaire dans le cartilage articulaire. En utilisant la technique
immunohistochimique, la distribution de collagènes et de glycosaminoglycanes spécifiques
peut être décelée et, mettant en évidence la présence et la distribution relative du collagène de
type I ou II. Les quantités importantes de collagène de type I ne sont pas observées dans le
cartilage articulaire hyalin, mais dans le fibrocartilage. Aussi, la quantification biochimique du
collagène et des glycosaminoglycanes (GAG) extraits de coupes de tissus en série a également
permis de mieux comprendre la distribution dépendant de la profondeur de ces principaux
constituants de la MEC. Cependant, la résolution spatiale pouvant être obtenue de manière
fiable est limitée 172. En milieu clinique, ces méthodes sont principalement utilisées sur les tissus
malades biopsisés. Ainsi, les techniques d'imagerie non destructives, qu'elles soient invasives
ou non invasives, font partie de la première ligne d'évaluation de la santé du cartilage.
56
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Les évaluations histologiques et immunohistochimiques du cartilage natif et artificiel
jouent un rôle déterminant dans l’évaluation de la distribution spatiale des principaux
composants de la MEC dans les constructions d’ingénierie du tissu cartilagineux et dans
l’orientation des efforts visant à élaborer des stratégies pour recréer la complexité du tissu natif.
Les méthodes actuelles, y compris le dosage immuno-enzymatique (ELISA), la réaction en
chaîne par polymérase et le transfert Western (suivi de la spectrométrie de masse) sont
inefficaces, invasives et destructives 173. Ces méthodes restent de nature qualitative ou semi-
quantitative, nécessitant un étiquetage et se prêtant difficilement à des analyses approfondies
précises de la distribution des composants de la MEC 7,8.
Ces dernières années, de nombreuses autres méthodes d'imagerie non invasive et sans
étiquette telles que, notamment la microscopie à lumière polarisée (PLM), la spectroscopie
infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR), la tomographie par cohérence optique (OCT), la
génération de seconde harmonique (SHG) et la microscopie à force atomique (AFM), ont été
Figure 19 : Structure zonale du cartilage articulaire. Histologie du cartilage articulaire de
lapin adulte pleine épaisseur (~ 1 mm) du genou (10 ×), indiquant des changements dans la
morphologie cellulaire avec la profondeur. La coupe histologique représente une tranche
prise perpendiculairement à la surface du cartilage, avec des protéoglycanes de coloration
au bleu de toluidine (violacé), des noyaux de coloration à l'hématoxyline (bleu) et des
structures de protéines de coloration à l'éosine (rose / rouge) (Kyriacos et al, 2016).
57
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
développées pour une évaluation plus détaillée du cartilage articulaire 9–12. Toutes ces
techniques sont encore au stade expérimental et ne sont pas utilisés en clinique de routine. Par
exemple, la microscopie infrarouge est une technique d’imagerie chimique utilisant un
rayonnement infrarouge transmis ou diffuse pour obtenir des images. Ce rayonnement provient
des états vibratoires des molécules. La difficulté avec cette technique est sa résolution spatiale
de longueur d’onde infrarouge (10-20 µm) qui semble élever pour observer des structures
subcellulaires. De plus, l’eau parait opaque dans l’infrarouge, de sorte que les molécules
biologiques sont impossibles à étudier. Or, une sensibilité moléculaire élevée est une condition
indispensable pour améliorer non seulement le diagnostic de l’arthrose, mais également pour
permettre une meilleure compréhension des changements biochimiques au cours du
développement et de la progression de l’arthrose pour une meilleure prise en charge.
En tout état de cause, il existe un besoin pressant de méthodes de surveillance non-
invasive et non destructrice, avec une résolution spatiale importante, car la qualité des
constructions de génie tissulaire peut potentiellement être suivie en temps réel pendant la
culture. Ainsi, les méthodes non invasives qui permettent l’observation de la formation de tissus
et les changements dans le phénotype cellulaire, basés sur la microscopie chimique, comme la
microscopie confocale Raman sont un outil intéressant pour étudier les constructions de génie
tissulaire. En effet, contrairement aux méthodes conventionnelles qui ne donnent que des
informations sur la présence de composés spécifiques, la micro-spectroscopie Raman fournit
une « empreinte » spectroscopique représentant l’ensemble de la composition moléculaire des
échantillons d’intérêt 14. Ainsi, l’utilisation de cette méthode de microscopie à haute résolution
permet non seulement d’observer la morphologie des cellules et des tissus, mais d’extraire une
richesse d’informations moléculaires (c’est-à-dire une conformation biochimique spécifique
des protéines, des glucides, des lipides, des acides nucléiques, etc..) dans des cellules et des
tissus utilisant des biomolécules endogènes comme contraste et avec une résolution spatiale
submicrométrique. De plus, comme la diffusion Raman peut être décrite par un tenseur de
polarisabilité, contrôler la polarisation de l’incident et la lumière détectée permet d’extraire des
informations structurelles 15.
58
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1.2.2 Microscopie confocale Raman
La microscopie confocale Raman est une technique de spectroscopie vibrationnelle qui
avait été utilisée pour sonder de manière optique les modifications moléculaires associées aux
tissus malades 174,175. Elle a été décrite pour la première fois en 1928 par deux chercheurs
Indiens, Krishnan et Râman, qui ont reçu le prix Nobel deux ans plus tard 176,177. La
spectroscopie Raman, dont le principe repose sur un phénomène de diffusion, est une technique
d’analyse sans contact, sans rayon, non destructive et sans aucune préparation de l’échantillon
178, qui permet la collecte d’informations aussi bien quantitativement que qualitativement.
L'effet Raman est basé sur l'interaction de la lumière avec les liaisons chimiques d'un
échantillon. En raison des vibrations des liaisons chimiques, cette interaction provoque un
déplacement d'énergie dans la lumière diffusée sur le dos qui apparaît comme un spectre Raman
unique détecté par des méthodes spectroscopiques. Avec cette technique, les composés
chimiques et moléculaires de l'échantillon sont identifiés et des caractéristiques
supplémentaires telles que la quantité relative d'un composant spécifique, les états de contrainte
et de déformation, la cristallinité ou les types de structures polymorphes peuvent être
déterminées.
L'imagerie confocale Raman combine la spectroscopie Raman avec un microscope
confocal. Ainsi, la distribution spatiale des composés et toutes les propriétés mentionnées
précédemment dans un échantillon peuvent être visualisées. La microscopie confocale Raman
haute résolution acquiert les informations d'un spectre Raman complet à chaque pixel de l'image
et atteint une résolution latérale à la limite de diffraction (1/2 de la longueur d'onde d'excitation).
La technique Raman est non destructive, non invasive et sans contact et sans étiquette 179–181.
Contrairement à la microscopie infrarouge (IR), l'imagerie Raman est une méthode standard
applicable dans un environnement aqueux. Il présente de nombreux avantages par rapport à la
microscopie à fluorescence 182 :
- Premièrement, la spectroscopie Raman ne nécessite aucun marquage externe et utilise la
polarisabilité induite (dérivé du tenseur de polarisabilité par rapport aux coordonnées
normales) comme contraste pour générer les spectres vibrationnels. Ainsi, les images
Raman sans étiquette reposent sur le contraste fourni par les différents spectres vibrationnels
dans diverses régions du tissu biologique.
- Deuxièmement, les signatures biochimiques des molécules sont beaucoup plus riches car
chaque composant du tissu, comme les acides nucléiques, les lipides, les chromophores
59
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
biologiques et les protéines, fournit son propre modèle de comportement vibrationnel dans
différentes régions spectrales.
En outre, la nouvelle génération de microscopes Raman peut offrir une puissante
méthode d'analyse d'échantillons non destructive et sans contact. L'un des plus gros avantages
est l'utilisation d'une conception de microscope Raman confocal 179,183. Ce qui permet d'analyser
une très petite zone ou un volume d'échantillon jusqu'à l'échelle micrométrique. La combinaison
de cette analyse micro Raman et de la mise au point automatisée, le mouvement XYZ, permet
la production d'images «chimiques» d'un échantillon avec une résolution spatiale plus élevée
que jamais.
Associée à un système confocal, le microscope Raman autorise un balayage en
profondeur avec un haut niveau de résolution. En effet, le microscope Raman focalise un
faisceau laser vers le bas sur un petit volume de l'ordre du μm3. Un mode confocal est obtenu
en plaçant une ouverture à l'arrière du plan focal du microscope. Cette ouverture améliore à la
fois la résolution latérale et axiale. Ce qui permet d’obtenir un profil non destructif en
profondeur. La résolution en profondeur dépend de deux facteurs : le volume de spot du laser
et la façon dont les photons passent par l’ouverture confocale du spectromètre. La résolution en
profondeur est définie comme une différence entre la profondeur maximale et minimale de mise
au point. La résolution en profondeur, DR est définie par la formule :
Où n correspond à l'indice de réfraction du milieu d'immersion, λ à la longueur d'onde laser et
NA à l'ouverture numérique de la lentille de focalisation. Pour un laser avec une longueur
d’onde de 532 nm et un objectif de n = 1,46 NA = 1, la résolution en profondeur est calculée à
1553 nm. Il faut souligner que pour certains échantillons, la résolution en profondeur peut ne
pas être constante sur l’ensemble de l'échantillon.
Par exemple pour les échantillons non homogènes (comme le cas du cartilage
articulaire), la distribution de molécules spécifiques est importante. Ces informations peuvent
être obtenues avec un microscope Raman qui fournit des images réalisées dans une bande
DR
=
2.2 nλ
π (NA)2
60
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Raman caractéristique de la molécule d'intérêt. En imagerie Raman, les caractéristiques de
diffusion intrinsèque d'une molécule spécifique sont utilisées pour visualiser la distribution de
cette molécule dans un échantillon. Par conséquent, aucun marqueur extrinsèque n'est
nécessaire, ce qui fait de la micro (spectro) scopie Raman une technique très utile pour
« l'imagerie chimique » des cellules et des tissus vivants dans des conditions physiologiques.
A ce titre, de nombreuses études ont été réalisées à partir de la microspectroscopie Raman sur
des chromosomes 184, cellules sanguines 185,186 et tissus 187, ainsi que des images Raman
d'échantillons biologiques 188,189. Plus récemment, une étude conduite par Bergholt (2016) a mis
en évidence de nouvelles zones dans le cartilage articulaire172.
En raison de sa sensibilité, la microscopie confocale Raman apparait comme le meilleur
compromis pour étudier à la fois l’organisation structurelle et la distribution spatiale des
principaux marqueurs biochimiques au sein du cartilage articulaire et suivre la maturation du
cartilage artificiel.
1.2.2.1 Principe de diffusion Raman
La technique de diffusion Raman est basée sur différents types de diffusion de la lumière
monochromatique, généralement à partir d'un laser dans le visible, le proche infrarouge ou le
proche ultraviolet. Sur la figure 18, les diagrammes de niveau d'énergie moléculaire illustrent
les processus de base impliqués dans la diffusion de la lumière et l'absorption de la lumière par
les vibrations moléculaires dans la région infrarouge du spectre. L'état fondamental
électronique et l'état excité électronique sont indiqués respectivement par e0 et e1. Les états
vibrationnels sont indiqués par v1, v2, v3, etc.
Lorsque la lumière de fréquence ω1 interagit avec la matière, la majeure partie de la
lumière n'est pas affectée, seule une très petite fraction de lumière est diffusée (figure 18 (a)).
Dans le Rayleigh, processus de diffusion de la lumière, un photon incident à la fréquence ω1
interagit avec une molécule et aboutit à un photon diffusé qui a la même fréquence que le photon
incident, mais peut-être une direction différente, figure 18 (c). Dans le cas où l'état final après
diffusion n'est pas égal à l'état d'origine, par exemple du fait de la présence d'états de rotation
ou de vibration dans les molécules, alors le processus de diffusion de la lumière s'accompagne
d'un décalage de la fréquence ωk par rapport à la fréquence incidente. Ce type de diffusion de
la lumière à partir d'états moléculaires est appelé diffusion Raman. La lumière diffusée Raman
avec une fréquence inférieure à la fréquence incidente (ω1 - ωk) est appelée diffusion Stokes
61
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Raman (Figure 18 (d)) et la lumière diffusée Raman avec une fréquence plus élevée que la
fréquence incidente (ω1 + ωk) est appelée diffusion anti-Stokes Raman (Figure 18 (e)).
Figure 20 : Diagrammes de niveau d'énergie moléculaire illustrant l'interaction des molécules
avec les photons, (a) diffusion élastique et inélastique par la molécule, (b) absorption
infrarouge et émission de fluorescence, (c) diffusion Rayleigh, (d) diffusion Stokes Raman et
(e) Diffusion Raman anti-Stokes.190
Lorsqu'une molécule est excitée par un photon par un processus d'absorption, un photon
peut être réémis pendant la relaxation d'énergie (figure 18 (b)). Ce processus est connu sous le
nom d'émission de fluorescence, qui se produit principalement du côté Stokes de la fréquence
d'excitation. Le délai entre le processus d'absorption et le processus d'émission correspond à la
durée de vie de l'émission de fluorescence, qui est généralement de l'ordre de la nanoseconde.
La distribution spectrale de l'émission de fluorescence moléculaire est donc généralement large.
La bande d'émission enveloppe de nombreuses transitions qui se chevauchent, ce qui en
pratique rend difficile la distinction des états vibrationnels. La réponse inhérente d'une molécule
dans une expérience de diffusion Raman est d'environ 4 à 6 ordres de grandeur plus courte que
dans un événement de fluorescence.
En conséquence, la distribution spectrale de la diffusion Raman se compose de raies
d'émission étroites, qui révèlent directement la fréquence et la largeur de bande des modes
normaux individuels de vibrations atomiques dans les molécules. La spectroscopie d'émission
de fluorescence des chromophores naturels est une technique très informative, mais seul un
nombre relativement faible de composés naturels dans les cellules sont réellement fluorescents.
Cela peut être surmonté par l'utilisation de marqueurs fluorescents, qui doivent ensuite être
attachés aux molécules d'intérêt. Les pics Raman sont spectralement étroits et peuvent dans de
nombreux cas être associés à la vibration d'une liaison chimique particulière (ou d'un seul
62
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
groupe fonctionnel) dans la molécule 191–194. Puisque toutes les molécules présentent un spectre
de diffusion Raman unique, la microscopie Raman est une puissante technique d'imagerie
chimique non invasive et sans étiquette. La micro-spectroscopie Raman et de l'imagerie Raman
apparait donc comme une technique analytique pour étudier la distribution des composés et des
processus chimiques dans les cellules ou tissus.
1.2.2.2 La Microscopie Confocale Raman et ses applications biologiques
Le corps humain est composé principalement d’eau, de protéines, d’acide nucléique, de
lipides et de glucides. Par conséquent, tout changement dans l’organisme à la suite des
maladies, entrainerait des modifications biochimiques de l’un ou l’ensemble de ces composants.
En pathologie, il existe un besoin important d’étudier la structure et les modifications
moléculaires dans les échantillons des tissus. Avec la microscopie Raman, l'intensité et le profil
des pics Raman fournissent des indications sur les quantités relatives d'espèces chimiques
présentes dans l'échantillon, ainsi que sur leurs environnements de liaison 16. Si les spectres
vibratoires sont sensibles à la structure de ces composants, ils doivent donc évoluer avec l’état
malade.
En raison de sa sensibilité moléculaire, la spectroscopie Raman a d'abord été utilisée
pour révéler les structures moléculaires de produits chimiques purs. Les premières études sur
les cellules vivantes ont été réalisées à l'aide d'un spectroscope Raman couplé à un microscope
195. Dès son introduction dans le domaine biomédical, la spectroscopie Raman a été utilisée
pour caractériser les modifications dans la composition d'échantillons de cartilage articulaire à
différents degrés de maladie (d'après le score de Mankin) 196,197. A partir du pic à 1063 cm-1
(étirement symétrique du mode vibrationnel au sulfate), ils ont pu quantifier la teneur en
protéoglycanes (notamment l’aggrécane) dans le cartilage, dont la diminution associée à
l’arthrose. Certains auteurs utilisant la microscopie Raman ont été capables de suivre les
changements biochimiques se produisant dans le cartilage articulaire au cours du vieillissement
et/ou de l’ostéoarthrite 198, et caractériser la morphologie interne du tissu cartilagineux 172.
Les applications biomédicales de la technologie Raman ont augmenté de manière
explosive ces dernières années, passant l'étude de la structure des protéines et de l'ADN 199, aux
activités chimiques tant au niveau cellulaire que tissulaire, le diagnostic du cancer et la
recherche sur les médicaments 200,201.
De façon pratique, les spectres Raman renseignent sur l’organisation locale selon le type
de liaison chimique et le mode de vibration au travers des formes des pics. La première
63
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
information donnée par la microscopie Raman concerne la nature des liaisons chimiques et le
transfert de charge. L’intensité est très faible pour des liaisons ioniques et forte pour des liaisons
covalentes, d’autant plus que le nombre d’électrons mis en jeu dans la liaison chimique est
élevé. Ainsi, plusieurs renseignements peuvent être collectés à partir d’un spectre Raman 178,202,
telles que :
- Sa position dans le spectre (reliée à la fréquence d’un mode de vibration et renseigne
sur les espèces chimiques en présence),
- Son intensité (qui peut être relié à la concentration de l’espèce),
- La largeur des pics à mi-hauteur qui fournit des informations sur la structure,
- Son état de polarisation (renseigne sur la symétrie du mode correspondant),
- Son profil (qui permet l’étude de mouvements ou d’interactions en phases considérées)
- Leur déplacement qui est fonction de l’état de contrainte et/ou de température.
Les vibrations sont spécifiques à la liaison moléculaire, ce qui permet de construire une
empreinte biochimique de l’échantillon 203. Ainsi, chaque échantillon biologique présente un
motif spectral typique en raison de leur composition biochimique inhérente 204. Il est important
de noter que, selon que la longueur ou l'angle de la liaison change, les vibrations sont
subdivisées en deux classes :
Étirement (symétrique et asymétrique)
Flexion (ciseaux, balancement, rotation et torsion)
Région des empreintes digitales
(empreintes moléculaires des
groupes fonctionnels)
Région des hautes fréquences
=
Vibrations de l’étirement CH
Région de silence
2800 – 3800 cm
-1
0 - 1800 cm
-1
1800 – 2800 cm
-1
Figure 21 : Spectre Raman typique du cartilage articulaire et ses différentes régions vibratoires
64
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Un spectre Raman peut être divisé en trois parties comme indiquer sur la figure 21 :
- La région < 1800 cm-1, correspondant aux empreintes digitales ou empreintes
moléculaires des groupes fonctionnels,
- La région de 1800 à 2800 cm-1 encore appelée région silencieuse et,
- La région > 2800 cm-1, correspondant à la région des hautes fréquences ou vibrations
de l’étirement C-H.
Il est intéressant de noter que les empreintes moléculaires des groupes fonctionnels
peuvent être trouvées aussi bien en dessous de 1800 cm-1 et au-delà de 2800 cm-1, ce qui est
dominé par les vibrations d’étirement C-H. La région vibratoire CH (2800 – 3800 cm-1) présente
un intérêt particulier pour les études spectroscopiques, car elle fournit des informations sur les
compositions chimiques des échantillons en raison des différences dans l’environnement des
liaisons CH 13.
Toutes organisations des liaisons chimiques et leurs perturbations sont transcrites par la
forme des pics. Les bandes spectrales (position des pics) dans les spectres vibratoires sont spécifiques
aux molécules et fournissent des informations directes sur la composition biochimique.
Dans le cartilage articulaire, les bandes Raman sont caractérisées par quatre modes
vibratoires représentés par :
- Les structures d’amide III (1200-1280 cm-1) ;
- Les modes de flexion des liaisons C-H (1447-1452 cm-1) ;
- Les structures d’amide I (1600-1720 cm-1) ;
- Les modes d’étirement de la liaison C-H (2840-2986 cm-1)
65
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Raman Shift [1/cm ]
18001750170016501600155015001450140013501300125012001150110010501000950900850800750700650600
Intensity
1,02
1
0,98
0,96
0,94
0,92
0,9
0,88
0,86
0,84
0,82
0,8
0,78
0,76
0,74
0,72
0,7
0,68
0,66
0,64
0,62
0,6
0,58
0,56
0,54
0,52
0,5
0,48
0,46
0,44
Région amide III, Col II
Lipides/protéines = CH2/CH3 1451 cm
-1
Région amide I, Col I
GAGs 1363 cm-1
GAGs 1383 cm-1
GAGs 1065 cm-1
GAGs 1130 cm-1
GAGs 1079 cm-1
Proline 945 cm-1
Phénylalanine 1007 cm-1
Hydroxyproline 861-885 cm-1
Phénylalanine 1040 cm-1
C-
C 975 cm-1
Tyr bk (O
-P-O) 828 cm
-1
Trp 758 cm-1
bk (O
-P-
O) 1094/1100 cm-1
Phe 622 cm-1
Tyr 644 cm
-1
G, T (DNA/RNA) 669 cm-1
Tyr, Trp 1618 cm-1
A, G (DNA/RNA) 1577 cm-1
A, G (DNA/RNA) 1488 cm-1
C=O 1743 cm-1
Raman Shif t [1/cm ]
36503600355035003450340033503300325032003150310030503000295029002850036
Vibrations OH
Vibrations CH
Figure 22 : Spectre Raman caractéristique du cartilage articulaire. Bandes Raman dans la région de 600 à 1800 cm-1 et 2800 à 3670 cm-1
66
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Pics Raman
(cm-1)
ASSIGNATIONS MOLECULAIRES
ADN/ARN
Protéines
Lipides
622
C-C tw, Phe
644
C-C tw, Tyr
669
G, T
758
Trp
787
U, T, C ring br, O-P-O stretch
828
O-P-O stretching
Tyr
857
ν(C-C), Pro, Hydro, Tyr (Col I)
878
ν(C-C), Hydro, Trp
C-O-C ring / C-C-N+ sym str
885
(C-O-C) skeletal mode
937
C-C stretching, α-helix
C-O-C glycodides
946
ν(C-C) stretch backbone
975
Ribose vibration
C-C backbone
= CH bending
1007
νs(C-C) Phenylalanine
1040
C-H in-plane Phe
1063
PO
2
− stretching
C-C sk str random conform
νs(S=O) (GAG)
1079
C-C or PO2 str
v(C-C) or v(C-O)
1094
Phosphodioxy (PO2−) groups
v(C-C)-lipids
1130
C-N stretching
ν(C-C) sk of acyl bk/ C-O str
1155
C-C, C-N stretching
1171
δ(C-H), Tyr or Phe
1205/7
ν(C-C
6
H
5
), Trp, Phe, Hydro, Tyr
1246
Amide III ν(C-N) and δ(N-H)
1271
C-N stretch /Amide III (α-helix)
δ (=C-H) (phospholipids)
1308
CH3/CH2 tw, wag &/or bend
C-N asym str/ CH3/CH2 tw, wag
1338
A, G (ring breathing)
Trp, δ (CH3) δ (CH2) twisting
1345
G
CH
3
, CH
2
wagging
CH deformation
1363
G
Trp
1383
CH3 band
δ (CH3) symmetric
1407
νsCOO−
1421
A, G, CH deformation
CH deformation
CH deformation/ CH2 scissoring
1450
δ(CH2) deformation
δ (CH2) scissoring
1484/8
G, A (ring breathing modes)
1554
ν(C=C), Trp, v(CN) & δ (NH)
amide II
COO−
1560/8
G, A (ring breathing modes)
Trp, Tyr, amide II
COO−
1577
G, A (ring breathing modes)
1587/90
Phe, Hydroxy
ν(C=C) aromatic ring (Phe, Tyr)
1611/8
ν(C=C), Trp, Tyr
1656
T, G, C (ring breathing modes)
Amide I (α-helix)
ν(C=C)cis
1668
Amide I ν(C=O)
ν(C=C) trans
1743
ν(C=O)
2806-3035
C-H vibrations
CH
2
symmetric stretch
3032-3670
ν(OH)
Tableau II : Table des pics Raman du cartilage articulaire. Abréviations: (p) Protéine, (l) Lipide, (d) ADN / ARN, (A)
Adénine, (T) Thymine, (G) Guanine, (C) Cytosine, (U) Uracile, (Phe) Phénylalanine, (Tyr) Tyrosine, (Trp) Tryptophane,
(bk) Backbone, (Def) Deformation, (Tw) Twist, (Sym) Symmetric, (asym) Asymmetric et (Str) Stretching, (Rand) Random
(Bergholt et al, 2017 ; Matthiew et al,2010)
67
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1.2.3 Impacts sur la sphère oro-faciale
Directement impliquée dans l’élaboration et le contrôle du mouvement mandibulaire,
l’articulation temporo-mandibulaire (ATM) est en prise directe avec l’expression de la plupart
des composants du comportement manducateur. L’ATM est considérée comme l’articulation la
plus mobile de toutes les articulations humaines. Il s'agit d'une double articulation condylienne
ou diarthrose bicondylienne paire, symétrique, agrémentée d'un ménisque, dont, en réalité, les
deux arcades dentaires en font une articulation temporo-maxillo-dentaire (Frey) ou encore une
articulation cranio-bicondylo-occlusale (Gola). Sa dynamique est coordonnée par le système
neurosensoriel 205. Contrairement aux autres articulations de l’organisme, l’ATM est une
articulation bicondylaire à surfaces convexes et à disque interposé. Elle a pour fonction
essentielle de permettre les mouvements, notamment les mouvements d'élévation et
d’abaissement de la mandibule, les mouvements de diduction (Chung Kau How, 2004), ce qui
permet à l’appareil manducateur d’entrer en jeu afin d’en assurer les fonctions de mastication,
de déglutition, de phonation, etc… L’étude de son organisation et de ses manifestations
cliniques est très importante pour identifier les pathologies inflammatoires dégénératives
(arthrite traumatique aigue, arthrite rhumatoïde, ostéoarthrite, etc..) y afférentes.
Articulation temporo-mandibulaire
Cavité glénoïde
Le ménisque ou
disque articulaire
Muscles ptérygoïdiens
Condyle
Freins discaux
Figure 23 : Mise en évidence de l’ATM et son disque
68
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1.2.3.1 Caractérisation du disque articulaire de l’ATM
Le disque articulaire est un composant essentiel de l’ATM. Anatomiquement, le disque
articulaire se situe trouve entre le processus condyloïde et la cavité glénoïde. Il est de nature
fibrocartilagineux, responsable de la résolution de l'ajustement incongru entre les deux surfaces
articulées et renforce ainsi la stabilité de l'articulation. Sur le plan immunohistochimique, le
disque articulaire de l’ATM est constitué d'un mélange de cellules de type fibroblastique et de
chondrocyte qui sécrètent une matrice extracellulaire faite principalement de collagène de type
I contrairement au collagène de type II trouvé dans le cartilage hyalin 206, de
glycosaminoglycanes, notamment le sulfate de chondroïtine et le sulfate de dermatane qui y
sont en quantité significativement plus faible que dans le cartilage hyalin.
De forme semblable à une lentille biconcave aplatie verticalement avec un bourrelet
périphérique et un centre aminci, le disque permet de séparer, protéger et stabiliser le condyle
dans la fosse mandibulaire pendant les mouvements fonctionnels. Il partage l’articulation
synoviale en deux compartiments l’un supérieur dit disco-temporal et l’autre inférieur dit
condylo-discal. Chacun de ces compartiments est le siège de mouvements particuliers au cours
des mouvements mandibulaires 207. Le fonctionnement de cette articulation est compliqué du
fait qu’il existe deux ATM ne fonctionnant pas de manière symétrique, mais en synergie l’une
par rapport à l’autre. Dépourvu de fibres nerveuses et de vaisseaux sanguins, cette composition
lui permet de résister à de lourdes forces sans créer de stimulations douloureuses. En raison de
ses propriétés viscoélastiques, le disque articulaire aide à la répartition des charges soumises au
niveau de l'ATM 208.
L’architecture fibreuse du ménisque est très particulière : elle évolue avec la croissance
par une densification progressive, passant d’un stade de tissu conjonctif assez lâche à un tissu
constitué de faisceaux très serrés, fortement imbriqué les uns avec les autres, lui permettant
ainsi de résister à des forces de compression de 180 Kg/cm2, pouvant aller jusqu’à 220 /².
209. Il adhère à la face profonde de la capsule articulaire par les ligaments méniscaux antérieurs
et postérieurs. Les mouvements du ménisque sont solidaires du condyle grâce à ces ligaments,
ainsi qu’une partie des fibres du muscle ptérygoïdien latéral qui trouve leur origine sur la partie
antérieure du ménisque. Le disque avec la synoviale intervient pour réduire les effets du
frottement aux contacts.
69
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1.2.3.2 Troubles de l’ATM (dégradation du disque)
L’ATM est l’articulation la plus complexe, mais fragile de l’organisme, amenée à
supporter des pressions incroyables. L'articulation temporo-mandibulaire (ATM) est depuis
longtemps établie comme une source de pathologie 210. Les dysfonctionnements patho-
anatomiques de l'ATM ont été définis comme des troubles temporo-mandibulaires (TMD). Les
surfaces articulaires de l'ATM sont très incongrues et sont constituées de fibrocartilage et non
de cartilage hyalin comme les autres articulations synoviales. L'ATM est sujet à des
changements dégénératifs, bien que l'os temporal et l'espace articulaire supérieur subissent
généralement moins de dégénérescence que le condyle mandibulaire et l'espace articulaire
inférieur. Des changements dégénératifs locaux et étendus peuvent survenir. Lorsque des
modifications locales se produisent, l'aspect latéral du tubercule articulaire de l'os temporal est
le plus susceptible d'être affecté, mais aucune partie du condyle mandibulaire n'est plus à risque.
Des changements importants peuvent aboutir à une perte totale de cartilage articulaire.
L'arthrose (OA) de l'articulation temporo-mandibulaire (ATM) est une maladie dégénérative
caractérisée par la perte du réseau de la matrice extracellulaire (MEC) du cartilage condylien
mandibulaire, qui affecte l'os sous-jacent et les composants musculo-squelettiques
environnants. L’ATM subit régulièrement des troubles variés qui surviennent le plus souvent
chez les adultes.
Dans de nombreux rapports, il est rapporté qu’environ un quart de la population présente
un trouble de l’articulation temporo-mandibulaire (TATM). D’autres rapports annoncent
qu’entre 3,6 et 7% de la population ont une TATM suffisamment importante pour être traitable
211,212, mais seulement 3-4% des gens recherchent un traitement 213. Une méta-analyse réalisée
par Al-Jundi et ses collaborateurs en 2008 a estimé à 16% les besoins de prise en charge des
TATM chez les adultes 214. Actuellement, les dentistes et les physiothérapeutes fournissent des
services aux patients pour TATM.
1.2.3.3 Relation entre l’occlusion et l’ATM
Si l’ATM est une entité anatomique en elle-même, dans son fonctionnement, elle
appartient à l’appareil stomatognatique et les mouvements à son niveau ne sont en fait que la
conséquence des déplacements dentaires d’où l’importance de l’occlusion. Son efficience
dépend de l'harmonie et de l'équilibre de tous ses différents composants. Par conséquent, la
moindre pathologie à ces niveaux peut entrainer de graves perturbations tant physique 215,216
que psychique, et parfois même esthétique.
70
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Selon Blum Charles 217, la présence de troubles de l’articulation n’est pas
systématiquement liée à l’existence d’anomalies occluso-posturales. A l’inverse, un trouble de
l’ATM affecte la position du disque articulaire et la trajectoire de la mandibule pendant les
mouvements d’ouverture et de fermeture buccale et, peut avoir des répercussions sur la manière
dont les dents s’articulent avec leurs antagonistes 218. A l’inverse, des désordres occlusaux tels
que des restaurations dentaires mal ajustées peuvent provoquer une altération du disque
articulaire. Ces caractéristiques occlusales participent d’abord à la bonne stabilité intra- et
interarcade, ce qui est remarquable sur le plan clinique. Les contacts dento-dentaires doivent
permettre une distribution des efforts selon le grand axe des dents. Ainsi, la relation entre
l’occlusion et l’ATM peut être mis en évidence au cours de l’examen clinique conduit par un
chirurgien-dentiste. C’est pourquoi, il apparait indispensable que lors du rétablissement de cette
occlusion par le chirurgien-dentiste, non seulement de rétablir la physiologie en respectant les
courbes de Spee et de Wilson, mais en plus d’enregistrer des informations concernant les
patients quand cela est possible (d’où l’intérêt de l’interrogatoire lors de l’examen clinique),
afin de rester le plus proche possible de l’occlusion d’origine et d’éviter une désorganisation de
l’ATM et par conséquent de l’appareil stomatognatique.
1.2.3.4 Intérêt de l’étude dans la pratique odontologique
Les fonctions les plus importantes de l'articulation temporo-mandibulaire (ATM) sont
la mastication et la parole et sont d'un grand intérêt pour l’odontologiste. Cet intérêt découle
des points de vue de la structure, de la fonction, de la symptomatologie, de la pathologie, de
l'imagerie et de l'adaptabilité. L'ATM est une articulation bicondylaire semblable aux autres
articulations de l’organisme, telle que l'articulation du genou. Cependant, les caractéristiques
qui différencient et rendent cette articulation unique sont sa surface articulaire couverte par
fibrocartilage au lieu de cartilage hyalin. Le mouvement n'est pas seulement guidé par la forme
des os, des muscles et des ligaments, mais aussi par l'occlusion des dents, puisque les deux
articulations sont reliées par un seul os mandibulaire et ne peuvent pas se déplacer
indépendamment l'une de l'autre.
L’occlusion est la manière dont les dents maxillaires s’engrènent avec les dents
mandibulaires. Autrement, il s’agit du rapport d’équilibre de 2 systèmes : système crânio-sacré
et système mandibulaire. Selon Clauzade et ses collègues 219, ces deux (2) systèmes ne sont pas
indépendants l’un de l’autre, ils participent à l’homéostasie générale et vont donc trouver des
zones d’adaptation et plus tard de compensation. Ainsi, dans les cas de serrement constant des
71
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
dents ou bruxisme fait que ces excitations fallacieuses deviennent permanentes. Les structures
incriminées n’ayant plus la possibilité temporelle de s’adapter décompensent et les troubles
cliniques apparaissent.
Les dents des secteurs latéraux ont une morphologie occlusale comportant des cuspides
et des fosses. L'inclinaison des pans cuspidiens et l'anatomie de la face occlusale (masticatrice)
ont un rapport très précis avec la forme de la cavité articulaire. Cet engrènement ou occlusion
dentaire détermine la position de la mandibule par rapport au crâne et, par conséquent, la
position des deux condyles à l'intérieur des cavités articulaires. Les buts de l’odontologiste
seront, entre autres de :
- Déceler les symptômes dont la cause est une dysharmonie du système
stomatognathique ;
- Faire le diagnostic étiologique ;
- Aborder le traitement de la façon la plus simple ;
- Réaliser des reconstructions dentaires en harmonie avec l'anatomo-physiologie du
système.
En cas de troubles de l'occlusion ou des articulations temporo-mandibulaires (ATM),
une étude détaillée de la statique et de la dynamique du système manducateur par le chirurgien-
dentiste, associée à une étroite collaboration avec un ostéopathe qualifié permet de définir quels
sont les paramètres d'un point de vue crânien et postural qui conviennent le mieux au patient,
en vue de la rééducation de ses articulations temporo-mandibulaires au moyen d'une orthèse.
Longtemps l’occlusion est considérée comme la référence principale du système
manducateur 219, à cause du fait que les dents entrent en contact et ont une fonction masticatoire.
A cet effet, l’étiopathologie du dysfonctionnement cranio-mandibulaire a été associée à
l’occlusale 219,220. Ce syndrome occlusal se révèle soit par une usure dentaire, soit par des
spasmes musculaires douloureux, soit par un dérangement interne de l’articulation temporo-
mandibulaire, soit par les uns et les autres en même temps.
Dans le domaine qui nous intéresse, certaines mesures peuvent être prises directement
sur le patient, telles que l’information spatiale fournie par les dents et distribuée au niveau de
leurs faces occlusales et donc au niveau des plans d’occlusion. En effet, les dents doivent être
d’abord examinées dans leur organisation générale, par rapport à leur référentiel neuronal qui
est l’orthogonalité, etc…) Ainsi, le rôle de l’odontologiste visera à maintenir les arcades
dentaires dans un état qui leur permet d’exercer une fonction d’occlusion correcte afin d’éviter
des troubles fonctionnels.
72
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
En cas de dommages graves du disque articulaire, la seule alternative thérapeutique
actuelle est le traitement chirurgical, en cas d'échec de la prise en charge médicale 221. Des
preuves radiologiques ont cependant, mis en évidence l’existence d'ostéoarthrose après ces
interventions 222. Devant l’insuffisance des différentes approches thérapeutiques, le recours à la
médecine régénérative, sous sa forme de l'ingénierie tissulaire, constitue une alternative
prometteuse pour la prise en charge des lésions du disque articulaire de l’ATM. A l’instar de
l’étude de Puelacher, de nombreuses études sont en cours pour caractériser les facteurs
susceptibles d’améliorer la différenciation chondrogénique de cellules, mais aussi pour
comprendre les signaux moléculaires et environnementaux qui favoriseraient la différenciation
chondrogénique et aideraient à optimiser les applications d'ingénierie tissulaire de ces cellules.
A ce jour, la recherche d'une source cellulaire idéale est sans doute l'un des plus grands
défis dans les efforts de régénération d'un disque fibrocartilagineux, mais également
l’application des techniques innovantes telles que la microscopie confocale Raman,
contribuerait énormément aux efforts de construction de disque articulaire par ingénierie
tissulaire. Le disque ATM est une structure unique au niveau cellulaire et tissulaire. L'utilisation
de cellules compétentes avec un échafaudage approprié et la fourniture à cette construction des
indices moléculaires nécessaires peuvent permettre une régénération sur mesure d'un disque
articulaire fibrocartilagineux de l’ATM qui reflète la structure pré-lésée. Par conséquent,
caractériser les signaux moléculaires et environnementaux qui conduisent à la différenciation
de la population fibrochondrocytaire serait d’un gros avantage pour atteindre cet objectif.
En somme, l’ingénierie tissulaire des tissus fonctionnels de l’ATM est une technologie
prometteuse pour le traitement des troubles de l’ATM (TMD), ce qui pourrait améliorer la vie
de millions de personnes. En raison des modèles complexes de chargement que les tissus
manipulés expérimenteront dans l’ATM, les paramètres de conception complets des tissus
indigènes sont essentiels. Au sein de l’ATM, le disque fibrocartilagineux a reçu le plus
d’attention jusqu’à présent, mais des efforts sont en cours pour l’ingénierie du cartilage du
condyle mandibulaire. L’implantation de tissus artificiels peut aider à soulager la douleur, à
restaurer la plage de mouvement et ramener le patient à la fonction normale de la mâchoire.
L’impact potentiel d’un remplacement biologique de l’ATM est encore plus important étant
donné l’absence significative d’options de traitement à long terme pour les patients atteints de
TDM.
73
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1.3 Problématique
Face à la difficulté du cartilage à cicatriser et à se régénérer, les recours en termes de
prise en charge sont désormais orientés vers des thérapies cellulaires. Cette dernière approche
s’intègre dans un domaine plus vaste, celui de l’ingénierie tissulaire, qui fait appel à des
compétences pluridisciplinaires dans les sciences physiques (biomécanique), les sciences
chimiques (biopolymères), les sciences pour l’ingénieur, les sciences du vivant (biologie
cellulaire et moléculaire) et la médecine. La régénération des tissus endommagés du cartilage
dans les différentes situations pathologiques et inflammatoires constitue dès lors un défi majeur
à atteindre. Les tentatives d'ingénierie tissulaire, qui ont progressé de manière significative,
peinent encore à produire un tissu de remplacement du cartilage avec des structures et des
propriétés mécaniques appropriées pour fonctionner correctement in vivo à la surface
articulaire. Les études d’ingénierie tissulaire du cartilage, bien qu’abondantes, sont souvent
contradictoires et laissent beaucoup d’incertitudes dans les critères de conception 21, car les
défis rencontrés par le cartilage artificiel pour une application sont très différents de ceux
rencontrés par le cartilage artificiel pour l'autre application. De plus, les statuts des
investigations animales précliniques et de la traduction clinique du cartilage artificiel sont
également à des niveaux différents pour chaque application 223.
Malgré tous les progrès de la technologie des cellules souches et des biomatériaux et
l’invention de divers systèmes de bioréacteurs, peu de choses ont progressé au-delà de cet
événement scientifiquement historique. La plupart des constructions ne parviennent pas à se
développer au-delà d'un néocartilage immature et inflexible qui manque de la durabilité
essentielle à la plupart des applications cliniques. La stagnation de la traduction en pratique
clinique peut être imputée à un certain nombre de raisons entre autres, la faible capacité de
migration des chondrocytes qui pourrait être responsable de l'infiltration ralentie du tissu de
réparation dans l'environnement de l'hôte. Aussi, les taux naturellement lents de production de
MEC de chondrocytes pourraient-ils ralentir l'intégration, ainsi que les disparités dans
l'organisation de la matrice néocartilagineuse par rapport à la disposition zonale du tissu
cartilagineux natif 4,224. Par ailleurs, la dédifférenciation des cellules chondrogéniques est un
autre problème, probablement à cause de la nature hautement fibreuse du néocartilage produit,
ce qui suggère que les cellules peuvent au fil du temps se dédifférencier en fibroblastes ou se
différencier de manière incomplète en chondrocytes.
Il est évident que si nous ne savons pas de quoi le cartilage est fait, il nous sera difficile
de savoir si nous avons créé un cartilage? Par conséquent, une étude approfondie de l'ingénierie
74
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
tissulaire permettrait de caractériser le contenu et la distribution des composants principaux de
la matrice cartilagineuse (collagène et des protéoglycanes), en plus d'obtenir des propriétés
mécaniques et de caractériser les marqueurs à titre de validation. En plus de la validation, les
études d'ingénierie tissulaire doivent examiner la structure et la fonction du cartilage pour une
conception plus stratégique des expériences 21. Il est connu que la capacité du cartilage à remplir
ses diverses fonctions est directement liée à son organisation zonale complexe en fonction de
la profondeur. La plupart des études sur la morphologie et la biologie du cartilage articulaire
décrivent une structure élaborée et hautement ordonnée, constituée principalement de trois
zones : superficielle, moyenne et profonde, selon la forme différente des cellules, la
composition biochimique de la MEC et l’orientation des fibrilles de collagène. Le collagène et
les PGs doivent être examinés car ils constituent les composants principaux de la matrice du
cartilage et sont connus pour contribuer à la performance mécanique. Ainsi, les études
mécaniques devraient quantifier le module de traction et la résistance du tissu en différents
endroits et directions.
Longtemps, les études réalisées pour étudier la composition et la qualité du cartilage
articulaire sont généralement effectuées par des méthodes invasives et destructrices telles que
des techniques immunohistologiques, moléculaires et/ou biochimiques. Ces méthodes restent
qualitatives et semi-quantitatives et requièrent des marquages. Aussi, ne sont-elles pas
facilement accessibles pour des analyses approfondies et précises des distributions des
composants de la matrice du cartilage 7,8. De plus, la quantification biochimique du collagène
et des GAGs fourni un aperçu de la répartition dépendante de la profondeur des constituants
majeurs de la MEC, mais reste limiter dans la résolution spatiale qui peut être obtenu de manière
fiable. Il nous a donc semblé nécessaire d’explorer d’autres méthodes non invasives et non-
destructrices, car celles-ci permettent non seulement l'observation de la formation de tissus,
mais aussi les changements dans le type de phénotype cellulaire, basés sur la microscopie
chimique, telle que la spectroscopie confocale Raman.
L’application de toutes ces nouvelles technologies utilisées dans le cadre de notre étude,
constitue un avantage pour étudier le tissu cartilagineux dans ses moindres détails aux échelles
micro et nanométrique et anticiper ainsi sur la conception de dispositifs qui soient utilisables
dans la pratique clinique.
75
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
2 METHODES EXPERIMENTALES
76
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
L’objectif principal de notre étude était de suivre la maturation du cartilage produit par
ingénierie tissulaire à partir de la microscopie confocale Raman. Ainsi, notre démarche
scientifique a consisté à :
Premièrement valider notre protocole d’étude : méthodes de traitement et de préparation
des échantillons, techniques d’analyse et traitements des données spectrales Raman.
Secondairement, évaluer les phénomènes de différenciation des cellules souches
mésenchymateuses humaines et à l’inverse la dédifférenciation des chondrocytes à partir de la
microscopie confocale Raman.
Enfin, établir une cartographie des principaux marqueurs biochimiques de la matrice du
cartilage articulaire nécessaires au bon fonctionnement du cartilage articulaire suivant les
différentes régions de la matrice du cartilage en fonction des trois zones et afin différencier le
cartilage normal du cartilage dégradé.
2.1 Source des échantillons
Trois (3) sources d’échantillons ont été utilisées dans le cadre de nos expérimentations :
Le premier groupe était constitué de cartilages articulaires prélevés sur des rats et qui
ont servi à la mise au point de nos protocoles. Cette expérimentation a permis d’évaluer non
seulement les différentes techniques et matériels nécessaires ou indispensables, mais également
à apprécier les difficultés liées à la conduite et optimiser ainsi nos protocoles.
Le second groupe d’échantillons était constitué par les cellules souches
mésenchymateuses humaines (hCSMs) et des chondrocytes (extraits par des techniques
enzymatiques). Ces différentes cellules mises en culture nous ont permis d’évaluer les
caractéristiques sous-jacentes au développement de tissu cartilagineux par ingénierie tissulaire,
en particulier la formation et la maturation du cartilage, mais les phénomènes de
dédifférenciation des chondrocytes, respectivement.
Enfin, la dernière source était constituée des explants de cartilages articulaires humains
(sain et dégradé) prélevés sur des patients venus consultés au CHU de Montpellier. Ces explants
de cartilage ont été obtenus pour des fins de recherche avec le consentement du donneur et
l'approbation du comité d'éthique appropriée du CHU de Montpellier. Ces échantillons de
cartilages ont permis non seulement d’évaluer la structure de la matrice du cartilage articulaire
et d’en établir une cartographie des principaux marqueurs biochimiques suivant les différentes
régions en fonction des zones, mais aussi différencier le cartilage sain du dégradé.
77
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
2.2 Préparation des échantillons pour les mesures microscopiques
La préparation de nos échantillons s’est déroulée en deux étapes :
- Méthode de fixation et de congélation des échantillons
- Méthode de fixation des échantillons sur la lame CaF2
2.2.1 Méthode de fixation et congélation des échantillons
Les objectifs de la fixation sont de :
Précipiter les macromolécules, de préférence à leurs sites chez l'animal vivant intact,
mais si cela n'est pas possible, à leurs sites dans les tissus de l'animal mort;
Empêcher les changements de forme ou de taille de toute partie du tissu;
Maintenir ses réactions chimiques à leurs équilibres dans la vie;
Tuer les organismes qui provoqueraient sa décomposition;
Conserver le tissu pendant longtemps 8.
En sommes, la fixation peut empêcher la délocalisation des molécules et particules
qu'elles précipitent, telles que les protéines et le glycogène. Pour la circonstance, tous nos
échantillons ont été fixés en appliquant la technique de fixation développée par le Dr. Tadafumi
Kawamoto (Université Tsurumi, Yokohama, Japon) en 1981 et mis en œuvre en 1990 225. Cette
technique avait pour but de produire des sections complètes très minces à partir de tissus durs
et de gros spécimens. La méthode a été appliquée à de nombreux types d'échantillons tels que
les animaux expérimentaux, les poissons, les insectes et les plantes (Figure 22). Les avantages
majeurs de cette technique résident dans le fait qu’elle favorise la réalisation des sections sans
distorsion avec une quasi-conservation parfaite de tous les composants tissulaires.
De façon pratique et selon la disponibilité des équipements et le contexte expérimental,
quelques modifications ont été apportées à certaines conditions et procédures de fixation et de
coupe telles que décrites par Kawamoto. Tous les échantillons de cartilage dans notre étude ont
d’abord été congelés dans de l'hexane (-94°C) refroidi dans un appareil de refroidissement
(Neocool Bath, Yamato, Japon). L'échantillon congelé a été par la suite immergé dans un
récipient en acier inoxydable puis recouvert d'un gel de carboxyméthylcellulose (CMC) à 5%
afin de l’enrober. La particularité du gel CMC 5%, contrairement à la paraffine, enrobe les
échantillons sans les infiltrer. Le récipient a été placé dans l'hexane refroidi jusqu’à congélation
complète du gel CMC autour de l’échantillon tout en s’assurant que la face supérieure du gel
78
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
CMC dans le récipient ne soit immergée dans le réfrigérant pour éviter les fissures pendant la
congélation. Les blocs obtenus ont été placés dans une boite et conservés à -80°C jusqu’au jour
des coupes histologiques au cryostat à l’INM (Institut de Neurosciences de Montpellier).
Lors des coupes, le bloc CMC congelé a été fixé à la phase échantillon du
cryomicrotome (Leica 3050, Leica Instruments, Allemagne) dans la chambre cryogénique (-
20°C). Les coupes ont été réalisées par une lame de carbure de tungstène montée et ayant un
angle de jeu de 5°. L’échantillon a été coupé à une vitesse n’excédant pas 4mm/s. La section a
été ensuite étalée sur une lame de verre (dimension 25x 75x 1.0 mm, Menzel-Glaser, Superfrost
Plus® Gold) pour des analyses immunohistochimiques ou sur des lames CaF2.
Figure 24 : Illustrations de la méthode Kawamoto: (A) Une souris enceinte, de 6 µm d'épaisseur;
(B) Section de 2 µm d'épaisseur: un thigbone de rat adulte, Lame: lame de laboratoire de section,
Milieu d'enrobage : SCEM-L1; (C) Section congelée fraîche (Une incisive de rat adulte, 2 µm; (D)
Section congelée fraîche (par Mme K. Izumi; Une truite arc-en-ciel de 5 µm d'épaisseur (Section
Méthode Kawamoto-Lab Co. Ltd. Site: http: // section-lab.jp/English/Gallery%20E.htm)
D
B
A
C
79
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
2.2.2 Méthode de fixation des échantillons sur la lame CaF2
L’immobilisation des échantillons de tissus mous hydratés est capitale pour une
manipulation aisée lors des mesures au microscope confocal Raman. Pour éviter la mobilité des
échantillons sur les lames CaF2 lors des mesures Raman et AFM, toutes les coupes ont été
immobilisées avec du Cell-Tak®, un adhésif tissulaire à base de protéines polyphénoliques
largement utilisé (Corning Cell-Tak), et connu pour se lier fortement à pratiquement toutes les
surfaces inorganiques et organiques dans des environnements aqueux 226. L’immobilisation a
été réalisée en suivant la méthode d'étalement manuelle du fabricant en mélangeant 10 µl de
Cell-Tak dans de l'acide acétique à 5% dans un tube Eppendorf® à l'aide d'une pointe de
micropipette. Le mélange a été étalé sur la lame CaF2 et laisser à l’air ambiant jusqu’à
adsorption de l’acide acétique pendant au moins 30 minutes. Après évaporation de l'acide
acétique, le reste du Cell-Tak a été aspiré avec la micropipette, puis la lame a été lavée avec de
l'éthanol à 95% et rincée à deux reprises avec de l'eau stérile. Enfin, les coupes hydratées avec
du PBS ont été étalées avec soin sur la lame tout en respectant l’orientation de l’échantillon
conformément au biseau initialement réalisé par le chirurgien, puis laisser à la température
ambiante pendant au moins 30 min jusqu’à adhérence complète et l’ensemble a été déposer
dans une boite de Pétri et du PBS (quantité raisonnable) a été ajouté pour l’analyse soit au
Raman ou à l’AFM. Dans certaines conditions, les lames étaient prétraitées avec le Cell-Tak et
conservées au réfrigérateur à 4° C dans l’attente des coupes histologiques où celles-ci étaient
directement étalées sur les lames.
2.3 Microscopie multiphotonique (MMP)
La microscopie multiphoton utilise les interactions non-linéaires entre la lumière et la
matière comme source de contraste. Le processus non-linéaire à l’ origine du développement
de la microscopie multiphoton est l’absorption à deux photons et la fluorescence qui en découle
(2PEF), démontré par Maria Goeppert-Mayer en 1929. Cette non-linéarité présente de
nombreux avantages, tels qu’une faible phototoxicité, une résolution 3D intrinsèque et une
grande profondeur de pénétration, etc. L’autre avantage qui a motivé notre choix pour cette
technique, est la possibilité de la microscopie multiphoton d’utiliser simultanément différents
modes de contraste, en particulier de combiner la fluorescence (2PEF) et la génération de
seconde harmonique (en anglais SHG pour Second Harmonic Generation). La fluorescence
permet d’évaluer la concentration et la localisation de fluorophores exogènes ou endogènes. La
80
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
SHG, quant à elle provient des structures denses non centrosymétriques et permet de visualiser,
entre autres les fibres de collagènes. La microscopie SHG permet ainsi, par ses spécificités de
sonder l’organisation tridimensionnelle des liaisons peptidiques en prenant en compte la
structure hiérarchique des assemblages de collagène (figure 25). En effet, les molécules de
collagène sont organisées sous forme de phases cristallines liquides ou insérées au sein d’une
fibrille et sont capables de générer un signal SHG. Il faut toutefois préciser qu’en raison de la
trop faible densité des groupements diffusants, il n’est pas possible d’observer une molécule
unique de collagène par SHG. Le diffuseur élémentaire, au sein de la triple hélice, est la liaison
peptidique.
Cette approche combine les techniques avancées d’optique du microscope confocal avec
une excitation multiphotonique de grandes longueurs d’onde pour imager des échantillons en
haute résolution en trois dimensions avec des fluorochromes très spécifiques. Elle est
principalement utilisée pour suivre des marqueurs fluorescents dans les tissus grâce au
processus de fluorescence sous excitation à deux photons. L’avantage d’utiliser des
Figure 25 : Images en microscopie multiphotonique : (A) : autofluorescence de la
matrice cartilagineuse (indication fléchée) dans la région immédiatement autour de la
cellule, correspondant à la matrice péricellulaire, mettant ainsi en évidence la
régionalisation de la matrice autour de la cellule ; (B) : amas de structure fibreuse de
collagène de la région MT de la matrice cartilagineuse en mode de génération de
seconde harmonique (SGH). Barre d’échelle = 10 µm. Abréviations : MT = matrice
territoriale ; MIT = matrice interterritoriale ; MPC = matrice péricellulaire ; C =
chondrocyte.
MT
C
MPC
A
B
MT
81
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
fluorophores endogènes permet de s’affranchir de toute préparation des échantillons et rend de
ce fait la technique applicable directement sur n’importe quel type d’échantillon in vivo. Ces
fluorophores permettent d’obtenir des informations structurelles, morphologiques et
fonctionnelles au niveau de la cellule ou du tissu. Au cours des expérimentations, cette
technique a permis de visualiser la matrice péricellulaire (MPC) en mode autofluorescente
autour de la cellule individuelle représentée par un vide (Figure 25 (A)).
Ainsi, elle sert à suppléer la microscopie confocale pour visualiser des phénomènes à
des profondeurs de pénétration qui lui sont inaccessibles, et permet de travailler sur l’ensemble
de l’échantillon. De plus, l’excitation provient uniquement du point focal permettant d’obtenir
une section optique d’échantillon épais qui pourra être exploitée pour une reconstruction 3D.
2.4 Microscopie à force atomique (AFM)
Le microscope à force atomique (AFM) est un microscope à sonde de très haute
résolution qui peut être utilisée aussi bien sur les tissus vivants ou fixés. A ce jour, la recherche
de tissus vivants ouvre la possibilité d'étudier des mesures biomécaniques, par exemple, le
module d'élasticité de Young 227. Dans le cartilage, les principaux composants de la MEC
(aggrécanes et fibrilles de collagène II), sont chargés négativement et possèdent une structure
tridimensionnelle caractéristique et ordonnée. L’interaction entre ces composants confère au
cartilage sa capacité d'absorber les chocs et lui permet de fonctionner pour protéger les
extrémités des os ; l’AFM peut être utilisée pour examiner les relations structure-fonction du
cartilage aux deux échelles micrométrique et nanométrique. Par ailleurs, les pointes nues de
l’AFM sont en mesure de révéler les composants moléculaires de la MEC à l'échelle du
nanomètre.
L'AFM se présente comme une technique de microscopie non-optique qui utilise une
pointe nanométrique à l'extrémité d'un levier très souple comme sonde mécanique pour balayer
la surface de l'échantillon et construire une image topographique tridimensionnelle hautement
résolue 228. Outre sa capacité d'imagerie à haute résolution, l'AFM peut aussi fournir des
données quantitatives sur une grande variété de propriétés physico-chimiques de l'échantillon.
Ce que Marcus et ses collaborateurs ont qualifié de spectroscopie de force 229. De plus, elle
nécessite une préparation minimale de l'échantillon et permet d'effectuer des mesures dans des
conditions physiologiquement pertinentes. Pendant la spectroscopie de force, la position
horizontale (x, y) du levier est fixe, tandis que son mouvement vertical (z) et sa déflexion
82
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
instantanée, en réponse à diverses forces, sont enregistrés, ce qui donne lieu à des courbes de
force-distance (courbes FD) (Figure 26). De ces différents paramètres, de nombreuses
informations peuvent être extraites liées aux propriétés mécaniques de l'échantillon et/ou aux
interactions entre le substrat et la pointe, tels que le module élastique (ou Young' s), l'adhérence
maximale, mais aussi le nombre, la taille du pas ou la distance des ruptures individuelles. En
définissant une grille sur une zone sélectionnée de l'échantillon et en effectuant des mesures de
force dans chaque nœud de grille, on peut cartographier la distribution spatiale des propriétés
mécaniques des tissus, cellules ou structures sous-cellulaires entières.
Figure 26 : Procedures de mesures du cartilage articulaire à l’aide de la microscopie à force
atomique (AFM) : (A) l’image optique de la matrice de cartilage lors des mesures d’un
échantillon avec la pointe du cantilever et des chondrons alignés. (B) L’unique courbe force-
distance (FD) enregistrée à chaque pixel de la carte de force (C). Les valeurs du module de
Young (E) sont obtenues en ajustant les courbes FD avec une courbe modèle (ligne en
pointillée noire) (C) Le code couleur représentant les valeurs du module de Young (YM)
obtenues des pixels allant du violet foncé (régions de forces plus ou moins douces) à l'orange
jusqu'au blanc (région de forces plus dure) (D) Représentation de la distribution de toutes
les valeurs du module de Young (YM) de la carte de force. Tous les histogrammes montrent
une forme normalement distribuée et équipés d'une fonction gaussienne obtenant une valeur
moyenne (E0) qui caractérise l'élasticité du site spécifique
A
B
C
D
83
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Le choix de cette technique a été motivé par le fait l’AFM soit capable de tracer la
topographie des échantillons avec une résolution très élevée, mais également d’évaluer les
propriétés de surface locales telles que l'adhérence et la rigidité. De sorte qu’en associant ces
deux techniques, l’AFM et la microscopie confocale Raman, il a été possible d’étudier à la fois
la composition chimique des échantillons et leurs caractéristiques de surface, notamment le
module de Young, dans notre cas.
Le dispositif utilisé dans le cadre de notre travail pour effectuer les différentes mesures
était constitué d’une tête de microscopie à force atomique MFP-3D Asylum Research, reliée à
un contrôleur 3D Molecular Force Probe (Asylum Research, Santa Barbara, Californie ; logiciel
de pilotage écrit en IgorPro 6.34A, Wavemetrics) et soutenu par un microscope optique inversé
(Zeiss Axiovert 200/Olympus ix-71) pour le positionnement et l’acquisition optique d’images.
Le module de Young a été calculé pour chaque force à partir de la partie approchante des
courbes de force, en utilisant un modèle Hertz modifié 230 basé sur les travaux de Sneddon 231
et développé pour différentes formes de type AFM 232–234. Le coefficient de Poisson des cellules
a été supposé être de 0,5, comme suggéré pour les matériaux incompressibles mous 235. Toutes
les courbes de force ont été ajustées manuellement afin d'éviter tout point de données mal ajusté,
conséquence possible de calculs logiciels automatiques pouvant conduire à des cartes
d'élasticité inexactes.
2.5 Microscope confocal Raman
Le microscope confocal Raman utilisé dans notre étude est le système Witec alpha 300R
(Witec Inc., ULM, Allemagne). La configuration du système est présentée sur la figure 27(A).
Il comporte un laser Nd: YAG double fréquence 532 nm et un laser He-Ne 633 nm, utilisés
comme sources de lumière. Pour notre étude, nous avons eu recours au laser Nd: YAG. Il faut
préciser que chaque laser nécessite un coupleur de microscope laser spécial avec filtre coupe-
bande. Ce dispositif comporte trois objectifs x20, x60 (immersion dans l'eau) et x100. L'objectif
à immersion dans l'eau a été l’objectif utilisé pour analyser nos échantillons.
Par ailleurs, deux fibres optiques sont utilisées dans ce système. La première permet de
transporter les photons du laser au microscope et la seconde du microscope au détecteur. Sur la
figure 27(B), nous pouvons apprécier le schéma du système. La deuxième fibre agit comme un
trou d'épingle pour obtenir une confocalité pour le microscope. La caméra EMCCD (Electron
Multiplying Charge Coupled Device ; DU 970N BV353, Andor, Hartford, USA) est utilisé dans
84
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
le système Witec alpha 300R. La taille de la puce EMCCD était de 1600 × 200 pixels, dont le
contrôleur de la caméra était un convertisseur A / N 16 bits fonctionnant à 2,5 MHz. La caméra
était refroidie par un système Pelletier.
Sur le système, le Witec control est le logiciel qui permet de contrôler le microscope
confocal Raman et d’analyser les spectres Raman acquis. Une interface est présentée sur la
figure 27. Dans un premier temps, une image optique est prise, puis on choisit la zone de
balayage Raman et on réalise juste un seul spectre ponctuel. Aussi, sur cette interface, le temps
d'intégration et le CCD (Charge Coupled Devices) ou l'EMCCD peuvent être réglés, car sont
d'autres options qui jouent un grand rôle pour obtenir des acquisitions adéquates. D’autres
logiciels tels que Witec Project et Project Plus sont utilisés pour analyser les données Raman.
Par exemple pour les analyses K-means Clustering, nous pouvons avoir recours au logiciel
Project Plus. Outre ces différents logiciels, le système est équipé d’autres logiciels qui facilitent
le traitement des spectres avant leur utilisation dans des analyses uni ou multivariées.
Le microscope est également équipé d'un étage de balayage piezo-conducteur avec une
précision de positionnement de 2 à 3 nm à l'horizontale et de 10 nm verticalement,
respectivement.
Figure 27 : Microscope Raman LBN Montpellier (A) ; B : Différentes composantes schématisées
de la microscopie Raman (www.witec.de)
B
85
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
2.5.1 Méthodes d’analyse des échantillons
Tous les spectres Raman ont été collectés à l'aide du Microscope Confocal Raman. Dans
le cadre de notre étude, le laser à double fréquence Nd : YAG (Newport, Evry, France) avec
une longueur d'onde de 532 nm et l’objectif aérien × 60 NIKON à immersion avec une ouverture
numérique NA de 0,46 (Nikon, Tokyo, Japon) ont été utilisés. La puissance laser de sortie était
de 50 mW. La résolution spatiale était de 300 nm et la résolution en profondeur d'environ 1 μm.
Le temps d'acquisition d'un seul spectre a été fixé à 0,5 s. Au total, 150 × 150 points par image
ont été enregistrés, ce qui a donné 22 500 spectres pour une image. L'acquisition de données a
été possible grâce au logiciel Image Plus 2.08 de Witec. Ainsi, à l'aide d’un filtre de bord, les
rayonnements Raman rétrodiffusés ont été séparés de la lumière dispersée de Rayleigh. De ce
fait, les photons Raman sont transférés à la caméra EMCCD. Le système de spectroscopie
UHTS 300 avec une transmission de 70% et un réseau de 600 lignes par mm (fonctionnant à -
60° C) offraient une résolution spectrale de 3-5 cm-1.
2.5.2 Analyse du signal Raman
Le signal peut être divisé en deux parties : l'une causée par le ou les analytes, l'autre par
les composants du substrat de l'échantillon et de l'instrumentation 236. Il existe des variations de
signal et de réponse dans les spectres Raman qui résultent des rayons cosmiques, de la
Figure 28 : Interface du logiciel de contrôle Witec
86
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
fluorescence (en tant que fond variable), des variations de l'efficacité du détecteur en fonction
de la plage spectrale et des variations d'intensité entre les acquisitions spectrales. Cette section
décrit les procédures essentielles pour le traitement des données brutes afin d'optimiser le signal
dû à l'échantillon et de réduire ainsi l'intensité spectrale superflue.
2.5.3 Traitements des données spectrales
Des dizaines de milliers de spectres Raman ont été acquis à chaque mesure. Il faut
rappeler que chaque spectre contient une foule d'informations à la position où le spectre est
enregistré. Les informations pertinentes peuvent être extraites pour permettre la détermination
de la composition chimique, des différentes phases ou des contraintes dans l'échantillon. Pour
obtenir toutes ces informations, un pré-traitement des spectres est nécessaire à l'aide de filtres
et d'algorithmes appropriés. Ainsi, les données peuvent être visualisées sous forme d'image
traitée et exportée. Le pré-traitement des données a été effectué à l'aide soit du logiciel de
graphisme de Witec Project Plus (Ulm, Allemagne) et/ou soit du logiciel Spectragryph version
1.2.14.
Figure 29 : Interface de traitement des spectres du logiciel Spectragryph version 1.2.14
87
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
2.5.4 Prétraitement des données spectrales
L’une des premières manipulations sur les données est l’étape du prétraitement. En effet,
l'inspection visuelle des spectres sur les différentes longueurs d'onde est longue et impossible
lorsque l'on tente de comparer des spectres très similaires ou encore plusieurs spectres en même
temps. Ces prétraitements permettent donc la suppression des artefacts spectraux et spatiaux
tels que les différences d’épaisseur de l’échantillon, les effets optiques, l’influence de l’appareil
et le bruit de fond du détecteur. Ces techniques sont désormais considérées comme essentielles
pour développer des modèles de classification robustes. De ce fait, les spectres doivent être
prétraités avant de les soumettre à des méthodes statistiques (multivariées ou chimiométriques)
parce que les résultats obtenus par les techniques de classification (par exemple : ACP, LDA,
etc…) en dépendent. Ces prétraitements spectraux ont concerné successivement l’élimination
des rayons cosmiques, la correction de la ligne de base, le lissage des spectres, la soustraction
du signal de fond et la normalisation.
2.5.4.1 Elimination des rayons cosmiques (Cosmic Ray Removal)
Les rayons cosmiques sont des particules de haute énergie provenant de l’espace. Ce
sont principalement des mésons chargés qui se désintègrent rapidement en muons. Ces muons
atteignent la surface de la Terre et interagissent avec des molécules de l’atmosphère terrestre.
Si un rayon cosmique frappe un détecteur CCD, il créera un faux signal sous forme de pic très
net. Diverses méthodes mathématiques peuvent être utilisées pour éliminer les faux signaux des
rayons cosmiques. L’une est l’élimination des rayons cosmiques spectraux et l’autre est
l’élimination des rayons cosmiques temporels. Le principe de la méthode d'élimination des
rayons cosmiques spectraux est que chaque pixel est comparé à ses pixels adjacents et s'il
dépasse un certain seuil, il sera identifié comme un rayon cosmique. Dans la méthode de
suppression des rayons cosmiques dans le temps, chaque spectre est comparé aux autres
enregistrés précédemment et chaque pixel est comparé à sa variation dans le domaine temporel.
Cette méthode n'est pas valable dans les cas où l'échantillon change rapidement de signature
spectrale.
88
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
2.5.4.2 Correction de ligne de base
La correction de la ligne de base est l'étape de prétraitement la plus souvent requise.
Outre les sources environnementales et instrumentales (variations de température ou d’intensité
de source, vibrations, etc.), les variations de référence peuvent être causées par les propriétés
optiques et physicochimiques inhérentes à l’échantillon (effets de bord, points chauds,
autofluorescence, hétérogénéités d’indice de réfraction, etc.). Ces signaux sont étroitement liés
à la nature de l’échantillon et de la source lumineuse. Ainsi, la ligne de base d’un spectre brut
se présente sous une forme inclinée (ou autres formes) d’où la nécessité de la corriger afin de
corriger le spectre. Cette correction se fait selon des paramètres bien définis : degré du
polynôme et nombre de points et se fait en estimant une ligne de base passant par les minima
du spectre et qui sera ensuite soustraite à ce dernier. Dans notre étude, la correction de la ligne
de base a été réalisée avec le logiciel Spectragryph en choisissant les paramètres nécessaires
pour obtenir une ligne de bas optimum.
2.5.4.3 Lissage des spectres
Le lissage est une méthode courante pour traiter les spectres Raman afin de réduire le
bruit associé à un spectre enregistré. Les algorithmes reposent sur un changement progressif
des données spectrales d'un point à un autre, alors que dans le bruit, un changement très rapide
est observé. Le lissage peut être appliqué en remplaçant chaque valeur par une valeur calculée
à partir de son environnement. Il faut cependant, prendre soin d'éviter l'élimination des signaux
Raman réels avec le filtre de lissage. Parmi les différentes méthodes de lissage spectral, le
filtrage de Savitzky-Golay (SG) 237 est le plus largement utilisé, car il permet d'améliorer le
rapport signal sur bruit sans déformer le signal. Le lissage est contrôlé par deux facteurs : l'ordre
polynomial et la taille de la trame (ou nombre de coefficients de convolution). Ainsi, plus la
différence entre l'ordre polynomial et la taille de la trame est grande, plus le lissage est appliqué.
Si la différence est égale à 1, aucun lissage n'est produit. Cet algorithme a l’avantage de réaliser
un lissage de la courbe tout en préservant l’existence et la largeur des intensités des pics
d’intérêt. Dans notre étude, nos données ont été lissées avec un polynôme d’ordre 4 avec une
taille de trame de 13. A noter qu’un lissage trop important peut induire une perte d’information
spectrale.
89
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
2.5.4.4 Procédure de soustraction de signal de fond
Tout signal Raman montre un peu de signal de fond. Afin de comparer uniquement la
contribution des spectres enregistrés aux spectres des pics Raman, le signal de fond a été
supprimé de chaque spectre. Ce signal peut être dû à un certain nombre de facteurs, notamment
les contributions du matériau utilisé pour soutenir l’échantillon, ainsi que la fluorescence de
revêtements antireflet sur l’objectif du microscope. Les sources d’arrière-plan sont de deux
catégories, la première est l’arrière-plan provenant de la caméra CCD et la seconde est l’arrière-
plan du signal vrai. Une caméra CCD ajoute une tension continue pour éliminer la tension
négative due au bruit. Cette tension continue provoque un fond constant de quelques centaines
à quelques milliers de comptes CCD (unités numériques). Il peut être facilement éliminé en
soustrayant la valeur constante ajoutée par la caméra. Le second est le vrai fond de signal
Raman. Il y a peu de matériaux avec vraiment zéro fond dans leurs signaux Raman. Une bonne
confocalité peut réduire le fond du signal Raman. En plus de supprimer le vrai fond de signal,
peu de moyens sont disponibles. Les plus importantes sont la soustraction d’arrière-plan
polynomiale à passe unique et la soustraction de moyenne mobile. Pour la soustraction d'arrière-
plan polynomiale à passe unique, un polynôme sera ajusté au spectre et soustrait. Dans ce cas,
il faut faire attention à ne pas éliminer les signaux Raman. La deuxième méthode est la
soustraction de fond de moyenne mobile. Dans cette méthode, un nombre définissable de
valeurs à gauche et à droite de la valeur actuelle est moyenné. La valeur actuelle sera soustraite
de la valeur moyenne.
2.5.4.5 La normalisation
Ce traitement est appliqué pour éliminer les facteurs liés aux variations de la source ou
du détecteur et pour corriger les différences d’épaisseur de l'échantillon ce qui permet par
ailleurs de simplifier la comparaison entre les données spectrales qualitativement et
quantitativement. Cela garantit que tous les pixels ont la même intensité totale et, par
conséquent, les variations d'intensité observées représentent les variations (proportionnelles) de
la concentration chimique. Les spectres sont donc ramenés à la même échelle d’intensité. Il
existe plusieurs types de normalisation :
Normalisation Min / Max : l’intensité d’un pic du spectre est ramenée à une échelle
où l'unité d'absorbance minimale sera de 0 et la maximale de 1.
90
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Normalisation vectorielle : Cette méthode calcule la moyenne « y » des
absorbances du spectre qui sera ensuite soustraite du spectre. La somme des carrés
de toutes les valeurs « y » est calculée et le spectre est divisé par la racine carrée
de cette somme. L’écart-type est égale à 1.
Correction de l'offset : Cette méthode déplace la ligne de base du spectre pour que
l'unité d'absorbance minimale soit à 0.
91
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Figure 30: Les différentes étapes de prétraitement des spectres : (a) Spectres brutes, (b) Soustraction de la ligne de base suivant l’ordre
polynomial, (c) Spectres brutes sans la ligne de base, (d) Spectres brutes sans ligne de base pris dans la région spectrale de 600-1800 cm-1,
(e) Lissage avec le filtre Savizsky Galay et normalisation par rapport à l’aire de la région spectrale 600-1800 cm-1, (f) Curseur multilignage
et détermination de l’intensité de signal
a
c
b
d
e
f
92
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
2.5.5 Analyse des données
Le but de l'analyse des données est d'identifier la composition chimique de l'échantillon
de manière résolue spatialement. Cela inclut souvent l'identification de zones chimiquement
distinctes et leur corrélation avec des informations biologiques, telles que l'anatomie,
l'expression de gènes et / ou de protéines, les gradients hormonaux, l'activité enzymatique, etc.
Différentes approches peuvent être adoptées pour identifier des zones chimiquement
différentes. L'ajustement des pics a été réalisé à l'aide d'un ajustement des pics gaussien au
centre de chaque pic ou de ses composants. Afin de comparer les spectres et de permettre des
comparaisons cohérentes là où les variations d'intensité peuvent être relatives à l'intensité de
chaque spectre, les données ont été normalisées à des pics d'intensité constante entre les
échantillons. La normalisation rend ainsi chaque spectre d'une série comparable en vertu du fait
que l'intensité des données dans chaque spectre est normale à l'intensité d'un pic dans un
ensemble de données, ce qui était censé être cohérent dans la série de spectres. Les données
spectrales ont été normalisées à un pic / à des pics d'intensité / contribution connue au spectre.
Dans notre étude, plusieurs possibilités ont servi à la normalisation de nos données :
- Avec le pic de phénylalanine (1004 cm-1) a été principalement utilisé pour cela. En effet,
il a été démontré que ce pic semble plus constant selon les milieux 238–240
- Avec le pic CH localisé soit à 1450 cm-1 ou 2935 cm-1 241
- Par rapport à la surface de la région d’intérêt du spectre (600 – 3000 cm-1), en raison de
l’évaluation des éventuelles modifications de la teneur du pic de collagène de type I
dans le tissu 242. Pour le traitement final des données, c’est cette méthode qui a été
retenue.
2.5.6 Analyses multivariées
Les spectres Raman contiennent diverses bandes Raman qui se chevauchent. De sorte
qu’il est difficile d'inspecter et d'interpréter visuellement les données spectrales. Les méthodes
d'analyse spectrale multivariée sont souvent utilisées pour traiter les spectres Raman et faciliter
l'interprétation des données 243. Elles sont généralement classées en méthodes supervisées ou
non supervisées. Pour les analyses non supervisées, telles que l'analyse par grappes et l'ACP,
aucune connaissance a priori des caractéristiques de classe n'est requise qui, cependant doit être
déterminée à partir de l'analyse elle-même. A l’inverse, dans une analyse supervisée, le nombre
de classes et d'échantillons représentatifs de chaque classe sont connus a priori, comme c'est le
cas dans l’analyse linéaire discriminante (LDA), l'analyse de régression et les réseaux de
93
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
neurones artificiels (RNA) 244. Dans le cas de notre étude, nous nous sommes intéressés à
l’analyse de la composante principale (ACP), l’analyse k-means clustering (KMCA), l’analyse
discriminante linéaire (LDA) et la dérivée seconde. Ces différentes méthodes sont brièvement
décrites sous-dessous.
2.5.6.1 Analyse de la Composante Principale (ACP)
L'ACP est l'une des méthodes d'analyse de données multivariées les plus utilisées.
L’objectif de l’analyse en composantes principales (ACP) est d’exprimer la structure de
variation d’un ensemble de variables descriptives d’une matrice de données (les longueurs
d’onde des spectres obtenus d’un procédé, par exemple) en utilisant un nombre restreint de
variables définies comme des combinaisons linéaires des variables originales 245. Ces
combinaisons linéaires sont appelées Composantes Principales (CP). La variance totale d’une
matrice de données à n variables peut souvent être condensé autour de k composantes
principales (avec k<n) ; ou encore k directions de variance maximale. Les composantes
obtenues sont classées par importance de la variance expliquée, ce qui veut dire que la première
CP expliquera davantage de variance que la seconde qui en expliquera elle-même plus que la
suivante, et ainsi de suite. L’ACP peut être aussi définie comme une méthode d’extraction des
variations systématiques d’un jeu de données 246. L’ACP cherche donc à reconstruire la
structure de variance/covariance des données dans un modèle représentant les variations
significatives et où le bruit aléatoire (supposé indépendant et identiquement distribué) est
considéré comme une erreur. Cette méthode permet :
- l'étude et la visualisation des corrélations entre les variables, afin d'éventuellement
limiter le nombre de variables à mesurer par la suite ;
- l'obtention de facteurs non corrélés qui sont des combinaisons linéaires des
variables de départ, afin d'utiliser ces facteurs dans des méthodes de modélisation
telles que la régression linéaire, la régression logistique ou l'analyse discriminante
;
- la visualisation des observations dans un espace à deux ou trois dimensions, afin
d'identifier des groupes homogènes d'observations, ou au contraire des
observations atypiques.
En définitive, l'ACP peut être considérée comme une méthode de projection qui permet
de projeter les observations depuis l'espace à ƿ dimensions des variables ƿ vers un espace à ƙ
94
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
dimensions (ƙ < ƿ) tel qu'un maximum d'information soit conservée (l'information est ici
mesurée au travers de la variance totale du nuage de points) sur les premières dimensions. Si
l'information associée aux 2 ou 3 premiers axes représente un pourcentage suffisant de la
variabilité totale du nuage de points, on pourra représenter les observations sur un graphique à
2 ou 3 dimensions, facilitant ainsi grandement l'interprétation.
Dans le cas des données spectrales, l’ACP est considérée comme une méthode d’analyse
multivariée prenant en compte l’ensemble des pixels des spectres pour décrire la variation dans
l’image à l’aide d’un petit nombre de contributions de base (composantes principales) liées aux
comportements spectral et spatial 247. Il résout donc les problèmes susmentionnés de cartes
thermiques d'intensité de bande et est mieux adapté pour gérer les variations biologiques.
2.5.6.2 Linear Discrimative Analysis (LDA) 248
L’analyse discriminante linéaire (LDA) ou discriminants de Fisher est une approche
discriminante qui tente de modéliser les différences entre les échantillons affectés à certains
groupes. Le but de la méthode est de maximiser le rapport entre la variance inter-groupe et la
variance intra-groupe. Lorsque la valeur de ce rapport est à son maximum, alors les échantillons
au sein de chaque groupe ont la plus petite dispersion possible et les groupes sont le plus séparés
les uns des autres. Une fois que l’hypothèse LDA de covariances de groupe égales pour un
problème discriminant à deux classes est satisfaite, on essaie de maximiser l’expression :
249
Ou Cb et Cw sont des matrices de covariance entre et intra-groupe, respectivement, et p est la
direction dans l’espace de données multivariées qui sépare le mieux les deux groupes
d’échantillons. A ce stade, il est important de souligner que p est le vecteur propre obtenu à
partir de la décomposition ACP de la matrice Cw− 1Cb. Le problème discriminant à deux classes
peut être généralisé pour un problème multi-classes.
2.5.6.3 Analyse k-means Clustering (KMC)
Le k-means Clustering ou encore k-moyenne de repartitionnement est un algorithme
non supervisé qui résout les problèmes de partitionnement 250. Ces méthodes utilisent les
S =
p
C
b
PT
p
C
w
PT
95
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
enregistrements d’une base de données et les répartissent (les « partitionnent ») dans les «
meilleurs » k groupes sur la base de certains critères. L'algorithme KMC est une méthode
«grossière» pour classer les spectres car un spectre unique peut être membre d'une seule classe
(cluster). L'algorithme classe les spectres de manière à minimiser les différences spectrales au
sein des clusters et à maximiser les différences spectrales entre les clusters. La distance
euclidienne est utilisée pour définir les différences entre les spectres 251. En effet, l'algorithme
sélectionne un nombre prédéfini (k) de spectres aléatoires à partir de l'ensemble de données
comme spectres centroïdes. Ensuite, l'algorithme calcule la distance entre chaque spectre et
chaque spectre centroïde et classe les spectres en k classes en fonction des distances. De
nouveaux spectres centroïdes sont créés en calculant le spectre moyen pour chaque classe. Là
encore, les distances entre chaque spectre et chaque spectre centroïde sont calculées et de
nouvelles classes k sont créées. À la suite de cette boucle, nous pouvons remarquer que les k,
centres de gravité changent leur emplacement étape par étape jusqu'à ce qu’aucune modification
supplémentaire ne soit nécessaire. En conséquence, l'algorithme génère une image dans laquelle
une couleur représente la classe particulière (ou cluster) 251,252. Les pixels noirs dans les images
de cluster sont dus à la suppression des spectres de mauvaise qualité. Pour chaque cluster, le
spectre moyen peut être isolé et les différences spectrales peuvent être soumis à l’étudie.
En tout état de cause, cet algorithme vise à minimiser une fonction objective, et par
conséquent une fonction d'erreur quadratique.
La fonction objective où est une mesure de distance choisie entre un
point de données et le centre de cluster , est un indicateur de la distance entre les
données de n points de leurs centres de classe respectifs. L'algorithme k-moyenne ne trouve
pas nécessairement la configuration la plus optimale, correspondant au minimum de la fonction
objectif globale, bien qu'il puisse être prouvé que la procédure soit toujours terminée.
L'algorithme est également significativement sensible aux centres des premiers clusters
sélectionnés au hasard. Pour réduire cet effet, l'algorithme k-moyenne peut être exécuté
plusieurs fois.
i
(j)
S
m
j
_
2
S
(j)
i
m
j
J =
k
Ʃ
j=1
n
Ʃ
i=1
i
(j)
S
m
j
_
2
96
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
2.5.6.4 La dérivation
La dérivation joue un rôle important dans la séparation des informations spectrales. En
effet, les petites différences entre deux spectres très corrélés (des pics qui se recouvrent) ne sont
pas visibles à l’œil nu. La dérivation permet une identification plus spécifique des pics
d’absorption petits et voisins qui ne sont pas résolus dans le spectre initial, offrant ainsi un
moyen d’augmenter la spécificité des pics d’absorption de certaines molécules du tissu et donc
de les révéler au manipulateur. Autre avantage de la dérivée est que les composantes constantes
et linéaires des erreurs de base sont éliminées lors de la différenciation. Selon la loi de Beer-
Lambert, l’absorbance peut être exprimée comme suit :
A(ϋ) = α(ϋ)lc, (Equation 1) 253
où A est l'absorbance dépendante du nombre d'onde ϋ, a est le coefficient d'absorption
dépendant du nombre d'onde, l est la longueur du chemin optique (principalement déterminée
par l'épaisseur de la coupe) et c est la concentration. Lorsque l'équation (1) est différenciée deux
fois, le résultat est le suivant :
(Equation 2) 253
D'après l'équation (2), on peut voir que des informations quantitatives peuvent
également être obtenues à partir des spectres de la dérivée seconde, puisque l et c, en termes
constants, ne sont pas affectés par la différenciation. La spectroscopie en dérivée seconde
permet une identification plus spécifique des pics d’absorption petits et voisins qui ne sont pas
résolus dans le spectre initial, offrant ainsi un moyen d’augmenter la spécificité des pics
d’absorption de certaines molécules du tissu.
En tout état de cause, la dérivée seconde accroit considérablement le nombre de points
caractéristiques des spectres. En effet, à chaque bande du spectre d’origine correspond trois
bandes dans le spectre dérivé, soit 2 maxima, un minimum et 2 points d’annulation.
L’accroissement du nombre de maxima, de minima et de points d’annulation améliore très
nettement la définition du spectre. Les dérivés les plus communément utilisées sont celles
d’ordre 1 ou 2. Le seul inconvénient de ce prétraitement est qu’il est sensible au bruit de fond.
d2 α(ϋ)
dϋ2
d2 A(ϋ)
dϋ2
=
97
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3 RESULTATS ET DISCUSSIONS
98
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.1 Caractérisation de la matrice du cartilage articulaire :
Cartographie des principaux marqueurs de la matrice du
cartilage articulaire à partir de la Microscopie Confocale
Raman
99
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.1.1 Introduction
Le cartilage articulaire est un tissu conjonctif hautement spécialisé 254–256. Il est
subdivisé en trois zones très distinctes : superficielle (avec une épaisseur d’environ 10–20%),
moyenne (avec une épaisseur d’environ 20–70%) et profonde (70–100%). La matrice du
cartilage est faite d’une matrice extracellulaire (MEC) constituée en majorité de collagène de
type II qui confère au tissu sa forme et sa résistance et des protéoglycanes dont la principale est
l’aggrécane, assurant une résistance aux contraintes mécaniques 24. Au voisinage des cellules
individuelles, la MEC est organisée en zone immédiatement péricellulaire et en une matrice
interterritoriale entre les cellules. La matrice péricellulaire (MPC) est riche en protéoglycanes
(PGs) 257, possède une composition et une architecture de collagène particulière (avec une
prédominance de collagène de types VI) et forme une couche mince autour du chondrocyte
associé. Elle semble jouer un rôle important dans la mécanotransduction et le métabolisme de
la cellule particulièrement 50. Selon Hugues LC et al, (2005), il s’agit d’une fine couche
spécialisée de la MEC, mais très différente sur le plan structurel, biochimique et fonctionnel
258. L’ensemble matrice péricellulaire et chondrocytes a été qualifié sous le vocable de
« chondron », thème inventé par Benninghoff en 1925 en observant les modifications dans la
structure de la matrice autour des chondrocytes à partir de la lumière polarisée. Les
chondrocytes noyés dans matrice cartilagineuse ne représentent que 2% du volume total du
cartilage articulaire. Ils assurent le maintien de l’homéostasie de la matrice cartilagineuse et
procèdent à son renouvellent lors des phénomènes de dégradation de celle-ci sous les charges
mécaniques. Quant à la matrice interterritoriale, elle constitue la majeure partie de la matrice
extracellulaire du cartilage et fournit une contiguïté structurelle et biomécanique entre les
cellules et dans l’ensemble du tissu 259.
L'ingénierie tissulaire du cartilage combine la biologie et l'ingénierie, un domaine
interdisciplinaire qui applique les principes de l'ingénierie et des sciences de la vie au
développement de substituts biologiques qui restaurent, maintiennent ou améliorent la fonction
du cartilage articulaire 79. Le principal objectif de l’ingénierie tissulaire du cartilage est de
générer des tissus de remplacement du cartilage fonctionnel qui peuvent être utilisés pour
réparer de manière clinique les défauts du cartilage articulaire 260–262.
Les efforts entrepris depuis lors pour développer un substitut de cartilage dans le cas de
l’arthrose peinent encore à trouver une solution satisfaisante et reproductible au problème, car
le changement dans le phénotype du cartilage implanté conduit à un tissu de réparation
fibrocartilagineuse dont la stabilité dans le temps est médiocre et la fonction différente du
100
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
cartilage hyalin. Avec les dernières avancées de la recherche, il est connu aujourd’hui que les
cellules ont la capacité de se réorganiser en structures complexes spécifiques aux tissus, avec
un minimum de facteurs de croissance inductifs 6. Cependant, le manque d’organisation
structurée et de taille du tissu raisonnable constitue un obstacle majeur à la réalisation d’une
fonctionnalité véritablement in vivo. Le défi majeur actuel consiste à développer des substituts
biologiques qui soient la réplique fidèle du tissu natif de sorte à faciliter l’intégration et les
fonctions de celui-ci une fois implanté dans l’environnement natif.
L’objectif de notre étude a consisté à caractériser la matrice globale du cartilage
articulaire et de fournir une cartographie des principaux marqueurs Raman.
3.1.2 Matériel et méthodes
3.1.2.1 Préparation des échantillons
Des explants de cartilage articulaires prélevés sur le genou d’un patient après son
consentement. Lors de la chirurgie, un biseau a été réalisé pour guider l’expérimentateur suivant
l’orientation de l’échantillon de la surface à la profondeur au cours des coupes histologiques et
des mesures au microscope confocal Raman. Les biopsies réalisées ont été faites à distance des
sites de dégradation. Les tissus humains ont été obtenus à des fins de recherche avec le
consentement du donneur et l'approbation du comité d'éthique appropriée du CHU de
Montpellier.
3.1.2.1.1 Préparation des coupes histologiques
Tous les échantillons reçus au laboratoire ont été prélevés par l’équipe Danièle de
l’IRMB. Les échantillons fraichement prélevés ont été immédiatement plongés dans du PBS
puis conservés au réfrigérateur à 4°C. Dans la même journée, ces échantillons ont été
transportés au laboratoire et aussitôt congelés dans de l’hexane refroidissant à -94°C, puis placé
dans un récipient en acier inoxydable en respectant l’orientation de l’échantillon grâce au biseau
réalisé lors de la biopsie et recouvert d’un gel de carboxyméthylcellulose (CMC) à 5%.
L’ensemble (récipient + échantillon + gel) a été plongé dans l’hexane refroidissant tout en
préservant la surface de toute immersion dans le réfrigérant pour éviter les fissures pendant la
congélation jusqu’à formation d’un bloc 225. Les blocs obtenus ont été placés dans une boite et
conservés à -80°C jusqu’au jour des coupes histologiques. Pour les coupes histologiques, les
échantillons ont été transportés sous glace à l’Institut de Neurosciences de Montpellier (INM)
101
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
où plusieurs coupes cryosections d’une épaisseur allant de 20µm à 60µm ont été réalisées au
cryostat Leica 3050 dans une chambre cryogénique à -20°C avec une lame coupante de carbure
de tungstène montée et ayant un angle de jeu de 5°. L’échantillon a été coupé à une vitesse
n’excédant pas 4mm/s. La section a été ensuite étalée directement sur les lames CaF2 pour les
mesures aux microscopes confocal Raman et à force atomique (AFM). Toutes les coupes
réalisées ont été ensuite transportées sous glaces au laboratoire et conservées au réfrigérateur à
4°C.
3.1.2.1.2 Préparation et mesures Raman des échantillons
Avant les mesures au microscope Raman, les coupes ont été fixées sur les lames CaF2
avec du Cell-Tak® (une colle adhésive), puis déposées dans une boite de Pétri et rempli au 2/3
de tampon phosphate salin (PBS). En effet, l’application de cette colle adhésive, en plus de
permettre une bonne adhérence de l’échantillon à la lame CaF2 pour des exploitations futures
dans le temps 226, n’interfère aucunement avec le signal Raman. Durant toute la période des
mesures, les échantillons ont été conservés dans le PBS (le PBS était remplacé chaque jour pour
éviter les contaminations de l’échantillon) au réfrigérateur à 4°C. Toutes les mesures ont été
réalisées à l'aide d'un Microscope confocal Raman Witec α 300R (Witec, Ulm, Allemagne). Le
système est équipé d'un laser à double fréquence Nd : YAG (Newport, Evry, France) avec une
longueur d'onde de 532 nm et de trois objectifs aériens × 20, × 100 et × 60 immersion dans
l’eau, version NIKON avec ouverture numérique NA de 0,46 (Nikon, Tokyo, Japon). Pour nos
échantillons, seul l’objectif × 60 immersion a été utilisé. La puissance laser de sortie était de 50
mW. La résolution spatiale était de 300 nm et la résolution en profondeur d'environ 1 μm. Le
microscope est également équipé d'un étage de balayage piezodriven avec une précision de
positionnement de 2 à 3 nm à l'horizontale et de 10 nm verticalement, respectivement. Le temps
d'acquisition d'un seul spectre a été fixé à 1 s. 150 × 150 points par image ont été enregistrés,
ce qui a donné au total 22 500 spectres pour une image. Les images hyperspectrales ont été
acquises dans un intervalle de temps allant de 24 à 48 min. L'acquisition de données a été
réalisée à l'aide du logiciel ImagePlus 2.08 de Witec. À l'aide d'un filtre de bord, les
rayonnements Raman rétrodiffusés ont été séparés de la lumière dispersée de Rayleigh. Les
photons Raman ont été transférés à la caméra EMCCD (DU 970N-BV353, Andor, Hartford,
États-Unis). La taille de la puce EMCCD est de 1600 × 200 pixels, le contrôleur de la caméra
est un convertisseur A/D 16 bits fonctionnant à 2,5 MHz, et la caméra est refroidie par un
système Pelletier. Le système de spectroscopie UHTS 300 avec une transmission de 70% et un
102
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
réseau de 600 lignes par mm (fonctionnant à -60° C) offrent une résolution spectrale de 3-5cm-
1. Ce microscope a été utilisé pour l’analyse des structures du cartilage articulaire. Au total, 120
spectres (en raison de 40 spectres par région matricielle : chondrocyte, la MPC et la MEC) ont
été collectés suivant les différentes zones du cartilage articulaire.
3.1.2.1.3 Les mesures au microscope à force atomique (AFM)
Sur chaque échantillon (n=9), nous avons effectué des mesures AFM pour déterminer
le module d'élasticité de la matrice du cartilage articulaire. Tous les échantillons ont été sondés
sur toute la gamme de la matrice en utilisant des porte-à-faux équipés de billes colloïdales (CP-
qp-CONT-Au, sQube, Allemagne) avec une vitesse de 10 µm / s et une force de déclenchement
de 30 nN. La taille des cartes a été définie de 40x40 à 64x64 pixels ce qui semble être un bon
compromis entre temps et résolution. Dans une première, la matrice globale a été mesurée en
fonction des différentes zones sans distinction des régions. Par la suite, les différentes régions
de chaque zone ont été étudiées. Vous trouverez ci-dessous les procédures de mesure AFM des
échantillons et de détermination du module de Young. A la fin, nous avons calculé la moyenne
et l'écart type résultant des mesures réalisées tant au niveau de la matrice globale en fonction
des différentes zones que des différentes régions de la matrice. Le dispositif utilisé dans cette
étude pour effectuer les différentes mesures était constitué d’une tête de microscopie à force
atomique MFP-3D Asylum Research, reliée à un contrôleur 3D Molecular Force Probe
(Asylum Research, Santa Barbara, Californie ; logiciel de pilotage écrit en IgorPro 6.34A,
Wavemetrics) et soutenu par un microscope optique inversé (Zeiss Axiovert 200/Olympus ix-
71) pour le positionnement et l’acquisition d’images optiques. Le module de Young a été
calculé pour chaque force à partir de la partie approchante des courbes de force, en utilisant un
modèle Hertz modifié 263 basé sur les travaux de Sneddon 264 et développé pour différentes
formes de type AFM 265–267. Le coefficient de Poisson des cellules a été supposé être de 0,5,
comme suggéré pour les matériaux incompressibles mous 268. Toutes les courbes de force ont
été ajustées manuellement afin d'éviter tout point de données mal ajusté, conséquence possible
de calculs logiciels automatiques pouvant conduire à des cartes d'élasticité inexactes.
103
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.1.2.2 Analyses des données et images spectrales Raman
Ces analyses avaient pour but d’identifier la composition chimique de l’échantillon de
manière résolue spatialement, l’identification des zones chimiquement distinctes et leur
corrélation avec des informations biologiques.
3.1.2.2.1 Analyse des données spectrales Raman
Tous les spectres réalisés ont subi un prétraitement afin d’obtenir des spectres ayant non
seulement la même échelle, mais comparables entre eux. L'analyse spectrale a été réalisée dans
la plage des empreintes digitales (600-1800 cm-1) en raison de sa spécificité moléculaire plus
élevée. Avant l’analyse statistique multivariée, les spectres Raman ont été pré-traités au moyen
de techniques bien établies. Le processus de prétraitement des spectres a consisté dans un
premier temps à la soustraction de la ligne de base suivant la loi polynomiale d’ordre 8. Par la
suite, nous avons procédé à l’élimination de l'autofluorescence des tissus et le lissage des
spectres en utilisant le filtre « Savitzky Galay », suivant un ordre polynomial = 4 avec un
nombre de points (ou intervalle = 13). Afin de comparer les spectres et de permettre des
comparaisons cohérentes là où les variations d'intensité peuvent être relatives à l'intensité de
chaque spectre, les données ont été normalisées par rapport à l’AIRE de la région comprise
entre 600 et 1800 cm-1 242. Ces étapes de prétraitement des spectres ont été nécessaires avant de
les soumettre à des méthodes statistiques. Tous les processus de prétraitement, de normalisation
et détermination des différentes intensités des pics ou bande ont été réalisés avec le logiciel
Spectragryph® version 1.2.12 non commercial développée et offert gracieusement par le Dr
Friedrich Menges.
Au-delà des analyses Raman, des analyses multivariées telles que l’analyse de la
composante principale (ACP) et la LDA ont été réalisées pour apprécier la répartition ou la
distribution de nos données selon les différentes zones du cartilage articulaire. L’ACP est une
méthode d’analyse multivariée qui réduit les spectres en un nombre défini de composantes
principales (CP) qui tiennent compte de la variance spectrale. Elle prend en compte l’ensemble
des pixels des spectres pour décrire la variation dans l’image à l’aide d’un petit nombre de
contributions de base (composantes principales) liées aux comportements spectral et spatial 247.
Il résout donc les problèmes susmentionnés de cartes thermiques d'intensité de bande et est
mieux adapté pour gérer les variations biologiques. L'ACP a été utilisée ici pour mettre en
évidence la variabilité existant dans l'enregistrement des ensembles de données spectrales au
104
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
cours des différentes expériences. En tant que méthode non supervisée, l’ACP ne peut être
utilisée à des fins de classification et de prédiction. A ce titre, l’analyse discriminante linéaire
(ADL ou LDA acronyme en anglais) a été utilisée. Car, contrairement à l’ACP, la LDA tente
explicitement de modéliser la différence entre les classes de données. Ces différentes analyses
ont été réalisées sur la matrice de données brutes en utilisant le logiciel R version 3.6.1 (2019-
07-05).
3.1.2.2.2 Analyse des images hyperspectrales Raman (K-means Clustering)
L’analyse des images hyperspectrales a été effectuée à partir de la méthode de K-means
Clustering (KMCA). Cette méthode, à l’instar de l’ACP, permet de discriminer différents
échantillons ou régions d'un échantillon, en fonction des différences dans leur contenu
biochimique, et d'identifier les caractéristiques spectrales qui présentent le plus haut degré de
variabilité 269–271. Cette analyse est basée sur le principe mathématique développé par McQueen
en 1967 272, et qui vise à minimiser les différences au sein d’une zone tissulaire et à maximiser
les différences entre les zones de la matrice. A cet effet, la distance euclidienne est utilisée pour
définir les différences entres les zones (clusters). Ainsi, l’algorithme classe les zones en
fonction des distances. Lorsque tous les points ont été associés à un centroïde, le regroupement
initial est effectué. La deuxième étape consiste à calculer les nouveaux centroïdes en tant que
barycentres des groupes résultant de l'étape précédente. Un nouveau regroupement est mis en
place entre les mêmes points de données et les nouveaux centroïdes. L’opération se répète
jusqu’à ce que les regroupements cessent et génèrent à la fin une image dans laquelle une
couleur représente une classe particulière (cluster) 273,274 pour visualiser l'organisation des amas
dans l'image originale. De ces images constituées, les spectres Raman moyens représentatifs
correspondant aux différents clusters ont été isolés. Par la suite, nous avons déterminé
l’intensité de surface intégrée pour chaque bande Raman clairement identifiable.
3.1.2.2.3 Détermination de l’épaisseur de la matrice péricellulaire
La détermination de l’épaisseur de la matrice péricellulaire a été possible en se servant
des images clusters formées à partir de l’analyse par k-means clustering suivant les différentes
zones. Ainsi, à partir d’un algorithme incorporé dans Witec Project, en utilisant le « curseur
manager R », nous avons pu évaluer l’épaisseur de la MPC en mesurant la distance d’un point
X (immédiatement en contact avec la region de la cellule) et un point Y (intercession avec la
105
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
MEC) (voir tableau IV, colonne 1). Pour chaque zone, nous avons mesuré l’épaisseur en
plusieurs points (50 points au total) sur la MPC prise sur quatre (4) images hyperspectrales
différentes. Par la suite, la moyenne et l’écart-type ont été calculés pour les comparaisons entre
les différentes zones.
3.1.2.3 Analyse statistique
Compte tenu du fait que la distribution de nos données ne suivaient pas une loi normale,
toutes nos analyses statistiques ont été effectuées en utilisant un test non paramétrique,
notamment le test statistique Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks pour
p<0,001 pour le significativité de nos résultats. Pour les comparaisons entre les différentes
zones, le test statistique de Student-Newman-Keuls pour p-value < 0,05 a été appliqué. Toutes
nos données ont été traitées avec le logiciel SigmaPlot for Windows version 11.0 Build
11.0.0.77.
3.1.3 Résultats et Discussion
3.1.3.1 Caractérisation des différentes zones de la matrice cartilagineuse et la concentration
des composants moléculaires des différentes zones
L’application de l’ACP-LDA à partir des spectres bruts recueillis (n= 120 spectres par
zone), nous a permis de caractériser les différentes zones distinctes du cartilage. L’avantage
avec ces deux analyses (l’ACP et la LDA) est qu’elles sont étroitement liées en ce qu'elles
recherchent toutes les deux des combinaisons linéaires de variables expliquant le mieux les
données 275. Contrairement à l’ACP qui ne prend en compte aucune différence de classe, la
LDA tente explicitement de modéliser la différence entre les classes de données. Ainsi, en
appliquant ces deux analyses, nous avons pu constater une séparation des spectres en trois
grappes clairement distinctes correspondant aux différentes zones de la matrice du cartilage
sans toutefois en spécifier les différentes régions construites autour de la cellule individuelle.
Toutes les variables considérées ont été prises dans la région spectrale de 600 à 1800 cm-1 et
tracées par rapport aux trois premières composantes principales. Contrairement aux deux autres
composantes (CP2 et CP3), la composante principale CP1 décrit la plus grande variation,
représentant à elle seule 96,72% de la variance totale. Cette analyse montre la capacité de la
microscopie Raman à mettre en évidence les différentes zones de la matrice du cartilage sans
toutefois distinguer les différentes régions (MT, MPC et les chondrocytes).
106
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
En microscopie Raman, un spectre peut révéler simultanément plusieurs biomolécules
importantes telles que les lipides, les protéines, les glucides et les acides nucléiques. Selon
Barth, chaque biomolécule produit sa signature spectrale en fonction de la nature des liaisons
et des concentrations des molécules. Pour évaluer les changements moléculaires dans le
cartilage suivant les différentes zones, nous avons, à partir des spectres uniques collectés dans
chaque zone, quantifié la teneur en biomolécules dans la matrice du cartilage en calculant
l’intensité intégrée (aire) de certaines bandes Raman référencées 276–279: la bande de 985-1185
cm-1 (attribution de la région glucidique en correlation avec la teneur en PG), la bande de 1200-
1320 cm-1 (bande amide III, correspondant au collagène de type II), 1372-1599 cm-1 (amide II,
attribution des protéines/lipides) et 1601-1762 cm-1 (amide I, attribution du collagène de type
I). La figure (31) montre une concentration des biomolécules évoluant à mesure qu’on s’éloigne
de la surface du cartilage, notamment au niveau de la teneur en collagène II et en
protéoglycanes, principaux composants du cartilage, dont la teneur est plus significative entre
les zones superficielle et profonde (p<0,05).
Figure 31 : La réalisation de l’ACP-LDA à partir des spectres bruts (pris en différents points sur
les chondrocytes, la MPC et la MT) permet une répartition des données distribuées sur le premier
axe Dim 1 (96,72% de la variance totale), avec une classification en trois groupes montrant
distinctement les différentes zones de la matrice du cartilage. Cette distinction est plus représentée
avec la détermination la LDA avec calcul des pourcentages de biens classés.
a
b
107
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Ce résultat est en adéquation avec les observations de Muller et ses collaborateurs 280,
de même que Oswald et ses collaborateurs 281 qui ont respectivement montré qu’il était probable
que la plupart, voire la totalité des quantités mesurables dans le cartilage articulaire présentaient
certains types de dépendance avec la profondeur avec notamment pour ce qui concerne les
concentrations des GAGs et de collagène qui augmenterait de la surface à la profondeur. En
tout état de cause, outre les macromolécules (protéoglycanes et fibres de collagène) du cartilage
qui dépendent de la profondeur, de nombreuses autres concentrations moléculaires dans le
cartilage dépendent également de la profondeur.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
850-950 985-1185 1200-1300 1372-1595 1601-1760
Intensité normalisée (
a.u)
Régions spectrales en 1/cm
ZS ZI ZP
***
***
***
***
Figure 32 : Histogramme des différentes concentrations moléculaires par zone du
cartilage articulaire. Calcul des intensités des 120 spectres collectés au niveau de
chaque zone. Une augmentation relative de la concentration des différentes molécules
(protéines, lipides et glucides etc.) selon qu’on s’éloigne de la surface du cartilage
articulaire. Cette différence significative entre le taux de collagène et de protéoglycane
dans les différentes zones superficielle et profonde (p<0,05)
108
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Pics ou bandes
Raman (cm-1)
Assignations
Références
700-900
Conformation des nucléotides
282
985-1185
Région glucidique
276–278
1200-1320
Région amide III
1372-1598
Région amide II
279
1601-1762
Région amide I
279
756
Tryptophane ou Aggrécane à partir de cartilage articulaire bovin
854
Vibrations des chaînes latérales des acides aminés de la proline et de
l'hydroxyproline, ainsi qu'une vibration (C-C) du squelette du collagène
945
Squelette extensible C-C Proline, hydroxyproline, squelette ν (C-C) du
squelette de collagène
1004
Phenylalanine
1094
Phosphodioxy (PO
2
−) groups
1130
Étirement C-O (glucides) ou squelette ν (C-C) du squelette acyle dans les
lipides (transconformation)
1250
Amide III (of collagen II)
1452
Bandes de déformation C-H (groupes fonctionnels CH dans les lipides,
chaînes latérales d'acides aminés des protéines et glucides)
1664
Amide I (collagen I assignment)
Tableau III : Table des assignations des pics et ou bandes Raman
109
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.1.3.2 Caractérisation struturelle de la matrice du cartilage
L’application de l’analyse k-means clustering (KMCA) sur les images hyperspectrales
Raman collectées (n=9 par zone), a conduit à une spécialisation régionale de la matrice
cartilagineuse construite autour de la cellule individuelle (chondrocytes), en matrices
péricellulaire (MPC), territoriale et interterritoriale (constituant la majorité de la MEC)
(Tableau VI, colonne 1). Cette configuration structurelle de la matrice confirme les variations
dans la morphologie et l'orientation des chondrons dépendant de la profondeur, avec des
chondrons discoïdes aplatis dans la zone superficielle, arrondis dans la zone médiane et allongés
et/ou multicellulaires dans la zone profonde (Tableau VI, colonne 1). Les spectres Raman
moyens représentatifs isolés correspondant aux différents clusters sont dépendants des régions
présentant le même ordre d’alignement indépendamment de la profondeur.
La détermination de l’intensité intégrée (surface) correspondant à chaque bande dans
chaque spectre Raman moyen, a permis d’obtenir une cartographie de pics en raison de leur
concentration dans chaque région. Cet ensemble de pics Raman révèle les informations
biochimiques et structurelles contenues dans les spectres dans chaque région matricielle. Le
tableau IV présente la cartographie des principaux pics Raman (ou marqueurs Raman) typiques
suivant les régions matricielles de la matrice du cartilage. En rapport avec certaines donnés de
la littérature 198,242,283–285, ces différents pics Raman ont été caractérisés et leurs assignations
biochimiques présentées dans le Tableau V. A première vue, il est intéressant de noter des
différences majeures dans la composition biochimique entre les différentes régions,
indépendamment toutefois des différentes zones du cartilage articulaire.
Dans le compartiment de la MEC, les pics les plus résolus ou représentatifs sont
localisés au niveau des bandes Raman à 857 cm-1 (proline, hydroxyproline), 946 cm-1 (proline,
ν(C-C) épine dorsale du squelette du collagène), 1207 cm-1 (hydroxyproline/tyrosine,
assignation du collagène), 1246 cm-1 (amide III ν(C−N) et δ(N−H) du collagène), 1383 cm-1
(ν(CH3) des glycosaminoglycanes) et 1667 cm-1 (amide I, collagène I). La plupart des pics
identifiés dans cette région sont essentiellement caractéristiques du collagène à l’exception du
pic à 1383 cm-1 attribué aux glycosaminoglycanes. Dans la MEC, le pic à 1207 cm-1 semble
particulièrement résolu contrairement aux autres régions matricielles (Figure 33) et pourrait
être considéré comme un marqueur capital pour différencier la MEC des autres régions en
termes non seulement de la présence, mais de la concentration du collagène de type II. En
somme, ce résultat traduit aisément la nature particulièrement riche de la MEC en collagène
110
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
(50-60% du poids sec) 286, par rapport aux protéoglycanes (15-30% de PGs en poids sec) 286,
traduit ici par le pic à 1383 cm-1 (N-acétyl-glucosamine, attribution de l’acide hyaluronique 287),
squelette principal des GAGs. En effet, la molécule de l’acide hyaluronique est associée à
d’autres glycosaminoglycanes et des protéines non collagéniques pour former de grands
agrégats de protéoglycanes 70. Elle aide à ancrer les protéoglycanes dans la matrice en
empêchant leur déplacement pendant les phases de déformation du tissu, et par ailleurs, aide à
organiser et stabiliser la relation entre les protéoglycanes et le maillage du collagène 17.
Tableau IV : Tableau récapitulatif des pics caractéristiques des différents composants
de la matrice cartilagineuse.
Dans le cartilage articulaire, les chondrocytes sont immédiatement entourés d'une région
matricielle unique appelée matrice péricellulaire (MPC) 52, dont l’ensemble a été qualifié sous
le terme de chondron. En considérant cette entité, les pics les plus résolus ou caractéristiques
sont localisés à 752 cm-1 (GAG), 1007 cm-1 (νs(C−C) de phenylalanine), 1065 cm-1 (νs (OSO3−)
GAGs), 1079 cm-1 (νs (OSO3−), GAGs), 1130 cm-1 (GAGs), 1173 cm-1 (δ(C-H), assignation
des protéines), 1345 cm-1 (deformation C-H, attribution aux GAGs), 1407 cm-1 ((νsCOO−),
GAGs), 1568 cm-1 (νs(COO−), GAGs) et 1590 cm-1 (phenylalanine/hydroxyproline, Thr)
(Tableau IV et V). Il est remarquable de constater que la majorité des pics extraits de la MPC et
Zones
Régions
Les pics de différenciation (cm-1)
Zone
Superficielle
MEC
862
946
1039
1096
1207
1246
1383
1667
MPC
701
752
1007
1130
1173
1308
1345
1562
1590
CELL
1065
1079
1130
1407
1590
Zone
Intermédiaire
MEC
862
946
1039
1096
1207
1246
1383
1667
MPC
701
759
1007
1130
1173
1345
1554
1568
1591
CELL
1065
1079
1130
1407
1590
Zone
Profonde
MEC
856
944
1039
1096
1205
1247
1383
1667
MPC
702
752
1007
1130
1171
1338
1345
1560
1587
CELL
1065
1079
1130
1407
1590
111
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
du chondrocytes est caractéristique des protéoglycanes. Ce qui traduit la richesse de ces deux
régions matricielles en protéoglycanes et établissant ainsi le lien étroit existant entre ces deux
régions matricielles 288–291. Nos résultats sont en adéquation avec les observations de
nombreuses études antérieures qui avaient également démontré que cette région était
particulièrement riche en protéoglycanes 52,289,290,292. Il est intéressant de préciser que la
majorité des marqueurs du chondron relèvent principalement ceux de la MPC, contrairement
aux chondrocytes. Ce qui n’est pas surprenant, car dans une étude réalisée par Zhang 51, en
comparant les protéomes des chondrons et des chondrocytes isolés, il avait démontré que les
profils protéiques différentiels des chondrons comprenaient principalement des protéines de la
MPC. Ainsi donc, contrairement à la MEC environnante riche en collagènes, la MPC et les
chondrocytes sont particulièrement riche en protéoglycanes 52,289,291,293.
Par ailleurs, deux remarques méritent d’être faites au niveau de ces deux régions. Les
bandes Raman à 1130 cm-1 (C-O stretching (carbohydrates)) et 1590 cm-1 (ν(C=C) aromatic
ring (Phe, Tyr)) sont proportionnellement présentes dans le spectre moyen des deux régions.
Le pic à 1130 cm-1, attribution des GAGs a toujours été considéré comme "l'empreinte digitale"
de la présence des glycosaminoglycanes et de leurs distributions spatiales 287, tandis que le pic
à 1590 cm-1 est l’attribution d’une protéine 294,295. En raison de la présence l’hydroxy-proline
dans sa composition biochimique, ce pic pourrait être attribué à un collagène. En effet, la
présence de la forme hydroxylée de la proline permet la formation de liaisons covalentes entre
différentes chaînes polypeptidiques voisines. Ce qui a pour but de rendre la structure plus
résistante. Dans le cartilage articulaire, seules les fibres de collagène sont très résistantes à des
forces de traction dans le sens de la longueur 296. De plus, la présence d'hydroxyproline protège
les protéines contre la digestion par les protéases. Des études ont montré que les protocoles
d’isolement enzymatique des chondrons ont tiré parti de la résistance de la MPC et plus
particulièrement du collagène de type VI, à la digestion de la dispase et la collagénase 297 et à
l’aggrécanase-1 (ADAMTS-4), l’hyaluronidase bactérienne et la chondroïtinase ABC 298. Par
conséquent, ce pic pourrait être considéré comme le marqueur du collagène de type VI.
Se référant à la littérature, la MPC dans un cartilage articulaire adulte normal, a été
définie par la localisation et la présence exclusive ou à des concentrations plus élevées de
collagène de type VI 52,289,291,293 autour du chondrocyte et de perlécane 299. Ces deux protéines
matricielles sont réputés être essentiels dans le développement normal du cartilage qui, avec la
maturation se localise progressivement autour de la cellule jusqu’à ce qu’il se retrouve
exclusivement ou à des concentrations élevées dans la MPC du cartilage adulte 300–302. La
112
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
présence des pics à 1130 cm-1 et 1590 cm-1 aussi bien dans la MPC et que dans le chondrocyte
pourrait être considérée non seulement comme les signatures spectrales du perlécane et du
collagène de type VI respectivement, mais traduire la présence de ces deux protéines dans les
deux régions, justifiant ainsi les fortes interactions entre la MPC et les chondrocytes. En effet,
le perlécane est un PG de sulfate d’héparane de grande taille qui se trouve en grande
concentration dans la MPC et co-localisé avec le collagène de type VI dans le cartilage
articulaire normal 290,299,303. Cette protéine a été trouvée essentielle dans le développement
normal du cartilage, facilitant la fixation in vitro des chondrocytes. Il a la capacité de porter des
chaines de chondroïtine sulfate (CS), mais également des chaines d’héparane sulfate (HS) 299,
ayant une forte affinité de liaison électrostatique pour le collagène de type VI et interagit avec
d’autres protéines telles que la fibronectine et la laminine via sa protéine de base et à travers
ses chaînes HS 304–306. Ces différentes interactions permettent au perlécane de jouer un rôle
important dans l'organisation structurelle et la stabilisation de la MPC du cartilage.
Le collagène de type VI est quant à lui définie à la fois comme une protéine structurale
et de signalisation. Comme le perlécane, le collagène de type VI est également localisé
exclusivement ou en quantité importante dans la région péricellulaire du cartilage normal, et
facilite la fixation des cellules, mais aussi relie les tissus apparentés à la matrice environnante
1207 cm-1
Figure 33 : Spectres moyens des clusters de la MEC (en bleu), la MPC (en rouge) et les chondrocytes
(en vert) après prétraitement et normalisation par rapport à la région spectrale de 600 à 1800 cm-1
113
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
307,308. Composant majeur du MPC, le collagène de type VI stabilise les phénotypes
chondrocytaires et est essentiel à la survie des chondrocytes 51. Dans de nombreuses études, il
a été montré que le collagène de type VI joue un rôle critique dans les propriétés biomécaniques
de la MPC et régule la transduction et la transmission des contraintes mécaniques et osmotiques
de la MEC à la MPC, et donc au chondrocyte 50,291. A ce titre, le collagène de type VI apparaît
comme un capteur précoce de la réponse de blessure/réparation et peut réguler la fibrogenèse
en modulant les intéractions cellule-cellule. Par ailleurs, il est spécialisé dans la stimulation de
la prolifération des cellules mésenchymateuses et empêcher l’apoptose cellulaire 309,310.
En tout état de cause, à proximité immédiate des chondrocytes, la MPC apparaît comme
le microenvironnement de ceux-ci 49,57 de sorte que tout signal biochimique ou biophysique
perçu par le chondrocyte est susceptible d'être influencé et potentiellement régulé par les
propriétés de la MPC 291 et vice versa. La MPC canalise la communication entre les
chondrocytes et la MEC 50, agissant ainsi comme un transducteur ou filtre essentiel des signaux
biochimiques et biomécaniques du chondrocyte, permettant de réguler l’équilibre
homéostatique de l’activité métabolique des chondrocytes, réponse aux signaux
environnementaux.
Parmi les marqueurs de la MPC, trois bandes Raman se distinguent particulièrement
dans les trois zones de la matrice du cartilage. Les pics 1308 cm-1 (Amide III, étirement
asymétrique C-N dans les amines aromatiques asymétriques), 1554 cm-1 (Amide II ; étirement
C-N et flexion N-H) et 1338 cm-1 (δ(N-H) et ν(C-N); Amide III, hélice α hydratée) dans la zone
superficielle, médiane et profonde, respectivement. Ces différents pics sont tous des
caractéristiques des pics protéiques du collagène. On pourrait donc supposer que la présence de
ces trois pics distincts dans la MPC dans les différentes zones soit sûrement des indicateurs
essentiels soit des différences dans la morphologie des chondrons dépendant de la profondeur
311, mais également de l’orientation des fibrilles de collagène. Autrement, ces trois pics ont été
considérés comme de bons indicateurs dans le suivi de la progression de l’arthrose, à cause de
leur situation géographique zonale.
114
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Tableau V : Tableau des assignations des pics ou marqueurs caractéristiques identifiés
au niveau de chaque région de la matrice du cartilage articulaire
Pics (cm-1)
Assignations
Références
701/2-45
ν(C–S) trans (amino acid methionine)
312
752/9
Symmetric breathing of tryptophan (protein assignment)/
Tryptophan ou Aggrecan from bovine articular cartilage
171,313–316
857/62
Amino acid side chain vibrations of proline &
hydroxyproline, as well as a (C-C) vibration of the collagen backbone
315,317
946
Proline, hydroxyproline,
ν(C-C) skeletal of collagen backbone
171,315
1007
Phenylalanine
ν(CO), ν(CC), δ(OCH), ring (polysaccharides, pectin)
318,319
1039
Stretching C–O ribose, ω(CH
2
), Phenylalanine
318,320
1065
νs(S=O) (GAG), vibration d'étirement symétrique du groupe OSO
3
-,
attribution de la chondroitine-4-sulfate
287
1079
Glycosaminoglycanes, vibration d'étirement symétrique du groupe OSO
3
-,
attribution de la chondroitine-6-sulfate
287
1096
Phosphodioxy (PO
2
−) groups
Ring, C–N–R2 stretch
321,322
1130
C-N stretching (proteins)
C-O stretching (carbohydrates)
ν(C-C) skeletal of acyl backbone in lipid (transconformation)
224, 315,323
1171/3
Tyrosine (collagen type I)
δ(C-H), tyrosine (protein assignment)
Cytosine, guanine
313, 315,324
1205/7
Differences in collagen content
Hydroxyproline, tyrosine (collagen assignment)
Amide III & CH2 wagging vibrations from glycine backbone & proline side
chains Collagen
325,326
1246
Amide III (of collagen II)
315,327
1308
C-N asymetric stretching in asymetric aromatic amine
CH3/CH2 twisting, wagging &/or bending mode of collagen and lipids
315,318
1338
CH
2
/CH
3
twisting, wagging &/or bending mode of collagen, nucleic acid &
tryptophan and lipids// Amide III & CH2 wagging vibration from glycine
backbone and proline chain
315,327
1345
C-H deformation (proteins and carbohydrates)
Glycosaminoglycans, δ(C-H)( CH2)
287,317
1383
CH
3
band/ N-acétyl-galactosamine (sulfate de chondroïtine)
171,285
1407
νsCOO− (IgG?), Sciss. (CH
2
)
328,329
115
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1554
Amide II, COO−
(60)
1560/8
Tryptophan, Tyrosine, amide II, COO−
330–332
1587/90
Phenylalanine, hydroxyproline
ν(C=C) aromatic ring (Phe, Tyr) / Phe, Thr
315,333
1667
Amide I (of collagen I)
116
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.1.3.3 Caractérisation de l’épaisseur de la matrice péricellulaire (MPC)
La MPC est une fine couche spécialisée qui entoure immédiatement les chondrocytes
qui, avec la ou les cellules enfermées, ont été appelées «chondrons» 49,52. Les zones
(superficielles, moyennes, profondes) peuvent être identifiées par la structure et la composition
de la matrice extracellulaire (comme démontré plus haut), ainsi que par la forme et la disposition
des cellules dans le tissu. Les différentes images clusters collectées suivant les zones ont mis
en évidence des variations significatives dans la morphologie et de l'orientation des
chondrocytes et des chondrons avec la profondeur, montrant ainsi des chondrons discoïdes
aplatis dans la zone superficielle, arrondis dans la zone médiane et allongés et/ou
multicellulaires dans la zone profonde (Tableau VI, colonne 1). La caractérisation de l’épaisseur
de la MPC a été réalisée en déterminant, sur l’image cluster de la MPC dans chaque zone,
plusieurs mesures du périmètre de celle-ci. Ainsi, à partir de plusieurs points (50 au total)
mesurés sur 4 différentes images hyperspectrales prise sur différents échantillons (Tableau VI,
colonne 1), nous avons déterminé l’épaisseur de la MPC. Le calcul de la moyenne et l’écart-
type ont permis d’effectuer les comparaisons de la taille de la MPC autour des cellules entre
suivant les différentes zones. Il est intéressant de constater une variation significative croissante
de la zone superficielle à la zone profonde (zone superficielle est = 2,7±0,8, zone intermédiaire
= 3,6±1,1et la zone profonde = 4,9±1,8) (Tableau VI, colonne 4).
Figure 34: Histogramme des moyennes et écart-types calculés de l’épaisseur de
la matrice péricellulaire (MPC). Données recueillies à 50 points sur 4 différentes
images hyperspectrales mettant en evidence la MPC. Difference significative
(p<0,001) entre les épaisseurs de la MPC dans les différentes zones
ZS ZI ZP
R/PCM 2.7477 3.5705 4.8714
0
1
2
3
4
5
6
7
Epaisseur MPC (µm)
***
117
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Cette constatation est en adéquation avec les résultats de Youn et al 50 qui ont abouti aux
mêmes observations montrant une épaisseur de la MPC augmentant avec la profondeur. Cette
différence dans la morphologie de la MPC avec la profondeur a été caractérisée par les
différences dans les types et les modèles de compression, de cisaillement et de pression
hydrostatique entraînant des changements dans la distribution, l'organisation, la synthèse et les
taux de renouvellement de divers composants de la matrice, assurant un rôle de protecteur des
chondrocytes lors des charges mécaniques et aide à maintenir le phénotype chondrocytaire.
118
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Cellules des différentes zones du
cartilage articulaire
Spectres moyens des clusters de la matrice cartilagineuse par zone
Epaisseur de la matrice
péricellulaire (MPC)
2,7±0,8
3,6±1,1
Zone superficielle
Zone intermédiaire
MPC
MEC
Cellule
MPC
MEC
Cellule
a
b
d
e
119
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
4,9±1,8
Zone profonde
Cellule
MEC
MPC
c
f
Tableau VI : Images hyperspectrales reconstruites de la matrice de cartilage dans les zones superficielle (a), médiane (c) et profonde (e) après
traitement k-means Clustering ; alignement des spectres Raman moyens isolés des clusters correspondant aux principaux composants de la
matrice du cartilage (vert : chondrocyte, rouge : matrice péricellulaire et vert bleu : matrice territoriale (ou MEC) suivant les différentes zones
superficielle (b), zone médiane (d), zone profonde (f). détermination de l’épaisseur de la matrice péricellulaire dépendante de la profondeur
120
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.1.3.4 Caractérisation du module d’élasticité (module de Young)
La capacité du cartilage articulaire à remplir ses diverses fonctions est intimement liée
à ses propriétés biomécaniques. L’utilisation de la microscopie à force atomique a permis
d’évaluer les propriétés biomécaniques du cartilage articulaire. Les mesures ont été réalisées de
sur les différents échantillons de la zone superficielle à la zone profonde en s’aidant du biseau
initialement réalisé lors de la biopsie, mais aussi de l’orientation des chondrons dans chaque
zone.
De façon successive, nous avons effectué plusieurs mesures AFM de la matrice globale
suivant les différentes zones, mais spécifiquement nous avons déterminé le module d’élasticité
(E0) des différentes régions que sont la MEC, la MPC et la cellule en isolant à chaque fois les
régions non concernées. Par la suite, nous avons calculé la moyenne et l’écart type résultant des
mesures effectuées aussi bien au niveau de la matrice globale suivant les différentes zones que
des différentes régions matricielles. Les résultats sont illustrés dans le tableau VII et montrent
un module d’élasticité significativement variable de la matrice extracellulaire à la cellule
individuelle (matrice extracellulaire E0 = 94,87±44,07, matrice péricellulaire E0 = 44,83±20,91
et le chondrocyte E0 = 15,30 ± 7,65). Dans des études antérieures, de telles différences ont
également été observées en sondant le module de Young de la zone superficielle à la zone
profonde. Toutes ces variations dans la caractérisation du module d’élasticité (E0) traduisent à
la fois l’inhomogénéité de la matrice du cartilage sur toute son épaisseur et sa complexité.
Ces résultats montrent une parfaite complémentarité entre la microscopie à force
atomique et la microscopie confocale Raman pour la caractérisation des propriétés
biomécaniques de la microstructure de la matrice du cartilage.
121
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Différentes régions
Distribution des valeurs de MY
Moyenne MY (kPa)
94,87 ± 44,07
41,83 ± 20,91
MEC
MPC
A
B
C
E
F
D
122
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
15,30 ± 7,65
c
Cellule
I
G
H
123
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.1.4 Conclusion partielle 1
La simplicité superficielle du cartilage articulaire cache sa complexité sous-jacente.
L’organisation microstructurale du cartilage articulaire est intimement liée au métabolisme
cellulaire et à la fonction biomécanique des tissus 259. La capacité à caractériser la composition
et la distribution de la matrice du cartilage et les marqueurs spécifiques à chaque région
matricielle est essentielle pour comprendre le processus par lequel le cartilage articulaire subit
une dégénérescence liée à la maladie, mais aussi pour développer de nouvelles stratégies de
réparation tissulaire, afin de restaurer la fonctionnalité des tissus 334.
L’évaluation du tissu cartilagineux à partir de la microscopie confocale Raman utilisée
dans notre étude, a permis de mettre en évidence les variations significatives dans la
morphologie, la taille et l’orientation des chondrons à travers toute la profondeur de la matrice.
A mesure qu’on s’éloigne de la surface articulaire, la concentration des biomolécules est de
plus en plus importante. En utilisant la méthode d’analyse k-means clustering appliquée sur les
images hyperspectrales, a conduit à une régionalisation de la matrice en matrice extracellulaire
(MEC), matrice péricellulaire construite autour de la cellule individuelle (chondrocyte). Cette
organisation structurelle est caractérisée par une répartition variable spécifique des composants
biochimiques, avec une MEC riche en collagènes, notamment le collagène de type II,
contrairement à la matrice péricellulaire et le chondrocyte plus riches en protéoglycanes,
indépendamment des différentes zones de la matrice. Le calcul de l’épaisseur de la matrice
péricellulaire a également montré une variation significative de celle-ci dépendant de la
profondeur. En outre, la détermination du module de Young (YM) de la matrice, à partir de la
microscopie à force atomique, a montré des variations significatives de la matrice cartilagineuse
avec respectivement un module de Young E0 = 94,87±44,07 pour la matrice extracellulaire, E0
= 44,83±20,91 pour matrice péricellulaire E0 = 15,30 ± 7,65 pour et le chondrocyte. Ces
différences entre la matrice extracellulaire, la matrice péricellulaire et le chondrocyte, traduisent
les inhomogénéités de la matrice cartilagineuse qu’il convient d’intégrer dans les conceptions
de tissus cartilagineux par ingénierie tissulaire.
Toutes ces variations dans l’organisation morphologique et moléculaire de la matrice
traduisent la complexité de la matrice du cartilage qui méritent d’être pris en compte dans la
conception de tissu de construction par ingénierie tissulaire. Aussi, la caractérisation des
différences biochimiques spécifiques de la matrice articulaire, a-t-il montré une
complémentarité entre la méthode d’analyse k-means clustering (KMCA) et la microscopie
confocale Raman pour une évaluation plus détaillée du tissu cartilagineux.
124
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.2 Caractérisation des mécanismes sous-jacents au développement de
tissus cartilagineux par ingénierie tissulaire : dédifférenciation des
chondrocytes et différenciation des cellules souches mésenchymateuses
humaines (hCSMs) en chondrocytes
125
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.2.1 Introduction
La difficulté du cartilage articulaire à se régénérer a suscité le développement de
nouvelles approches thérapeutiques pour remplacer le cartilage lésé. A ce jour, deux sources de
cellules progénitrices sont exploitées pour la réparation des défauts cartilagineux pour des
applications cliniques : les chondrocytes, seules résidentes et responsables du renouvellement
de la MEC dégradée et, les cellules souches mésenchymateuses pour leur capacité à se
différencier en plusieurs types cellulaires, y compris les chondrocytes 151. L’implantation des
chondrocytes autologues (ICA) est l’une des stratégies de réparation cellulaire les plus utilisées
pour le cartilage articulaire. L’idée est de combler le défaut cartilagineux avec des chondrocytes
autologues prélevés directement sur le patient sur une articulation saine non portante, puis
amplifier in vitro et réimplantés. Malgré tous les progrès réalisés avec l’ICA au cours des deux
dernières décennies, l'un des principaux obstacles à la réparation réussie du cartilage est la
dédifférenciation des chondrocytes pendant la phase d'expansion en culture monocouche. Au
lieu d’un cartilage hyalin attendu, les chondrocytes se dédifférencient pour adopter un
phénotype fibroblastique en produisant des protéoglycanes non spécifiques et de collagène de
type I 129,140.
L’amélioration de ces stratégies intègrent désormais l’utilisation de cellules souches
mésenchymateuses (CSM) pour obtenir un nombre suffisant de cellules pour l’implantation 123.
En raison de leur adhérence à la boîte de culture, elles peuvent être développées en culture tout
en conservant leur multipotence 152. De ce fait, elles peuvent être induites pour générer des
chondrocytes 153,154. Des études antérieures ont révélé des propriétés immunomodulatrices des
CSM qui peuvent être exploitées pour le traitement des affections inflammatoires et
rhumatismales 154,155. De plus, les CSM peuvent migrer vers les sites de lésion et induire une
tolérance périphérique en inhibant la libération de cellules souches pro-inflammatoires. Ce qui
fait des CSM de bons candidats.
En général, l’évaluation de la formation de la matrice cartilagineuse est réalisée par des
dosages biologiques, tels que l'immunocytochimie, le tri cellulaire activé par fluorescence, la
réaction en chaîne par polymérase et l'analyse d'hybridation in situ de l'ARN, pour identifier et
caractériser le phénotype chondrocytaire. L’objectif est de mesurer l'expression de gènes
spécifiques, notamment le collagène de type II et les GAGs (en particulier l’aggrécane). Sur le
plan pratique, ces techniques sont très invasives et laborieux, nécessitant en plus des marqueurs
ou des lyses cellulaires et la fixation cellulaire.
126
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
La nécessité de méthodes non invasives plus rapides pour caractériser et surveiller les
mécanismes chondrogéniques in situ et en temps réel est évidente. La spectroscopie Raman a
largement été utilisée pour analyser des échantillons biologiques, y compris des tissus et des
cellules. Il s’agit d’une technique analytique bien établie capable de déterminer la composition
chimique et les interactions moléculaires dans des échantillons micrométriques. Elle ne
nécessite pas de préparation et ni de contact avec l’échantillon, l’utilisation d’étiquettes et/ou
de produits chimiques améliorant le contraste. En raison de ses caractéristiques non destructives
et sans étiquette, cette technique semble approprier pour les mesures in situ. Dans de
nombreuses études, la spectroscopie Raman a été utilisée pour étudier les cellules vivantes in
situ 195,335,336 ainsi que divers changements biochimiques liés au cycle cellulaire et à la mort
cellulaire 337,338.
Dans ce travail, nous démontrons que la microscopie confocale Raman est capable de
caractériser les changements dans le phénotype des chondrocytes isolés de leur environnement
tridimensionnel (3D) et de suivre les changements biochimiques au cours de la différenciation
des cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSCs).
3.2.2 Matériels et Méthodes
3.2.2.1 Les sources cellulaires
Deux types d’échantillons ont été exploités dans ce travail. Le premier groupe
d’échantillons était constitué de chondrocytes humains isolés du cartilage du genou d’un patient
après son consentement éclairé. Par la suite, les chondrocytes ont été isolés par digestion
enzymatique par la collagénase, puis expansés par passage en série en culture monocouche 2D.
Cette procédure a été répétée jusqu'au passage quatre (P4), passage au cours duquel la vitesse
de croissance en monocouche est estimée insuffisante pour maintenir un nombre de cellules
suffisant pour une production supplémentaire 3. Ces expériences ont été répétées trois fois à
différentes dates : un jeu de passage P1 à P4 en mai 2019 et deux jeux en octobre 2019, puis
des comparaisons ont été effectuées pour apprécier la dédifférenciation et caractériser les
marqueurs Raman. Les chondrocytes étaient directement expansés sur des lames CaF2 pour les
besoins des mesures Raman. Le second type d’échantillons était constitué de cellules souches
mésenchymateuses humaines (hCSMs) indifférenciées. Les cellules ont été granulées dans des
tubes coniques et maintenir dans des milieux chondrogéniques, additionnés ou non avec le
facteur de croissance transformant-bêta 3 (TGF-β3) pendant 21 jours. Les micropellets obtenus
ont été lavés plusieurs fois (au moins trois fois) avec du PBS 5%, puis fixés sur des lames CaF2
127
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
avec du Cell-Tak®, puis immergées dans une boite de Pétri contenant du PBS pour les mesures
Raman.
Toutes les cultures cellulaires ont été réalisées et fournies par l’équipe Danièle de
l’Institut de Médecine Régénérative et Biothérapies Montpellier (IRMB). Les tissus sains ont
été récupérés après approbation par l'Agence de la Biomédecine (N° d'autorisation : PFS16-
006) pour les sujets post mortem ou pour les patients amputés (C17-53). L'étude a été menée
conformément aux directives et règlements du Comité d'éthique du CHU de Montpellier du
Languedoc-Roussillon avec l'approbation du ministère de l'Éducation, de l'Enseignement
supérieur et de la Recherche.
3.2.2.2 Analyse morphologique des chondrocytes dédifférenciés
Pour observer le phénomène de dédifférenciation, plusieurs images optiques ont été
réalisées pour chaque passage à l’aide du microscope optique à large champ avec un objectif
CP-ACHROMAT 10x/0,25 Ph1). Par la suite, les images ont été traitées avec le logiciel
ImageJ® en utilisant un système de changement de contraste afin de visualiser et compter les
cellules (mesures relatives). Cette application a la possibilité de déterminer automatiquement
le nombre de cellules relativement à partir de paramètres, tels que de forme, surface, périmètre,
de diamètre de Feret (décrit la distance moyenne entre les paires de tangentes parallèles au
contour projeté de la cellule sélectionnée) et bien d'autres caractéristiques (voir Tableau VIII).
Toutes les images ont été réalisées à l’échelle de « 500 pixels jusqu’à l’infinie » pour toutes les
cellules lors de l’enregistrement des différents paramètres. Sur les résultats obtenus, on pouvait
directement lire la valeur de la circularité des cellules à chaque passage. Cette circularité peut
être aussi déterminée en calculant le facteur de forme (S) suivant la formule ci-dessous :
Où A correspond à la surface de la cellule et p au périmètre de la cellule avec π =
3.14159. La circularité est comprise entre 0 et 1. De sorte que pour S= 1, les cellules sont
considérées comme ayant une forme circulaire et pour S< 1 ou proche de 0, les celles ont une
forme allongée (caractérisant le phenotype fibroblastique).
S =
4πA
p2
Avec S
ε
[0, 1]
128
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.2.2.3 Traitement et Analyse des données spectrales Raman
Pour les chondrocytes dédifférenciés, pour chaque passage de P1 à P4, des mesures
spectrales Raman (50 spectres pris à différents endroits sur les cellules) ont été effectuées. Le
même procédé a été utilisé pour collecter les spectres Raman sur les hMSCs différenciées. Bien
évidemment, avant de soumettre les données spectrales à des analyses statistiques, tous les
spectres Raman ont subi un prétraitement au moyen de techniques bien établies et
antérieurement décrites 339,340, afin d’obtenir des spectres ayant la même échelle et de permettre
des comparaisons cohérentes là où les variations d'intensité peuvent être relatives à l'intensité
de chaque spectre 242. La plage de longueurs d’onde (ou encore « empreintes digitales »)
comprise entre 600-1800 cm-1 a été considérée pour les analyses spectrales, en raison de sa
spécificité moléculaire plus élevée. Sur la base des rapports de surface de bande Raman
normalisés, le suivi et la caractérisation des différents échantillons ont été effectifs en
s’appuyant sur certaines bandes Raman de l’ADN, du collagène et des protéoglycanes. Car,
cela a permis d’évaluer la concentration relative des biomolécules au sein de chaque échantillon
341. Des images optiques Raman ont été également réalisées à chaque passage (Figure 35).
Par ailleurs, des analyses chimiométriques telles que l’analyse de la composante
principale (ACP), l’analyse linéaire discriminante (LDA) et la dérivée seconde ont été réalisées
pour apprécier à la fois la distinction entre les échantillons et caractériser les variations
biochimiques. L’ACP est une méthode d’analyse multivariée qui réduit les spectres en un
nombre défini de composantes principales (CP) qui tiennent compte de la variance spectrale.
Elle prend en compte l’ensemble des pixels des spectres pour décrire la variation dans l’image
à l’aide d’un petit nombre de contributions de base (composantes principales) liées aux
comportements spectral et spatial 247. Il résout donc les problèmes susmentionnés de cartes
thermiques d'intensité de bande et est mieux adapté pour gérer les variations biologiques.
L'ACP a été utilisée ici pour mettre en évidence la variabilité existant dans l'enregistrement des
ensembles de données spectrales au cours des différentes expériences. En tant que méthode
non supervisée, l’ACP ne peut être utilisée à des fins de classification et de prédiction. A ce
titre, l’analyse discriminante linéaire (ADL ou LDA acronyme en anglais) a été utilisée. Car,
contrairement à l’ACP, la LDA tente explicitement de modéliser la différence entre les classes
de données. Les différentes analyses ACP et LDA ont été réalisées sur la matrice de données
brutes en utilisant le logiciel R version 3.6.1 (2019-07-05). Dans certaines conditions, nous
avons appliqué la dérivée seconde pour identifier et caractériser de façon spécifique certaines
différences subtiles entre les échantillons.
129
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.2.3 Analyses statistiques
Compte tenu du fait que la distribution de nos données ne suivaient pas une loi normale,
toutes nos analyses statistiques ont été effectuées en utilisant un test non paramétrique,
notamment le test statistique Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks pour
p<0,001 pour le significativité de nos résultats. Pour les comparaisons entre les différentes
zones, le test statistique de Student-Newman-Keuls pour p-value < 0,05 a été appliqué. Toutes
nos données ont été traitées avec le logiciel SigmaPlot for Windows version 11.0 Build
11.0.0.77.
3.2.4 Résultats
3.2.4.1 Analyse morphologique des chondrocytes dédifférenciés
Les chondrocytes dans le cartilage articulaire évoluent dans un environnement
tridimensionnel (3D). Isolés de leur milieu habituel pour être ensemencés dans des cultures 2D,
les chondrocytes ont connu un changement dans leur morphologie. Ces changements
morphologiques ont été mis en évidence par le calcul de la circularité qui renseigne la taille de
la cellule. Dans le tableau I, la colonne de la circularité (Cir), nous pouvons observer une
décroissante de la circularité des cellules au fil et à mesure des passages. Ce qui traduit la
dédifférenciation des cellules qui, d’une forme plus ou moins arrondie (P1), adoptent une
morphologie plus allongée (P4). En effet, dans des conditions de culture monocouche ou 2D,
les chondrocytes sont forcés d'abandonner leur forme ronde afin d'adhérer au plastique pour
survivre adoptant ainsi un autre phénotype fibroblastique. Cette observation peut être visualisée
sur la figure 35 (images optiques Raman) qui montre les cellules à chaque passage et mettant
ainsi en correlation les changements morphologiques micrométriques intervenus à mesure que
le nombre de passage augmente. Les transformations dans la morphologique des cellules au fil
des passages sont évidentes : d’une cellule plus ou moins ronde et sans flagelle à P1, les cellules
adoptent une morphologie de plus allongée avec le développement des flagelles pour mieux
adhérer à la lame CaF2.
130
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Slice Count Total Area
Average
Size %Area Perim.
Circ.
Solidité Feret Feret X
P1
178
571126
3208,573
5,077
850,684
0,072
0,509
119,355
2201
P2
371
1239578
3341,181
11,018
1139,351
0,044
0,434
127,055
2387,046
P3
410
1479863
3609,422
13,154
1162,983
0,045
0,435
123,892
2221,98
P4
354
1885260
5325,593
16,758
1740,815
0,032
0,39
156,784
2267,904
Tableau VIII : Détermination de la circularité des cellules suivant les passages (P1 à P4) à partir des
images optiques collectées et traitées avec ImageJ®. Les changements peuvent être observés avec la
diminution de la circularité (S) des cellules décroit au fil des passages. La circularité à P4 est plus faible
par rapport aux autres passages (P1, P2 et P3). Les cellules à P4 présentent une morphologie plus
grande avec un aspect plus allongé. Les cellules à P2 et P3 présentent sensiblement la même densité
cellulaire, mais aussi la même morphologie et un aspect un peu moins allongé par rapport à P4.
Abréviations : Count = Estimation nombre des cellules/boite ; Perim = Périmètre ; Cir = Circularité
P1
P2
P3
P4
Figure 35 : Images optiques Raman des cellules aux différents passages de P1 à P4.
131
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.2.4.2 Analyse des données spectrales des chondrocytes dédifférenciées
A partir de certaines bandes Raman choisies pour leurs spécificités moléculaires, mais
aussi pour leur capacité à fournir des informations biochimiques et structurelles importantes sur
les cellules, la concentration relative des biomolécules a été caractérisée. Le calcul de la
moyenne et l’écart-type des rapports d’intensité de chaque bande Raman (n= 50
spectres/passages) permet de discriminer les différents passages et d’apprécier les différences
moléculaires au sein des spectres des chondrocytes au fil des passages. En principe, l’intensité
des bandes Raman mesurées est linéairement proportionnelle à la concentration des constituants
moléculaires. Sur les trois groupes d’échantillons, les variabilités dans le rapport d’intensité
sont diverses et difficilement interprétables. Cependant, ces trois échantillons semblent
sensiblement présenter le même profil au niveau des bandes Raman à 1063 cm-1 (attribution
des GAGs), 1255 cm-1 (attribution du collagène de type II), 1449 cm-1 (protéines/lipides) et à
1659 cm-1 (attribution du collagène de type I) au fil des passages. Les bandes à 1063 cm-1 et
1255 cm-1 sont connues pour renseigner sur la teneur en protéoglycanes et en collagène de type
II, respectivement 4,198,341. Ces deux bandes présentent une diminution progressive du taux de
protéoglycanes et de collagène de type II dans le milieu au fur et à mesure des passages.
A l’inverse, nous avons un taux de collagène de type I, représenté par la bande à 1659
cm-1 qui croit progressivement avec les passages. Autre constat, la bande à 1449 cm-1 (bande
de déformation CH) présente une variabilité dans la concentration biomoléculaire au fil des
passages, avec notamment un pic à P2 et diminue progressivement par la suite. Dans les
analyses Raman, la bande à 1449 cm-1 renseigne sur la concentration totale relative des
protéines et lipides et permet par ailleurs, d’apprécier la contribution du cytoplasme
environnant. Cette bande a été trouvée est insensible à certaines conformations
environnementales, de sorte qu’elle est parfois considérée comme norme d’intensité 342. En
observant le comportement des cellules à chaque passage et le pic à P2, nous pouvons suggérer
que le passage à P2 est largement suffisant pour obtenir une densité cellulaire importante,
capable de faciliter la redifférenciation des chondrocytes dans des cultures en suspension. Par
conséquent, la bande Raman à 1449 cm-1 pourrait être considérée comme un indicateur pour
renseigner sur la viabilité des cellules, sur leur croissance et ou la mort cellulaire.
Nos résultats sur la dédifférenciation des chondrocytes ont été comparés avec des
analyses de quantification de l’expression des gènes principaux impliqués dans la
chondrogenèse. Les tests qPCR ont montré des expressions du collagène, aussi bien de type IIA
132
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
et IIB et de l’aggrécane (ACAN) qui sont régulées négativement, contrairement à celle du
collagène de type I (Col A1) qui est régulée positivement (Figure 36.d).
Tableau IX : Table des assignations des pics et ou bandes Raman caractéristiques
Pics ou bandes
Raman (cm-1)
Assignations
756
Tryptophane ou Aggrécane à partir de cartilage articulaire bovin
788
C’
5
-O-P-O-C’
3
phosphodiester bands in DNA
854
Vibrations des chaînes latérales des acides aminés de la proline et de
l'hydroxyproline, ainsi qu'une vibration (C-C) du squelette du collagène
945
Squelette extensible C-C Proline, hydroxyproline, squelette ν (C-C) du
squelette de collagène
1004
Phenylalanine
1063
C-C skeletal stretch random conformation / νs(S=O) (GAG)
1094
Phosphodioxy (PO
2
−) groups
1130
Étirement C-O (glucides) ou squelette ν (C-C) du squelette acyle dans les
lipides (transconformation)
1250
Amide III (of collagen II)
1452
Bandes de déformation C-H (groupes fonctionnels CH dans les lipides, chaînes
latérales d'acides aminés des protéines et glucides)
1664
Amide I (collagen I assignment)
133
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Figure 36 : Caractérisation des principaux marqueurs du cartilage articulaire. (a, b, c) Caractérisation du
rapport d’intensité de certaines bandes Raman choisies en raison de leurs spécificités moléculaires et leur
capacité à fournir des informations biochimiques indispensables sur les changements conformationnels lors
de la dédifférenciation des chondrocytes. Variations significatives entre les différents échantillons. De façon
particulière, les bandes localisées à 1063 cm-1 (attribution des GAG) et 1255 cm-1 (attribution du collagène
de type II) présentent une intensité de signal Raman qui diminue progressivement pour les GAGs et le
collagène de type II au fil des différents passages (P1, P2, P3 et P4), contrairement à celle de la bande à
1659 cm-1 (attribution du collagène de type I),) qui augmente plutôt avec les passages. (d) L’expression
génique par qPCR des principaux gènes impliqués dans la chondrogenèse, notamment le collagène de type
IIA et IIB, l’aggrécane (ACAN) et le collagène de type I (Col IA) et SOX9. Le test génique présente une
régulation à la baisse des gènes du col IIA et IIB, ainsi que de l’ACAN, tandis les gènes du col IA et de SOX
sont régulés à la hausse. Valeur de significativité a été déterminée pour p<0,0
0
2
4
6
8
788 853 942 1004 1063 1125 1255 1449 1659
Intensité normalisée (a.u)
Bandes Raman caractéristiques en 1/cm
Dédifférenciation OCT G1
P1.1 P2.1 P3.1 P4.1
0
2
4
6
8
788 853 942 1004 1063 1125 1255 1449 1659
Intensité normalisée (a.u)
Bandes Raman caractéristiques en 1/cm
Dédifférenciation OCT G2
P1.2 P2.2 P3.2 P4.2
0
2
4
6
8
10
788 853 942 1004 1063 1125 1255 1449 1659
Intensité normalisée (a.u)
Bandes Raman caractéristiques en 1/cm
Dédifférenciation Mai
P1 P2 P3 P4
a
b
c
d
134
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Figure 37 : L’application de l’ACP-LDA. (a, b) vue
de la représentation de l’ACP appliquée aux
différents groupes A= P1, B= P2, C= P3 et D= P4.
Les emplacements relatifs des signaux sur le tracé
sont la résultante des concentrations relatives des
biomolécules dans chaque échantillon. (a)
application de l’ACP montrant la dispersion des
différents spectres par passage, représentés par les
points et constitués en grappes dans l’espace.
Certains points se chevauchent démontrant les
similitudes qui peuvent exister entre les différents
passages. (b) Fusion des grappes P2 et P3 à cause
des fortes similitudes entre ces milieux. (c, d)
Application de la LDA par détermination des biens
classés.
c
d
a
b
135
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.2.4.3 Suivi de la maturation du cartilage artificiel (différenciation des hCSM)
Sur les différents milieux de cultures, plusieurs spectres Raman (50 spectres au total)
ont été collectés à différents endroits et sur différentes cellules. Des comparaisons entre les
deux milieux ont été possible en calculant le rapport d’intensité de signal Raman dans les
spectres afin de pouvoir les différencier. Le profil spectral des hCSMs supplémentées avec le
TGF-β3 présente une instensité de signal Raman plus élevée par rapport aux hCSMs sans
induction de TGF-β3. Les intensités calculés des bandes Raman choisies montrent clairement
des différences significatives entre les deux milieux (Figure 38.A). Ce qui a permis de deduire
que les hCSMs supplmentées avec le TGF-β3 sont largement différenciées par rapport au
groupe contrôle sans TGF-β3. Les tests de quantification q-PCR des gènes impliqués dans la
chondrocgénèse ont abouti au même résultat (Figure 38.B et C).
0
1
2
3
4
5
6
7
764 867 944 1007 1094 1131 1252 1451 1661
Intensité normalisée
Pics caractéristiques Raman en cm-1
TGFb TGFb*
Figure 38 : Différenciation des cellules souches
mésenchymateuses humaines (hMSC) en chondrocytes.
(A) rapport d’intensité des bandes Raman
caractéristiques des hCSM différenciées (courbe en
orange) et non différenciées, après 21 jours de culture.
(B, C) expression génique (tests qPCR) des principaux
marqueurs impliqués dans la chondrogenèse. Les gènes
chondrogéniques sont fortement exprimés au décours de
21 jours de culture dans les hCSM supplémentées avec
du TGF-β3, contrairement aux hCSM sans TGF-β3.
Col2B Agg Sox9 Col10
J21 - TGFb3 0.005 0.0041 0.0415 0.0052
J21 +TGFb3 0.0927 0.2083 0.1938 1.2209
0
0.5
1
1.5
Expression génique
Marqueurs chondrogéniques
Analyse q-PCR
J21 - TGFb3 J21 +TGFb3
J21 - TGFb3 J21 +TGFb3
Col1 14.8151 86.2828
0
20
40
60
80
100
Col A1
A
B
C
136
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.2.4.4 Caractérisation des principaux marqueurs ou des pics Raman de différenciation
Les spectres moyens des hCSMs supplémentées avec ou non du TGF-β3 sont présentés
sur la figure 39. A première vue, les différences entre les spectres moyens des deux échantillons
sont clairement observables et, caractérisées par un rapport d’intensité de signal plus élevé dans
le spectre des hCSMs supplémentées avec le TGF-β3 (spectre bleu). Ces différences peuvent
être observées, en particulier au niveau des bandes à 762 cm-1 (Pyrimidine ring breathing
mode), 862 cm-1 (Phosphate group : Hydroxyproline (collagen I)), 943 cm-1 (ν(C-C) (protein
backbone)), 1040 cm-1 (Phenylalanine of collagen), 1078 cm-1 (v(C-C) or v(C-O), GAG), 1094
cm-1 (Symmetric PO2− stretching vibration of the DNA backbone), 1131 cm-1 (ν(C-C), ν(C-N),
empreinte digitale des GAG), 1168 cm-1 (ν(C-C)), 1254 cm-1 (amide III, ν(C–N) and δ(N–H),
collagène II), 1452 cm-1 (C–H deformation bands of proteins and lipids) et 1661 cm-1 (amide
I, ν(C=C), collagène I).
D’autres différences, dont les bandes sont moins résolues, peuvent être identifiées au
niveau des bandes à 702 cm-1 (v(C-S) trans (aminoacid methionine)), 729 cm-1 (v(C-C)
stretching), 1342 cm-1 (biomolécules cytoplasmiques) et 1736 cm-1 (C=O stretching (lipids)).
Ces changements dans les spectres Raman suggèrent la formation de matrice cartilagineuse et
une accumulation de biomolécules dans les milieux supplémentés avec le TGF-β3.
Figure 39 : Spectres moyens des différents des hCSM différenciées (en bleu) et non
différenciées (en rouge) sans ou avec du TGF-β3.
137
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.2.5 Discussion
L’introduction de l’ingénierie tissulaire dans le domaine biomédical suscite beaucoup
d’espoir pour le développement de tissus cartilagineux fonctionnels pour la réparation du
cartilage articulaire lésé. Les approches intègrent l’implantation de chondrocytes autologues
(ICA) ou l’emploi de cellules souches mésenchymateuses humaines (hCSMs) pour induire un
tissu cartilagineux équivalent biomécaniquement et fonctionnellement. Cependant, les efforts
déployés jusque-là peinent encore à satisfaire les attentes des patients.
Dans cette étude, nous avons, à partir de la microscopie confocale Raman, évalué les
mécanismes sous-jacents à la production de tissus cartilagineux par ingénierie tissulaire. Ainsi,
nous avons évalué simultanément les phénomènes de dédifférenciation des chondrocytes et la
différenciation des hCSMs en chondrocyte par la méthode de culture en pastilles pendant 21
jours.
Concernant la dédifférenciation des chondrocytes, les images Raman des cellules
réalisées pour chaque passage, donnent d’observer un changement dans la morphologie de
celles-ci. Du passage P1 où les cellules semblent plus ou moins rondes et sans flagelles, elles
commencent à adopter une forme de plus en plus allongée avec des flagelles (Figure 28). Cette
observation a été corrélée par la détermination de la circularité (S) des cellules à chaque
passage. Il faut rappeler que la circularité permet d’apprécier la morphologie des cellules
comprise entre 0 et 1. Plus la valeur calculé est proche de 1, plus la cellule présente une
morphologie plus ronde, et inversement, ont une morphologie allongée quand la circularité se
rapproche de zéro. Il est intéressant de constater que de P1 à P4, la circularité décroit
significativement (Voir tableau VIII). Ce qui montre bien un changement significatif dans la
morphologie des cellules qui, de la forme plus ou moins ronde (S= 0,072), adoptent à une forme
plutôt allongée et donc fibroblastique (S= 0,032). Nos résultats sont en adéquation avec
certaines études qui ont montré que lorsque les chondrocytes sont cultivés en monocouche, ils
perdent rapidement leurs caractéristiques morphologiques et synthétiques spécifiques, et se
comportent comme des fibroblastes indifférenciés. Schuh et collaborateurs en 2010 343, dans
leur étude sur « Effet de l'élasticité de la matrice sur le maintien du phénotype
chondrogénique », avaient montré que l’expansion en monocouche des chondrocytes étaient
associée à des modifications dans l’organisation du cytosquelette d’actine F en formant des
fibres de stress bien définies et exhibant plus de phénotype fibroblastique. En général, les
chondrocytes évoluent dans un environnement tridimensionnel (3D). Pour accroître le nombre
de cellules, ils sont isolés du tissu cartilagineux par digestion enzymatique à l’aide de la
138
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
collagénase et sont ensuite expansés en culture monocouche pour amplifier le nombre total de
cellules. Ces cellules sont secondairement utilisées pour combler les défauts cartilagineux dans
la technique d’implantation de chondrocyte autologues (ICA).
Ces différences morphologiques ont été, par ailleurs, mises en évidence par la réalisation
de l’ACP-LDA qui est une méthode d’analyse multivariée permettant de discriminer différents
échantillons en fonction des différences dans leur contenu biochimique et d’identifier les
caractéristiques spectrales. La figure 37 présente une représentation par grappes de la
distribution spatiale des différents échantillons (P1 à P4). Un fait remarquable, les grappes P2
et P3 semblent totalement fusionnées en raison des fortes similarités spectrales (37.a et b). Ce
qui suggère par ailleurs, qu’il n’y aurait presqu’aucune différence significative entre les cellules
du passage 2 au passage P3. Par conséquent, le nombre de passages jusqu’à P2 serait largement
convenable pour obtenir une densité cellulaire acceptable. La distribution des signaux spectraux
sont le résultat des concentrations relatives des sources de chaque échantillon selon leurs
spécificités biochimiques. Chaque spectre est représenté sur le graphique de scores par un point.
Les spectres similaires se regroupent dans certaines régions, alors que les spectres très différents
sont largement séparés. Ce qui permet de classer les spectres en fonction de leur similarité. De
sorte qu’il est plus aisé d’apprécier les différences entre les différents groupes. Il faut préciser
que l'ACP est une méthode non supervisée et ne peut donc pas être utilisée à des fins de
classification et de prédiction. C'est pourquoi, nous avons utilisé l'analyse discriminante linéaire
(LDA) pour apprécier la répartition ou la distribution des données spectrales et modéliser la
différence entre les classes de données. L’application de l’ACP-LDA sur l’ensemble des
données associées aux différents passages montre bien une séparation entre les différents
groupe d’échantillon, quand bien même certains points semblent se chevaucher.
Pour identifier les marqueurs Raman associés à la dédifférenciation des chondrocytes,
nous avons collecté plusieurs spectres Raman des cellules à chaque passage. Quel que soit le
nombre de passages, les spectres Raman collectés semblaient sensiblement identiques à
première vue. Toutefois, en comparant les intensité de signal Raman de certaines bandes,
notamment les bandes à 788 cm-1, 853 cm-1, 942 cm-1, 1004 cm-1, 1063 cm-1, 1125 cm-1, 1255
cm-1, 1449 cm-1 et 1659 cm-1, il a été possible de suivre les évènements moléculaires liés à la
dédifférenciation des chondrocytes. Ces bandes ont été choisies particulièrement pour leurs
spécificités moléculaires et pour leur capacité à fournir des informations indispensables sur
l’activité cellulaire et les changements conformationnels éventuels au sein des structures des
protéines et des lipides. De façon particulière, nous nous sommes focalisés sur les bandes à
139
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
1063 cm-1, 1255 cm-1, 1449 cm-1 et 1659 cm-1, attribution des GAGs, du collagène de type II,
protéines et lipides et du collagène de type I, respectivement. Des analyses statistiques de ces
différentes bandes ont montré une diminution significative de la bande des GAGs et du
collagène de type II, notamment entre P1 et P3, tandis la bande du collagène de type I augmente
significativement. En effet, après une légère augmentation à P2, l’intensité de ces bandes
diminue significativement. Cela pourrait expliquer qu’à partir du passage P2, non seulement la
densité cellulaire diminue, mais aussi les cellules perdent les principaux marqueurs (collagène
de type II et les protéoglycanes) du cartilage hyalin, au profit d’un type fibroblastique riche en
collagène de type I. il faut rappeler que les conditions de culture monocouche et le nombre de
passages cellulaires prédisposent les chondrocytes à un changement phénotypique qui les
amènent à abandonner leurs caractéristiques intrinsèques pour s’adapter aux conditions de
culture en adoptant un phénotype fibroblastique 344–346. Nos résultats ont été comparés à des
analyses quantitatives de type qPCR qui ont évalué l’expression des principaux marqueurs
chondrogéniques. Les analyses ont montré une expression génique du collagène de type II (dans
ses deux isoformes A et B) et de l’aggrécane (ACAN) qui est régulée négativement,
contrairement au collagène de type I qui est plutôt régulée positivement. Des études antérieures
avaient montré que les chondrocytes en culture monocouche prolongée, au lieu de produire les
composants spécifiques du cartilage (collagène de type II et protéoglycanes spécifiques),
passent à la fabrication de protéoglycanes non spécifiques et de collagène de type I 129,140. Ces
résultats montrent ainsi la capacité de la microscopie confocale Raman à suivre les
modifications moléculaires associées à la dédifférenciation des chondrocytes en culture
monocouche.
S’intéressant à la différenciation des hCSMs, il faut rappeler que la capacité de
différenciation chondrogénique in vitro des CSM est généralement caractérisée par une
production accrue de collagènes, notamment de collagène de type II, de protéoglycanes et de
glycosaminoglycanes (GAGs) quantifiées à partir des tests immunohistochimiques, tels que
ELISA, les colorations au Safranin-O et Alcian Blue 347 ou la quantification de l’expression des
gènes principaux impliqués dans la chondrogenèse à l’aide des tests RT-PCR. Dans ce travail,
la caractérisation de la différenciation des hCSMs a été analysée à partir de la microscopie
confocale Raman, sans marqueurs. En général, les CSM sont granulées dans des tubes coniques
et maintenir dans un milieu chondrogénique pendant 21 jours. Les pellets obtenus ont été fixés
sur les lames CaF2 avec du Cell-Tak® et plusieurs mesures Raman ont été réalisées. Les
caractéristiques Raman des deux échantillons (hCSM + TGF-β3 et hCSM sans TGF-β3) sont
140
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
présentées sur la figure 39. Les différences entre les deux échantillons sont caractérisées les
bandes Raman à 762 cm-1 (Pyrimidine ring breathing mode), 862 cm-1 (ν (C–C), Hydroxy/Pro,
Tyr), 943 cm-1 (ν(C–C), Pro), 1040 cm-1 (Phenylalanine of collagen), 1078 cm-1 (v(C–C) or
v(C–O)), 1094 cm-1 (Symmetric PO2− stretching vibration of the DNA backbone), 1131 cm-1
(ν(C–C), ν(C–N), GAG), 1168 cm-1 (ν(C–C)), 1254 cm-1 (amide III, ν(C–N) and δ(N–H),
collagène II), 1452 cm-1 (C–H deformation bands of proteins and lipids) et 1661 cm-1 (amide
I, ν(C=C), collagène I). Ces différences sont marquées par de fortes concentrations en protéines
des hCSMs supplémentées avec le TGF-β3, contrairement aux hCSM sans induction TGF-β3.
Ce montre que les hCSMs supplémentées avec le TGF-β3 sont fortement différenciées,
contrairement aux hCSM sans TGF-β3 au terme des 21 jours de culture.
Par ailleurs, en appliquant la dérivée seconde aux spectres moyens, nous avons pu
identifier certaines différences subtiles et caractériser les changements conformationnels entre
les hCSMs différenciées et non différenciées. La dérivée seconde est une technique d’analyse
des spectres Raman permettant une identification plus spécifique des pics d’absorption petits et
voisins qui ne sont pas résolus dans le spectre initial. Cette méthode d’analyse offre donc un
moyen d’augmenter la spécificité des pics d’absorption de certaines molécules dans
l’échantillon. De sorte qu’elle soit capable de fournir des informations qualitatives à l’analyse
sur l’identification de l’échantillon. Les caractéristiques spectrales transformées des hCSMs
différenciées et non différenciées sont résumées sur la figure 40 (A) et (B) et les attributions
dans le tableau X. Outre les bandes Raman caractéristiques identifiées dans le spectre initial,
bien qu’elles soient légèrement décalées après l’application de la dérivée seconde, d’autres
bandes peuvent être identifiées. Il s’agit pour le spectre des hCSMs différenciées, notamment
des bandes localisées à 653 cm-1 (Tyr), 780 cm-1 (U,C,T), 820 cm-1 (C–C), 923 cm-1 (C–C),
973 cm-1 (C–C), 1068 cm-1 (OSO3–), 1275 cm-1 (α-hélice, amide III), 1300 cm-1 (lipides), 1321
cm-1 (α-hélice, amide III), 1345 cm-1 (A,G, biomolecules cytoplasmiques), 1385 cm-1 (CH3),
1409 cm-1 (νs(COO−), GAG), 1465 cm-1 (C–H), 1528 cm-1 (–C=C–), 1554 cm-1 (Trp), 1584
cm-1 (δ(C=C), Phe), 1634 cm-1 (δ(H2O), Amide I) et 1741 cm-1 (C=O). Ces différences
observées dans le spectre des hCSMs différenciées sont plus marquées par des vibrations
protéiques et glucidiques. Les changements conformationnels essentiels intéressent plus les
structures de la protéine secondaire dans la région amide I (1585-1720 cm-1) et III (1200-1300
cm-1). D’autres peuvent être observés avec les modes de vibrations des cycles aromatiques du
tryptophane (Trp), la tyrosine (Tyr), la proline (Pro) et la phenylalanine (Phe) qui sont de grands
diffuseurs Raman 348. Tous ces changements conformationnels dans le spectre des hCSMs
141
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
supplémentées avec le TGF-β3, sont le signe d’une concentration importante en collagènes et
en protéoglycanes.
Contrairement aux hCSMs supplémentées avec le TGF-β3, les hCSMs non
supplémentées présentent une structure plus riche en phosphate et en lipides, caractérisée
notamment par la présence de la bande à 961 cm-1 (v1PO4 3-, attribution de phosphate de
l’hydroxyapatite (HA) plus abondant dans la MEC de l’os). Cette bande a été, par ailleurs,
assimilée à la vibration d’étirement calcium-phosphate, signe d’une quantité importante de
cholestérol dans le milieu. Autrement, le milieu non supplémenté avec le TGF-β3 tend à
développer une structure hypertrophique, processus similaire observé dans la minéralisation de
858
884
923
948
972
1039
1104
1135
1165
839
961
1183
1068
703
765
780
653
624
680
713
1250
1214
1276
1300
1321
1345
1385
1528
1554
1584
1634
1664
1741
1765
1463
1409
1373
1478
1681
1564
1729
1308
A
B
1333
1238
Figure 40 : Caractéristiques de la dérivée seconde des spectres moyens. (A) dérivée
seconde dans la région de longueur d’onde de 600 – 1200 cm-1 ; (B) dérivée seconde dans
la région de longueur d’onde de 1200 – 1800 cm-1
142
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
l’os. Il est connu que les milieux supplémentés avec le TGFβ induisent la prolifération et la
différenciation chondrogénique des cellules souches mésenchymateuses, conduisant à la fois à
une régulation à la baisse des gènes du collagène de type I, puis à une régulation à la hausse des
gènes du collagène de type II et de l'aggrécane 163. En effet, les ligands du TGFβ inhibent la
maturation des chondrocytes hypertrophiques et stabilisent le phénotype pré-hypertrophique
des chondrocytes 165. C’est d’ailleurs pour cela que certains conseillent de retirer le TGFβ du
milieu lorsqu’on veut différencier les cellules souches mésenchymateuses humaines en
chondrocytes hypertrophiques. Ces résultats traduisent ainsi l’intérêt de ces morphogènes dans
l’ingénierie du tissu cartilagineux, car ils interagissent les uns avec les autres pour contrôler de
nombreux aspects de la biologie cellulaire, notamment la prolifération, la différenciation, la
sécrétion de la MEC et l’apoptose des cellules.
143
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Tableau X : Modes vibratoires et assignations des bandes Raman des spectres moyens
transformés des hCSM supplémentées avec le TGFβ3 et les hCSM sans TGFβ3
hCSM supplémentées avec TGF-β3
hCSM sans TGF-β3
Raman shift
[1/cm]
Assignations
Raman shift
[1/cm]
Assignations
653
C-C twisting mode of tyrosine
624
C-C twist Phe
782
U, T, C (ring breathing modes in the
DNA/RNA bases)
680
Ring breathing modes in the DNA bases
820
C-C stretch of proline and hydroxyproline
713
C N (membranes phospholipids
head)/adenine
923
C-C, proline ring (collagen assignment)
804
Uracil-based ring breathing mode
973
C-C backbone (collagen assignment)
839
Deformative vibrations od amine groups
1068
Stretching C-O ribose
898
Monosaccharides (β-glucose), (C-O-C)
skeletal mode
1275
Amide III (α-helix)
961
Symmetric stretching vibration of v
1
PO
4
3-
(phosphate of HA)
1300
δ(CH
2
)
1185
Anti-symmetric phosphate vibrations
1321
Amide III (α-helix)
1214
Stretching of C-N
1345
CH deformation (proteins and
carbohydrates, biomolecules cytoplasmic)
1235
Amide III
1385
CH
3
band
1308
C-N asymmetric stretching in asymmetric
aromatic amines
1409
vs COO- (IgG)
1333
Guanine
1465
Lipids
1376
T, A, G (ring breathing modes of the
DNA/RNA bases)
1528
In-plane vibrations of the conjugated –
C=C-
1478
C=N stretching
1554
Tryptophan
1564
COO-
1584
C=C bending mode of phenylalanine
1681
Amide I (Disordered structure; non
hydrogen bonded)
1634
δ(H
2
O, Amide III
1729
Ester group
1741
Ester group
En comparant le spectre Raman moyen des hCSMs différenciées à celui d’un cartilage
natif humain, il est intéressant de constater que ces deux échantillons présentent sensiblement
le même motif spectral (Figure 41). Les différences majeures sont caractérisées par les bandes
à 654, 702, 728, 1128, 1300 cm-1, et 618, 825, 1210 cm-1, pour les hCSM différenciées et le
cartilage articulaire natif, respectivement. Les assignations de ces bandes sont résumées dans
le tableau XI. Cela qui démontre que les 21 jours de cultures sont largement suffisants pour
144
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
obtenir un tissu de construction génique qui soit comparable au cartilage natif. La grosse
différence entre les deux échantillons est marquée par une structure des hCSM plus riche en
plus riche en lipides et en cholestérol (présence des bandes à 702 et 1300 cm-1) avec une activité
nucléotidique (600 à 900 cm-1) qui semble importante également par rapport au cartilage natif.
Tableau XI : Assignations et caractérisation biochimique des bandes Raman de
différenciation entre les hCSM différenciées et le cartilage natif
Bandes Raman
(cm-1)
Modes vibratoires ou
Assignment
Caractéristiques biochimiques
618
ν(C-C)
Protéine (Phe)
654
ν(C-C)
Tyrosine
702
v(C-S)
Cholesterol, Cholesterol ester
728
ν(C-C)
Proline (collagen assignment)
825
ν
1
(OPO)
DNA (Proline, hydroxyproline, Tyr)
1128
ν(C–C)
Lipides
1210
C-C
6
H
5
stretching mode
Tyr and Phe
1300
δ(CH
2
)
Lipides, acides gras
Figure 41 : Spectres moyens comparatifs entre les hCSM différenciées (en bleu) et le cartilage
articulaire natif (en rouge)
Conformation
nucléotidique
600-800 cm
-1
GAG
1130 cm-1
Lipides
1300 cm-1
145
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.2.6 Conclusion partielle 2
L’introduction de l’ingénierie tissulaire dans le domaine biomédical suscite beaucoup
d’espoir pour le développement de tissus cartilagineux fonctionnels pour la réparation du
cartilage articulaire lésé. Les approches intègrent l’implantation de chondrocytes autologues
(ICA) ou l’emploi de cellules souches mésenchymateuses humaines (hCSMs) pour induire un
tissu cartilagineux équivalent biomécaniquement et fonctionnellement. Cependant, les efforts
déployés jusque-là peinent encore à satisfaire les attentes des patients.
La surveillance de la croissance des tissus en culture cellulaire reste un défi majeur,
malgré les techniques analytiques actuelles qui permettent de sonder de nombreux facteurs tels
que l’expression de l’ARN, l’expression des protéines intracellulaires/extracellulaire et les
composants exogènes. L’évaluation des processus de dédifférenciation des chondrocytes et de
différenciation des hCSM différenciées, a montré la capacité de la microscopie confocale
Raman (MCR) à suivre en réel les changements biochimiques intracellulaires et
extracellulaires. A partir des données spectrales, il a été possible de caractériser les différents
échantillons et d’identifier de façon qualitative et quantitative les marqueurs Raman
spécifiques. Lors du suivi de la dédifférenciation des chondrocytes, le passage P2 peut être
considéré comme suffisant pour obtenir une densité cellulaire qui soit nécessaire à la
redifférenciation des cellules. Par conséquent, au-delà des bandes Raman à 1063, 1255 et 1665
cm-1, qui permettent de suivre les changements dans la composition des GAG, du collagène de
type II et du collagène de type I, principalement, la bande Raman à 1449 cm-1 peut être un bon
indicateur pour suivre la densité cellulaire au cours de la dédifférenciation. Aussi, la MCR s’est-
elle montré efficace pour suivre la maturation du cartilage artificiel à base de cellules souches
mésenchymateuses humains supplémentées avec le TGFβ3 et identifiée les marqueurs Raman
associés. Ces différentes bandes Raman identifiées pourraient servir d’indicateurs pour la
surveillance des hCSMs différenciées versus les hCSM non différenciées.
En somme, contrairement aux méthodes conventionnelles, telles que l'histologie et
l'immunohistochimie, qui ne fournissent que des informations sur la présence de composés
spécifiques, la spectroscopie Raman crée une «empreinte digitale» représentant l'ensemble de
la composition moléculaire de l'échantillon étudié, sans à priori et sans marquage.
146
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.3 Caractérisation de cartilage articulaire arthrosique humain
147
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.3.1 Introduction
Définir plus simplement, le corps humain est composé principalement d’eau, de
protéines, d’acide nucléique, de lipides et de glucides. Par conséquent, tout changement dans
l’organisme à la suite des maladies, entrainerait des modifications biochimiques de l’un ou
l’ensemble de ces composants. Par ailleurs, si les spectres vibratoires sont sensibles à la
structure de ces composants, ils doivent donc évoluer avec l’état malade. Selon l’OARSI
(Association Internationale pour l’étude de l’arthrose), l’arthrose est une maladie grave défini
comme un trouble impliquant des articulations mobiles, caractérisé par un stress adhésif et la
dégradation de la matrice extracellulaire, résultant de macro, et de microdommages qui activent
des réponses restauratrices adaptatives anormales, y compris les voies pro-inflammatoires du
système immunitaire 5.
Longtemps, le diagnostic de l’arthrose s’est fait sur la base des scores de Kellgren-
Lawrence (0 à 4 échelles), méthode universellement reconnue et basée sur une classification
radiographique de l'arthrose articulaire 349. L’inconvénient est que cette technique n’est valable
et réalisable que dans les stades avancés d’arthrose. Récemment, les techniques de
spectroscopies Raman ont été montrées capables non seulement pour fournir de façon non
invasive et non destructive l’information structurelle dans le cartilage endommagé, mais aussi
de permettre une résolution spatiale au niveau biomoléculaire qui puisse être utile dans des
analyses structurelles détaillées des maladies cartilagineuses. En effet, ces techniques peuvent
identifier les groupes fonctionnels et les liaisons chimiques présents dans les tissus biologiques
et / ou les cellules. De ce fait, il est possible non seulement d’évaluer la structure des protéines,
des lipides, des glucides et des acides nucléiques présents dans une molécule biologique, mais
également les modifications de leur structure chimique dues au processus pathologique,
permettant ainsi de surveiller la progression du processus pathologique et de prédire la voie
chimique de la progression.
Dans de récentes études, l’utilisation de la spectroscopie Raman a permis d’identifier
certains marqueurs impliqués dans la dégradation du collagène de type II et des protéoglycanes
(notamment l’aggrécane) dans l’avènement de l’arthrose 350–352. La spectroscopie vibrationnelle
apparait ainsi comme un outil analytique éprouvé pour comprendre les changements chimiques
associés aux conditions pathologiques dans les tissus.
L’intérêt de notre étude était de caractériser le cartilage articulaire humain dégradé et
d’identifier de façon précoce les modifications cellulaires précurseures au changement
phénotypique de la matrice dans arthrose.
148
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.3.2 Matériel et méthodes
3.3.2.1 Préparation des échantillons
Nos échantillons étaient constitués des explants de cartilage articulaires prélevés sur le
genou d’un patient. Les biopsies ont été réalisées sur le même genou aussi bien sur le site de
cartilage dégradé et à distance de site de la lésion pour le tissu contrôle. Les tissus humains ont
été obtenus à des fins de recherche avec le consentement du donneur. L'étude a également été
approuvée pour la récupération d'échantillons OA par le Ministère de la Recherche et de
l'Innovation et le Comité d'Éthique de la Protection des Données Personnelles (CPP) du
Languedoc-Roussillon (agrément DC-2010-1185). Les tissus sains ont été récupérés après
approbation par l'Agence de la Biomédecine (N ° d'autorisation: PFS16-006) pour les sujets
post mortem ou pour les patients amputés (C17-53). Les échantillons de cartilage ont été
prélevés chez le même patient.
3.3.2.1.1 Préparation des coupes histologiques
La préparation des échantillons s’est faite suivant une technique développée par
Kawamoto en 1990 qui a été modifié dans le cadre de notre étude. Tous les échantillons ont
d’abord été congelés dans de l’hexane refroidissant à -94°C. L’échantillon congelé a été placé
dans un récipient en acier inoxydable suivant le plan des coupes et recouvert d’un gel de
carboxyméthylcellulose (CMC) à 5%. L’ensemble (récipient + échantillon + gel) est plongé
dans l’hexane refroidissant tout en préservant la surface de toute immersion dans le réfrigérant
pour éviter les fissures pendant la congélation jusqu’à formation d’un bloc. Les blocs obtenus
ont été placés dans une boite et conservés à -80°C jusqu’au jour des coupes histologiques.
Toutes les coupes ont été réalisées au cryostat Leica 3050 dans une chambre cryogénique à -
20°C à l’Institut de Neurosciences de Montpellier (INM). Plusieurs coupes d’une épaisseur de
40 à 60µm ont été réalisées avec une lame coupante de carbure de tungstène montée et ayant
un angle de jeu de 5°. L’échantillon a été coupé à une vitesse n’excédant pas 4mm/s. La section
a été ensuite étalée sur des lames de verre (dimension 25x75x 1.0 mm, Menzel-Glaser,
Superfrost Plus® Gold) pour les analyses immunohistochimiques et des lames CaF2 pour les
mesures Raman et les analyses au microscope force atomique (AFM).
149
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.3.2.1.2 Techniques de fixation des coupes sur les lames CaF2
Pour éviter la mobilité des échantillons sur les lames CaF2 lors des mesures Raman et
AFM, toutes les coupes ont été immobilisées avec du Cell-Tak®, un adhésif tissulaire à base de
protéines polyphénoliques largement utilisé (Corning Cell-Tak), et connu pour se lier fortement
à pratiquement toutes les surfaces inorganiques et organiques dans des environnements aqueux
226. L’immobilisation a été réalisée en suivant la méthode d'étalement manuelle du fabricant en
mélangeant 10 µl de Cell-Tak dans de l'acide acétique à 5% dans un tube Eppendorf® à l'aide
d'une pointe de micropipette. Le mélange a été étalé sur la lame CaF2 et laisser à l’air ambiant
jusqu’à adsorption de l’acide acétique pendant au moins 30 minutes. Après évaporation de
l'acide acétique, le reste du Cell-Tak a été aspiré avec la micropipette, puis la lame a été lavée
avec de l'éthanol à 95% et rincée à deux reprises avec de l'eau stérile. Enfin, les coupes
hydratées avec du PBS ont été étalées avec soin sur la lame pendant au moins 30 min jusqu’à
adhérence complète et l’ensemble a été déposer dans une boite de pétri et du PBS (quantité
raisonnable) a été ajouté pour l’analyse soit au Raman ou à l’AFM.
3.3.2.1.3 Préparation et mesures Raman des échantillons
Les coupes réalisées ont été fixées avec du Cell-Tak® (une colle adhésive) sur les lames
CaF2, puis déposées dans une boite de Pétri contenant du PBS pour les mesures Raman. Durant
toute la période des mesures, les échantillons ont été conservés au réfrigérateur à 4°C. Toutes
les mesures ont été réalisées à l'aide d'un Microscope confocal Raman Witec α 300R (Witec,
Ulm, Allemagne). Le système est équipé d'un laser à double fréquence Nd : YAG (Newport,
Evry, France) avec une longueur d'onde de 532 nm et un objectif aérien × 20 NIKON avec
ouverture numérique NA de 0,46 (Nikon, Tokyo, Japon). La puissance laser de sortie était de
50 mW. La résolution spatiale était de 300 nm et la résolution en profondeur d'environ 1 μm.
Le microscope est équipé d'un étage de balayage piezodriven avec une précision de
positionnement de 2 à 3 nm à l'horizontale et de 10 nm verticalement, respectivement. Le temps
d'acquisition d'un seul spectre a été fixé à 0,5 s. 150 × 150 points par image ont été enregistrés,
ce qui a donné au total 22 500 spectres pour une image. L'acquisition de données a été réalisée
à l'aide du logiciel Image Plus 2.08 de Witec. À l'aide d'un filtre de bord, les rayonnements
Raman rétrodiffusés ont été séparés de la lumière dispersée de Rayleigh. Les photons Raman
ont été transférés à la caméra EMCCD (DU 970N-BV353, Andor, Hartford, États-Unis). La
taille de la puce EMCCD est de 1600 × 200 pixels, le contrôleur de la caméra est un
150
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
convertisseur A/D 16 bits fonctionnant à 2,5 MHz, et la caméra est refroidie par un système
Pelletier. Le système de spectroscopie UHTS 300 avec une transmission de 70% et un réseau
de 600 lignes par mm (fonctionnant à -60° C) offrent une résolution spectrale de 3-5cm-1. Ce
microscope a été utilisé pour l’analyse des structures du cartilage articulaire.
3.3.2.2 Analyse des données spectrales Raman
Tous les spectres collectés ont subi un prétraitement afin d’obtenir des spectres ayant
non seulement la même échelle, mais comparables entre eux. L'analyse spectrale a été réalisée
dans la plage des empreintes digitales (600-1800 cm-1) en raison de sa spécificité moléculaire
plus élevée. Avant l’analyse statistique multivariée, les spectres Raman ont été pré-traités au
moyen de techniques bien établies. Le processus de prétraitement des spectres a consisté dans
un premier temps à la soustraction de la ligne de base suivant la loi polynomiale d’ordre 8. Par
la suite, nous avons procédé à l’élimination de l'autofluorescence des tissus et le lissage des
spectres en utilisant le filtre « Savitzky Galay », suivant un ordre polynomial = 4 avec un
nombre de points (ou intervalle = 13). Afin de comparer les spectres et de permettre des
comparaisons cohérentes là où les variations d'intensité peuvent être relatives à l'intensité de
chaque spectre, les données ont été normalisées par rapport à l’aire de la région comprise entre
600 et 1800 cm-1 242. Ces étapes de prétraitement des spectres ont été nécessaires avant de les
soumettre à des méthodes statistiques. Tous les processus de prétraitement, de normalisation et
détermination des différentes intensités des pics ou bande ont été réalisés avec le logiciel
Spectragryph® version 1.2.12 non commercial développée et offert gracieusement par le Dr
Friedrich Menges.
Par ailleurs, des analyses multivariées telles que l’analyse de la composante principale
(ACP) a été appliquée à l’ensemble des données brutes collectées sur les différents échantillons.
L'ACP est une méthode d'analyse de données multivariée bien établie qui convient parfaitement
pour distinguer les petites variations spectrales récurrentes des grands ensembles de données
contenant des variations non corrélées. Il s'agit d'une méthode d’analyse totalement non
supervisée pour établir si les spectres des échantillons sont ou non regroupés en classes selon
le type d’échantillons entre autres facteurs. Cette méthode permet de réduire considérablement
la taille de l’ensemble des données en un nombre défini de composantes principales (CP), car
tous les spectres sont exprimés en temps de quelques fonctions de base (généralement < 10) et
un « vecteur de score » d’environ p entrées 353. Des spectres similaires présentent des scores
similaires peuvent être utilisés pour discriminer ou regrouper les spectres. Ainsi, si l’on observe
151
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
un regroupement, il y a des variations quantifiables et significatives dans les spectres, qui
peuvent être utilisées pour construire des algorithmes discriminantes pour distinguer les
différents échantillons. L’ACP décrit les grands changements globaux de la composition sans
aucune connaissance préalable.
3.3.3 Analyse statistique
Compte tenu du fait que la distribution de nos données ne suivaient pas une loi normale,
toutes nos analyses statistiques ont été effectuées en utilisant un test non paramétrique,
notamment le test statistique Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks pour
p<0,001 pour le significativité de nos résultats. Pour les comparaisons entre les différentes
zones, le test statistique de Student-Newman-Keuls pour p-value < 0,05 a été appliqué. Toutes
nos données ont été traitées avec le logiciel SigmaPlot for Windows version 11.0 Build
11.0.0.77.
3.3.4 Résultats et Discussion
Les changements pathologiques du cartilage commencent à l’échelle moléculaire (au
niveau nanométrique) d’où ils se propagent à des niveaux supérieurs de l’architecture
hiérarchique du cartilage et causent des dommages structurels et fonctionnels de plus en plus
irréversibles. Bien que l’étiologie de l’arthrose soit en grande partie inconnue, son apparition
est caractérisée par le déséquilibre entre les processus cataboliques et anaboliques, favorisant
la dégradation de la matrice du cartilage. Ce processus de dégradation débute par un épuisement
des PG, suivi de la dégradation du collagène de type II. Ce qui entraine une défaillance
mécanique et finalement une érosion complète du cartilage articulaire. Par conséquent, toute
méthode permettant de diagnostiquer l’apparition de l’arthrose doit détecter les modifications
précoces du gel de PG du cartilage avant que des modifications significatives de sa matrice de
collagène ne se produisent 354,355.
Pour mettre en évidence la dégradation de la matrice du cartilage entre les deux
échantillons, plusieurs spectres Raman ont été réalisés (50 spectres pour chaque échantillons).
Pour analyser l’état de dégradation du cartilage, nous avons effectué plusieurs mesures Raman
sur les différents échantillons (n=2 échantillons de cartilage normal et dégradé). Les spectres
ont été collectés à différents endroits du cartilage normal et du cartilage dégradé. Se basant sur
certaines données de la littérature, nous avons déterminé la teneur en PGs et en collagène de
152
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
type II, deux composants principaux de la matrice, en réalisant respectivement le rapport
d’intensité des régions glucidiques (985 – 1185 cm-1) sur la région amide I (1601 – 1776 cm-1)
11,253,356 et le rapport de l’intensité entre les pics localisés à 1251 et 1271 cm-1 (dont le pic 1241
cm-1 = NH2 bending: random coil Amide III et le pic à 1269 cm-1 = NH2 bending: alpha-helix
Amide III) 350,352,357.
Sur la base des rapports d’intensité, nous avons constaté une diminution significative
des PGs dans le cartilage dégradé, contrairement au cartilage normal. Cette même observation
a été faite en calculant le taux de collagène de type II dans le cartilage dégradé et le cartilage
normal (p<0,001). Ces résultats démontrent les différences structurelles et biochimiques entre
le cartilage normal et le cartilage dégradé.
Par ailleurs, l’application de l’ACP sur les spectres bruts des différents échantillons a
permis de discriminer le cartilage dégradé du cartilage normal et d’identifier les pics Raman
expliquant le mieux les changements biochimiques. La distribution des scores dans le plan
montre que, contrairement à la composante principale (CP3), la CP2 explique le mieux les
valeurs de chargements majeurs impliquées dans la distinction entre les deux échantillons.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
CAO CA
Intensité normalisée (
a.u)
PGs
P=<0,001
A
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
CAO CA
Intensité normalisée (
a.u)
I1251/I1271
P=<0,001
B
Figure 42 : caractérisation du cartilage dégradé : (A) Détermination de la teneur en PGs par le
rapport de la surface de la région glucidique [985 – 1185]/la région amide I [1601 - 1760].
L’histogramme présente un rapport d’intensité plus élevé en faveur du cartilage non dégradé (CA).
Ce qui traduit une diminution du taux de PGs dans le cartilage dégradé. (B) Rapport d’intensité
I1251/I1271 du cartilage dégradé et du cartilage non dégradé (Bonifacio A et al, 2010 ; Yasuhito et
al, 2014). La figure 2 présente un rapport d’intensité entre les pics à 1251/1271 cm-1 plus élevé en
faveur du cartilage dégradé, caractérisant une structure désordonnée de la protéine.
153
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
L’ACP, au-delà de sa capacité à discriminer différents échantillons, elle peut identifier les
groupes fonctionnels et les liaisons chimiques présents dans les tissus biologiques et / ou les
cellules, facilitant ainsi l’évaluation de la structure des protéines, des lipides, des glucides et
des acides nucléiques présents dans une molécule biologique, mais aussi les modifications de
leur structure chimique dues au processus pathologique. Tout ceci permettra de surveiller la
progression du processus pathologique et de prédire la voie chimique de la progression. Les
principales bandes Raman de différence ont été identifiées et caractérisées dans le tableau ci-
dessous (Tableau XII). Les principales bandes Raman responsables des différences entre le
cartilage dégradé et le cartilage normal sont localisées à 788 cm-1 (_ O_P_O _), 821 cm-1 (_ O_P_O
_), 867 cm-1 (ARN), 886 cm-1 (collagen I), 926 cm-1 (ν (C-C)), 945 cm-1 (ν (C-C) backbone),
972 cm-1 (ν (C-C) backbone in ARN), 1107 cm-1 (ν (C-O)), 1165 cm-1 (Tyrosine (collagen type
I)), 1274 cm-1 (Amide III), 1289 cm-1 (_O_P_O_), 1386 cm-1 (GAG), 1432 cm-1 (CH2 scissoring),
1480 cm-1 (CH deformation), 2887 cm-1 (CH2 stretch) et 2947 cm-1 (ʋas CH2, lipids, fatty acids).
Les changements majeurs dans le cartilage dégradé sont caractérisés par des vibrations
des paires de bases d’acide nucléique dans la région de longueur d’onde de 700 à 900 cm-1 et
des structures secondaires des protéines dans la région de longueur d’onde de 1200 à 1500 cm-
1. Différentes bandes Raman correspondant aux vibrations d’étirement du squelette du
phosphate OPO des acides nucléiques peuvent être observées, notamment à 788 cm-1
(ADN/ARN), 821 cm-1 (ARN), 867 cm-1 (ARN). Cette région a été par ailleurs caractérisée par
comme les vibrations d’étirement C_N et C_C et du groupe phosphodiester (OPO) des groupes
de têtes lipidiques 358. Par exemple, la bande à 788 cm-1 contient à la fois la signature spectrale
de chevauchement de l’ADN et de l’ARN, contrairement à la bande à 821 cm-1 qui est
spécifiquement attribuée à l’ARN avec une intensité de signal Raman plus élevée, révèle une
quantité élevée d’ARN. Cette activité est soutenue par la présence de la bande à ARN à 867
cm-1 associée aux vibrations de ribose, l’un des distincts modes de vibrations des ARN avec les
bandes à 915 et 974 cm-1 caractérisées par Chan et al (2006) 359. La présence des bandes Raman
à 921 et 972 cm-1 en complément des bandes sus-mentionnées, pourrait simplement traduire
une grande production d’ARN, autrement une activité transcriptionnelle élevée à l’origine des
perturbations des vibrations des cycles aromatiques C_C traduisant un changement
phénotypique en faveur d’une production de collagène de type I (886 et 1165 cm-1 voir
caractéristiques dans le tableau XII) comme constaté dans le cartilage dégradé.
154
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Figure 43 : Analyse des composants principaux (ACP) et discrimination du cartilage dégradé du
cartilage normal. (A) Tracé des scores ACP utilisant PC1 et PC2. Seule la composante principale
(CP2) sépare les échantillons dégradé/normal ; (B) Graphique des scores ACP utilisant CP2 et
CP3; (C) Spectres Raman moyens du cartilage dégradé et du cartilage normal (n=50 spectres);
(D) Chargement CP2 des bandes Raman responsables de la séparation des échantillons de
cartilage dégradé et normal.
A
B
C
D
155
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
Tableau XII : Table des assignations des pics Raman majeurs impliqués dans la
caractérisation du cartilage articulaire dégradé vs cartilage normal
D’autres changements ont été observés dans la région d’onde de 1200 à 1500 cm-1,
contenant les caractéristiques spectrales correspondant principalement aux caractéristiques
structurelles secondaires des protéines. Les chargements de la CP2 montrent des variations
structurales des protéines secondaires qui sont plus importantes dans le cartilage dégradé et
Cartilage dégradé
Cartilage sain
Raman
shift [1/cm]
Assignations et molécules associées
Raman
shift [1/cm]
Assignations et molécules associées
788
ν
s
(_ O_P_O _) (DNA)
1004
Phe of collagen
821
ν
s
(_ O_P_O _) (RNA)
1312
Amide III band (proteins)
867
ν (Ribose), one of the distinct RNA
modes (with 915 and 974 cm-1)
1343
Cytoplasmic biomolecules
886
ν (C-C) (Proteins, collagen I)
1449
C-H vibration (proteins/lipids)
926
ν (C-C) (Proteins, collagen)
1624
Tryptophan
945
ν (C-C) backbone (protein)
1683
ν (C=O) (Amide I)
972
ν (C-C) backbone in RNA
2864
C= O
1107
ν(C–O), ν(CC), ring (polysaccharides)
2933
ν (CH
3
) (protein)
1165
C, G ; Tyrosine (collagen type I)
1274
T, A, Amide III ; =CH bend
1289
Phosphodiester group in nucleic acid
1386
CH
3
band (GAG)
1432
CH
2
deformation
1480
CH
3
deformation; DNA
2887
v
as
(CH
3
) (lipids, fatty acids)
2947
ʋ
as
CH
2
, lipides, acides gras
156
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
intéressent à la fois les structures des protéoglycanes (bande à 1386 cm-1, correspondant aux
vibrations de la N-acetyl-glucosamine, une des unités disaccharidiques des GAGs) et du
collagène de type II (1274 et 1289 cm-1). La présence de la bande à 1386 cm-1, correspondant à
l’acide hyaluronique, squelette principal des GAGs. Pour un aggrécane, le core protéine se lie
à l’acide hyaluronique qui peut recevoir de nombreux aggrécanes et former des super-agrégats
responsables de l’hydratation du tissu, permettant au cartilage de répondre aux sollicitations
mécaniques. De sorte qu’il aide à organiser et stabiliser la relation entre les PG et le maillage
du collagène. Les modifications au sein de cette glycoprotéine ont été qualifiées comme l’une
des premiers changements associées à l’ostéoarthrose et à l’immobilisation de l’articulation 360.
Un autre changement observé dans cette région spectrale, intéresse la bande Raman CH
à 1449 cm-1 qui, généralement renseigne aussi bien sur la concentration totale des protéines et
lipides, mais également permet d’apprécier la contribution du cytoplasme environnant. En
général, la vibration de deformation CH2 est relativement insensible à la conformation et a été
proposée comme norme d’intensité 342. Dans le cartilage dégradé, cette bande Raman présente
des fortes modifications avec notamment la présence des bandes d’épaulements à 1432 et 1480
cm-1. Cette situation pourrait traduire les éventuelles modifications au sein du squelette
cytoplasmique et ou de l’ADN. Il est connu qu’au cours de l’arthrose, un nombre croissant de
chondrocytes articulaires subit une modulation phénotypique 361 soit vers des cellules aux
caractéristiques hypertrophiques 362,363, soit vers des cellules pouvant être considérées comme
des chondrocytes «dégradants» 364. Ces dernières cellules peuvent synthétiser toutes les
protéases connues dégradant le cartilage et donc jouer probablement un rôle décisif dans la
progression de la maladie. Par exemple, certains auteurs ont montré que l’exposition à des
cytokines inflammatoires, telles que les cytokines inflammatoires (notamment l’interleukines-
1 (IL-1) b et le facteur de nécrose tumorale (TNF)), entrainerait des changements dans la
structure de l’ADN, comme la méthylation, en la rendant plus ou moins compacte, facilitant ou
non l’accessibilité à la molécule de l’ADN et à sa transcription 365,366. Car, dans l’arthrose, les
cytokines régulent à la fois à la baisse l'expression des gènes chondrocytaires, et induisent
l'expression de plusieurs protéases dégradant la matrice. Dans la présente étude, la présence des
deux bandes à 1432 cm-1 (déformation CH2) et la bande à 1480 cm-1 (déformation CH3,
correspondant également à l’ADN) pourrait expliquer aisément les changements non seulement
dans le squelette cytoplasmique, mais également dans la structure de l’ADN.
En s’intéressant par ailleurs à la région de hautes fréquences vibratoires CH (2800 et
3000 cm-1), très caractéristique dans les études spectroscopiques, nous pouvons observer des
157
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
changements caractéristiques dans la concentration des biomolécules. Comme la région CH à
1449 cm-1, cette région fournit également des informations sur la composition chimique des
échantillons en raison des différences dans l'environnement des liaisons C-H 13. Il est donc
possible d’apprécier la concentration (totale relative) des protéines et des lipides, mais aussi sur
les changements des liaisons chimiques. Dans cette région, les protéines ont été caractérisées
par les pics à 2930 cm-1 et un épaulement à 2870 cm-1 367,368, qui pourraient être assimilés ici
par les bandes à 2933 et 2864 cm-1, contrairement aux bandes à 2887 et 2947 cm-1 qui sont
plutôt caractéristiques des lipides, démontrant ainsi l’augmentation du taux de lipides dans le
tissu dégradé. De nombreuses études ont rapporté des dépôts lipidiques dans l’arthrose 369–372,
avec des perturbations dans la composition des acides gras et acide arachidonique au sein des
chondrocytes issus de cartilage arthrosique, dont les quantités augmentent avec la sévérité des
lésions cartilagineuses 373. Cette augmentation du taux de lipides a été associée à la réponse des
chondrocytes face à la dégradation du cartilage en vue de faire face aux changements
physiochimiques intervenues dans la matrice cartilagineuse 359,374. Pour rappel les lipides sont
des nutriments importants dans le métabolisme des chondrocytes et sont disponibles pour ces
cellules par synthèse de novo, mais également par diffusion à partir des tissus environnants. En
présence de lésions du cartilage articulaire, les lipides sont anormalement produits. Dans une
étude réalisée par Amanda et ses collaborateurs en 2013 372, en définissant le statut du cartilage,
ils ont pu mettre en lien le développement de l’arthrose avec la disponibilité des lipides. Dans
plusieurs modèles d'arthrite dégénérative, l'accumulation de lipides précède généralement la
dégénérescence tissulaire locale 375,376. Par exemple, Lippiello et ses coll. 373 avaient montré des
niveaux d'accumulation d'acide lipidique et arachidonique avec un degré croissant de lésion et
de sévérité histologique dans l'arthrose.
Nos résultats suggèrent que la dégradation de la matrice cartilagineuse entraine aussi
bien des modifications dans le squelette cytoplasmique de la cellule associée à une synthèse
d’ADN et sa transcription. Toutes ces modifications pourraient être à l’origine du changement
précoce du phénotype chondrocytaire, ainsi que des perturbations dans les structures
secondaires des protéines. Le phénotype des chondrocytes normaux, comme celui de toutes les
cellules somatiques adultes, est stabilisé par le statut épigénétique de la cellule. Nos résultats
pourraient ainsi démontrer le lien entre le changement phénotypique des chondrocytes et les
changements dans la structure de l’ADN par méthylation.
158
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
3.3.5 Conclusion partielle 3
La dégradation de la matrice cartilagineuse est le point de départ de l’arthrose. En
clinique, l’arthrose n’est diagnostiquée qu’aux stades avancés de la maladie. Ce qui rend la
prise en charge plus difficile eu égard à la capacité limitée du cartilage articulaire à se régénérer
ou à cicatriser spontanément. Par conséquent, caractériser de façon précoce les changements
biochimiques, précurseurs des modifications morphologiques de l’articulation, constituerait
une étape essentielle pour développer des stratégies thérapeutiques. Dans cette étude, la
microscopie confocale Raman a pu caractériser les changements dans la structure de l’ADN
associée au changement phénotypique des chondrocytes dans l’arthrose. Ces résultats montrent
la robustesse de la MCR à fournir des informations biochimiques nécessaires pour caractériser
le cartilage arthrosique et identifier les différents facteurs précoces ou tardifs impliqués dans la
pathogénie de l’arthrose.
159
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
4 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
L'arthrose est l'une des maladies les plus débilitantes et est associée à une charge
personnelle et socio-économique élevée. La nature asymptomatique de l'arthrose est un obstacle
au diagnostic, et l'absence d'un outil de diagnostic précoce empêche le traitement. Les
diagnostics actuels de l’arthrose reposent sur l’évaluation des modifications morphologiques de
l'articulation qui, généralement ne sont constatées que dans les stades avancés de la maladie.
Or, les propriétés chimiques, biologiques et mécaniques des articulations peuvent être
modifiées avant même que les changements morphologiques ne se produisent, ce qui exige un
diagnostic plus précoce de la maladie.
La demande clinique toujours croissante de tissus et de cellules de remplacement a
conduit à une expansion rapide des capacités de recherche dans le domaine de l’ingénierie
tissulaire et de la médecine régénérative. Les approches d’ingénierie tissulaire pour le cartilage
visent à réparer un tissu intrinsèquement hétérogène et à préserver l’intégrité mécanique.
L’évaluation des variations microscopiques dans la composition et la distribution des
biomolécules au sein de la matrice cartilagineuse et des constructions issues de l’ingénierie
tissulaire, mais également de la dégradation de ladite matrice sont primordiales pour assurer un
succès clinique. Au cours du développement cellulaire, de petits changements dans le niveau
de transcription génique entraînent des changements subtils dans la présence et la distribution
des espèces moléculaires. Ces changements induisent un modèle de changements dans les
spectres Raman, qui, s'ils sont correctement caractérisés, peuvent être utilisés comme
«marqueurs moléculaires» pour les changements d'état des cellules.
La surveillance de la croissance des tissus et des cellules en culture cellulaire reste un
défi majeur, malgré les techniques analytiques actuelles, y compris le dosage immuno-
enzymatique (ELISA), la réaction en chaine polymérase et le transfert western, qui permettent
de sonder de nombreux facteurs tels que l’expression de l’ARN, l’expression des protéines
intracellulaires/extracellulaire et les composants exogènes, sont considérées lentes, lourdes et
invasives. Dans cette thèse, l’objectif était de suivre la maturation du cartilage génétique sous
charge mécanique avec des méthodes innovantes de microscopie, telles que la microscopie
confocale Raman, les microscopies à force atomique et multiphotonique. A partir de la
microscopie confocale Raman, nous avons successivement évalué la structure de la matrice du
cartilage et, effectuer la surveillance de la différenciation des cellules souches
mésenchymateuses humaines (hCSMs) vers les chondrocytes, et à l’inverse la de
160
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
dédifférenciation des chondrocytes. En outre, nous avons différencié le cartilage dégradé d’un
cartilage normal.
(1) La caractérisation de la matrice du cartilage
La capacité à caractériser la composition et la distribution de la matrice du cartilage et
les marqueurs spécifiques à chaque région matricielle est essentielle pour comprendre le
processus par lequel le cartilage articulaire subit une dégénérescence liée à la maladie, mais
aussi pour développer de nouvelles stratégies de réparation tissulaire, afin de restaurer la
fonctionnalité des tissus 334. L’imagerie Raman a permis de mettre en évidence la
régionalisation de la matrice cartilagineuse et caractériser les variations significatives dans la
morphologie, la taille et l’orientation des chondrons sur toute la profondeur de la matrice. Cette
complexité de la matrice est également caractérisée par une distribution spatiale des composants
principaux de la matrice, avec une MEC plus riche en collagènes, notamment le collagène de
type II, contrairement à la matrice péricellulaire et le chondrocyte qui sont plutôt riches en
protéoglycanes, et cela indépendamment des différentes zones de la matrice. En outre,
l’identification des trois pics Raman distincts de la MPC dans les différentes zones ont été
définis comme des indicateurs pour le suivi de la progression de la dégradation de la matrice
dans l’arthrose. Aussi, la caractérisation des propriétés biomécaniques ont mis en œuvre une
variation décroissante du module d’élasticité de la MEC au chondrocyte (E0 = 94,87±44,07
pour la matrice extracellulaire, E0 = 44,83±20,91 pour matrice péricellulaire E0 = 15,30 ± 7,65
pour et le chondrocyte), ainsi qu’une épaisseur de la matrice péricellulaire dépendante de la
profondeur (zone superficielle est = 2,7±0,8, zone intermédiaire = 3,6±1,1et la zone profonde
= 4,9±1,8). La conception d’un néocartilage artificiel devrait récapituler l’architecture des zones
distinctes, ainsi que les régions matricielles afin de récréer la relation structure-fonction du
cartilage natif. Dans ce travail, plusieurs remarques peuvent être faites :
- La MCR fourni une panoplie d’informations biochimiques qui, si elles sont toutes
bien comprises, peuvent faciliter une meilleure compréhension des relations
structure-fonction du cartilage natif,
- Le manque de recul sur les données spectrales du cartilage articulaire, laisse parfois
entrevoir des hypothèses sur la caractérisation et l’interprétation de certaines
bandes Raman, notamment les bandes Raman à 1590 cm-1 et 1130 cm-1, attribuées
161
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
au collagène de type VI et au perlécane, respectivement. Ces deux molécules sont
connues pour leur rôle dans la régulation des intéractions entre les différentes
régions matricielles (la MEC, la MPC et le chondrocyte). Elles sont également
impliquées dans la régulation de l’équilibre homéostatique de l’activité
métabolique des chondrocytes et de sa réponse aux signaux environnementaux. La
caractérisation individuelle de la signature spectrale de ces deux molécules pourrait
contribuer à la surveillance du cartilage et identifier précocement les changements
métaboliques de la matrice liés à l’arthrose.
(2) La différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines (hCSM)
vers les chondrocytes et la dédifférenciation des chondrocytes
Les approches de l’ingénierie tissulaire du cartilage s’intéressent à deux sources de
cellules, en particulier les chondrocytes, seules cellules résidentes et responsables du
renouvellement de la MEC dégradée et, les cellules souches mésenchymateuses pour leur
capacité à se différencier en chondrocytes 151, pour récréer un néocartilage artificiel. En général,
les cellules sont ensemencées dans des cultures cellulaires in vitro pour accroitre leur nombre
et leur capacité de différenciation. Contrairement aux CSMs qui peuvent facilement se
différencier quel que soit le type de culture, les chondrocytes, quant à elles perdent rapidement
leurs caractéristiques morphologiques et synthétiques spécifiques, et se comportent comme des
fibroblastes indifférenciés en culture monocouche. A partir de la MCR, il a été possible de
suivre (en temps réel) les changements biochimiques associés à la dédifférenciation des
chondrocytes. Les pics identifiés (1063, 1255, 1449 et 1659 cm-1) peuvent être considérés
comme des indicateurs pour surveiller les différentes modifications (morphologique et
biochimique) au cours des différents passages. A ce titre, la MCR constitue un bon outil de
surveillance pour caractériser les processus de dédifférenciation des chondrocytes et déterminer
les niveaux de croissance des cellules nécessaires pour induire une redifférenciation des
chondrocytes dans des milieux de suspension. A la différence des chondrocytes dédifférenciées
qui peuvent être suivi en temps réel, cela n’a pas été le cas des hCSMs différenciées. Bien
qu’elles présentent dans le motif spectral toutes les caractéristiques des chondrocytes, de
grandes différences ont été observées d’une culture à une autre. Ce qui rend inévitablement la
surveillance plutôt complexe et donc difficile de définir un modèle idéal. D’où l’intérêt de
l’optimisation des conditions de culture, la précision dans le dosage des milieux. Ce qui
162
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
permettra de répondre à la question de la reproductibilité, condition essentielle à l’élaboration
de stratégies de conception de néocartilage qui soit fonctionnel à long terme.
(3) Caractérisation du cartilage articulaire arthrosique
L’arthrose est une maladie caractérisée par la perte progressive du cartilage articulaire.
Cette modification structurelle modifie profondément sa capacité à amortir les contraintes
mécaniques. La maladie n’est détectée en clinque qu’à des stades plus avancés. En raison de la
capacité limitée du cartilage articulaire à se régénérer et ou à cicatriser spontanément,
caractériser de façon plus précoce les modifications chimiques impliqués dans l’initiation de
l’arthrose contribuerait à anticiper la prise en charge. Dans ce travail, la MCR a démontré sa
capacité à caractériser le cartilage dégradé et mettre en évidence les changements dans la
structure de l’ADN qui pourraient précédés aux changements dans le phénotype de la matrice.
En tout état de cause, la MCR s’est révélée comme technique optique très pertinente,
sans contact, non invasive et non destructive, et sans aucune préparation de l’échantillon 178,
capable de fournir des informations quantitatives et qualitatives sur la distribution des composés
et des processus chimiques dans les cellules ou les tissus. Aussi, pourrait-elle être utilisée
comme un outil pour le diagnostic précoce de l’arthrose.
Enfin, dans ce travail de thèse, nous avons associée à la MCR, les techniques de
microscopie multiphotonique et de microscopie à force atomique (AFM). Ces différentes
techniques optiques se sont montrées complémentaires pour caractériser à la fois la structure et
les propriétés chimiques et biomécaniques du tissu cartilagineux.
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187
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
6 LISTES DES FIGURES ET TABLEAUX
N°
FIGURES
Page
1
Différentes localisations du cartilage dans le corps humain (source : Cartilage and Bones
September 27, 2011 by Antranik/http://antranik.org/cartilage-and-bones/)
20
2
Cartilage élastique
21
3
Fibrocartilage
22
4
(A) Image macroscopique du cartilage articulaire des condyles fémoraux bovins juvéniles,
démontrant la nature scintillante du cartilage hyalin. [Kyriacos AA et coll, 2016 ()], (B)
Image microscopique du cartilage montrant les chondrocytes dans leurs logettes
23
5
Structure triple hélicoïdale du collagène. (A) Vue de l'axe moléculaire (α-carbones
uniquement), montrant les chemins des chaînes polypeptidiques individuelles et les
emplacements des résidus dans les triplets Gly-X-Y (G = Gly; de (Beck et Brodsky, 1998),
avec permission). (B) Vue de côté (molécule inclinée vers le lecteur en haut; représentation
remplissant l'espace), montrant la torsion hélicoïdale à droite (Stupler, 2008)
26
6
Les différents types de collagènes du cartilage
27
7
Structure d’un protéoglycane
29
8
Structure d’un glycosaminoglycane (GAG). Les GAG ont des charges négatives sur leurs
sulfates carboxylés et peuvent ainsi capter les ions Ca++ et Na+ qui, eux-mêmes, attirent
l'eau. Ces protéoglycanes constituent un véritable gel hydrophile qui occupe un volume
considérable par rapport à son contenu glucidique et l'eau constitue ainsi 70-75 % du
poids humide du cartilage articulaire adulte
30
9
Chondrocyte de cartilage articulaire en microscope électronique (ME)
33
10
Arrangement régional et zonal du cartilage articulaire. (A) Spécialisation régionale du
cartilage articulaire (les matrices péricellulaires, territoriales et interterritoriales autour
des chondrocytes), (B) Organisation zonale distincte du cartilage articulaire de la surface
articulaire à la zone c
alcifiée). Abréviations ChS = sulfate de chondroïtine, Coll =
collagène, COMP = protéine de matrice oligomère cartilagineuse, DS = sulfate de
dermatane, FGF-2 = facteur de croissance des fibroblastes-2, FGFR = récepteur du FGF,
HS = sulfate d'héparane, KS = sulfate de kératane. (Massimo Bottini et coll, 2016)
35
11
Cartilage articulaire avec son organisation interne : les cellules (à droite) et les fibres de
collagène (au milieu) sont organisées dans le cartilage en zones superficielles, moyennes
et profondes, constituées respectivement de 10 à 20%, 40 à 60% et 20 à 50% de la
profondeur globale des tissus.
37
12
Formation et régulation par des facteurs transcriptionnels des lignées chondrocytaire et
ostéoblastique 81
40
13
Représentation schématique des circonstances pathogéniques impliquées dans
l’apparition de la maladie de l’arthrose. Image empruntée à Henrotin Y.dans « Approche
expérimentale de la pathogénie et du traitement de l'arthrose. In: Faculté de Médecine.
Liège: Université de Liège; 2003 ».
43
188
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
14
Représentation schématique de la technique de microfracturation. (A) Le plancher d'un
défaut chondral est perforé à plusieurs endroits à l'aide d'un instrument pointu ou d'un
foret à fibre étroite. Par cette action, l'espace médullaire de l'os sous-chondral est ouvert.
Le sang s'infiltre dans le défaut portant des MSC locales dérivées de la moelle osseuse - et
y forme un hématome (reproduit avec permission de Hunziker et al, 2015). (B) Situation
clinique de lésion de grade 4 sur un condyle fémoral médial. À gauche: lésion avant la
préparation. Droite: Lésion après débridement et microfracture avec des saignements à la
surface de la moelle osseuse. (Cheung Sunny et Benjamin Ma C., 2011).
46
15
Représentation schématique du principe de la mosaïqueplastie. Des bouchons cylindriques
de tissu ostéochondral sont percés à partir d'une zone non portante de l'articulation du
genou (à l'aide d'un instrument chirurgical spécial), puis ajustés à la presse, côte à côte,
dans la zone endommagée. Le nombre de bouchons retirés dépendra du diamètre de
surface du site accepteur. Les sites donneurs dénudés sont soit remplis de tissu
ostéochondral qui est retiré du site accepteur endommagé lors de sa préparation
ch
irurgicale pour les bouchons, soit laissés vides. Vu de dessus, les bouchons ajustés
forment une mosaïque de profils circulaires qui sont entrecoupés d'espaces vides; d'où le
nom de "mosaïqueplastie". (Reproduit avec permission de Hunziker et al, 2015). (B)
Mosaïque de bouchons obtenus à partir de la trochlée (Cheung S et Benjamin M.C., 2011).
48
16
Séquence sagittale (en haut à gauche) et coronale (en haut à droite) pondérée en T2
montrant un grand défaut chondral du condyle fémoral médial. Vues arthroscopiques de
la lésion en flexion (milieu gauche) et en extension (milieu droit). Une arthrotomie
montrant le site receveur préparé (en bas à gauche) et l'allogreffe ostéochondrale
transférée (en bas à droite). Reproduit avec la permission de Cheung et al, 2011
49
17
Représentation schématique du développement de tissus cartilagineux par ingénierie
tissulaire
. La combinaison de cellules, d'échafaudages et de facteurs de croissance
pourrait être soit directement injectée dans la lésion, soit davantage cultivée dans des
bioréacteurs in vitro pour former un nouveau tissu. Le néocartilage serait finalement
implanté dans la lésion 135.
51
18
Représentation schématique du processus de différenciation des cellules souches
mésenchymateuses (CSM) en trois lignées diffé
rentes : Myocytes, chondrocytes,
ostéocytes, adipocytes et cellules neurales.
54
19
Structure zonale du cartilage articulaire. Histologie du cartilage articulaire de lapin
adulte pleine épaisseur (~ 1 mm) du genou (10 ×), indiquant des changements dans la
morphologie cellulaire avec la profondeur. La coupe histologique représente une tranche
prise perpendiculairement à la surface du cartilage, avec des protéoglycanes de coloration
au bleu de toluidine (violacé), des noyaux de coloration à l'hématoxyline
(bleu) et des
structures de protéines de coloration à l'éosine (rose / rouge) (Kyriacos et al, 2016).
59
20
Diagrammes de niveau d'énergie moléculaire illustrant l'interaction des molécules avec
les photons, (a) diffusion élastique et inélastique par
la molécule, (b) absorption
infrarouge et émission de fluorescence, (c) diffusion Rayleigh, (d) diffusion Stokes Raman
et (e) Diffusion Raman anti-Stokes.190
64
21
Spectre Raman typique du cartilage articulaire et ses différentes régions vibratoires
66
189
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
22
Spectre Raman caractéristique du cartilage articulaire. Bandes Raman dans la région de
600 à 1800 cm-1 et 2800 à 3670 cm-1
68
23
Mise en évidence de l’ATM et son disque articulaire
70
24
Illustrations de la méthode Kawamoto: (A) Une souris enceinte, de 6 µm d'épaisseur; (B)
Section de 2 µm d'épaisseur: un thigbone de rat adulte, Lame: lame de laboratoire de
section, Milieu d'enrobage : SCEM-L1; (C) Section congelée fraîche (Une incisive de rat
adulte, 2 µm; (D) Section congelée fraîche (par Mme K. Izumi; Une truite arc-en-ciel de
5 µm d'épaisseur (Section Méthode Kawamoto-Lab Co. Ltd. Site: http: // section-
lab.jp/English/Gallery%20E.htm)
81
25
Images en microscopie multiphotonique : (A) : autofluorescence de la matrice
cartilagineuse (indication fléchée) dans la région immédiatement autour de la cellule,
correspondant à la matrice péricellulaire, mettant ainsi en évidence la régionalisation de
la matrice autour de la cellule ; (B) : amas de structure fibreuse de collagène de la région
MT de la matrice cartilagineuse en mode de génération de seconde harmonique (SGH).
Barre d’échelle = 10 µm. Abréviations : MT = matrice territoriale
; MIT = matrice
interterritoriale ; MPC = matrice péricellulaire ; C = chondrocyte.
83
26
Procedures de mesures du cartilage articulaire à l’aide de la microscopie à force atomique
(AFM) : (A) l’image optique de la matrice de cartilage lors des mesures d’un échantillon
avec la pointe du cantilever et des chondrons alignés. (B) L’unique courbe force-distance
(FD) enregistrée à chaque pixel de la carte de force (C). Les valeurs du module de Young
(E) sont obtenues en ajustant les courbes FD avec une courbe modèle (ligne en pointillée
noire) (C) Le code couleur représentant les valeurs du module de Young (YM) obtenues
des pixels allant du violet foncé (régions de forces plus ou moins douces) à l'orange
jusqu'au blanc (région de forces plus dure) (D) Représentation de la distribution de toutes
les valeurs du module de Young (YM) de la carte de force. Tous les histogrammes montrent
une forme normalement distribuée et équipés d'une fonction gaussienne obtenant une
valeur moyenne (E0) qui caractérise l'élasticité du site spécifique
85
27
Microscope Raman LBN Montpellier (A) ; B : Différentes composantes schématisées de la
microscopie Raman (www.witec.de)
87
28
Interface du logiciel de contrôle Witec
88
29
Interface de traitement des spectres du logiciel Spectragryph version 1.2.14
89
30
Les différentes étapes de prétraitement des spectres : (a) Spectres brutes, (b) Soustraction
de la ligne de base suivant l’ordre polynomial, (c) Spectres brutes sans la ligne de base,
(d) Spectres brutes sans ligne de base pris dans la région spectrale de 600-1800 cm-1, (e)
Lissage avec le filtre Savizsky Galay et normalisation par rapport à l’aire de la région
spectrale 600-1800 cm-1, (f) Curseur multilignage et détermination de l’intensité de signal
94
31
La réalisation de l’ACP-LDA à partir des spectres bruts (pris en différents points sur les
chondrocytes, la MPC et la MT) permet une répartition des données distribuées sur le
premier axe Dim 1 (96,72% de la variance totale), avec une classification en trois groupes
montrant distinctement les différentes zones de la matrice du cartilage. Cette distinction
est plus représentée avec la détermination la LDA avec calcul des pourcentages de biens
classés.
109
190
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
32
Histogramme des différentes concentrations moléculaires par zone du cartilage
articulaire. Calcul des intensités des 120 spectres collectés au niveau de chaque zone. Une
augmentation relative de la concentration des différentes molécules (protéines, lipides et
glucides etc.) selon qu’on s’éloigne de la surface du cartilage articulaire. Cette différence
significative entre le taux de collagène et de protéoglycane dans les différentes zones
superficielle et profonde (p<0,05)
110
33
Spectres moyens des clusters de la MEC (en bleu), la MPC (en rouge) et les chondrocytes
(en vert) après prétraitement et normalisation par rapport à la région spectrale de 600 à
1800 cm-1
115
34
Histogramme des moyennes et écart-types calculés de l’épaisseur de la matrice
péricellulaire (MPC). Données recueillies à
50 points sur 4 différentes images
hyperspectrales mettant en evidence la MPC. Difference significative (p<0,001) entre les
épaisseurs de la MPC dans les différentes zones
118
35
Images optiques Raman des cellules aux différents passages de P1 à P4
132
36
Caractérisation des principaux marqueurs du cartilage articulaire. (a, b, c)
Caractérisation du rapport d’intensité de certaines bandes Raman choisies en raison de
leurs spécificités moléculaires et leur capacité à fournir des informations biochimiques
indispensables sur les changements conformationnels lors de la dédifférenciation des
chondrocytes. Variations significatives entre les différents échantillons. De façon
particulière, les bandes localisées à 1063 cm-1 (attribution des GAG) et 1255 cm-1
(attribution du collagène de type II) présentent une intensité de signal Raman qui diminue
progressivement pour les GAGs et le collagène de type II au fil des différents passages
(P1, P2, P3 et P4), contrairement à celle de la bande à 1659 cm-1 (attribution du collagène
de type I),) qui augmente plutôt avec les passages. (d) L’expression génique par qPCR des
principaux gènes impliqués dans la chondrogenèse, notamment le collagène de type IIA et
IIB, l’aggrécane (ACAN) et le collagène de type I (Col
IA) et SOX9. Le test génique
présente une régulation à la baisse des gènes du col IIA et IIB, ainsi que de l’ACAN, tandis
les gènes du col IA et de SOX sont régulés à la hausse. Valeur de significativité a été
déterminée pour p<0,0
135
37
L’application de l’ACP-LDA. (a, b) vue de la représentation de l’ACP appliquée aux
différents groupes A= P1, B= P2, C= P3 et D= P4. Les emplacements relatifs des signaux
sur le tracé sont la résultante des concentrations relatives des biomolécules dans chaque
éch
antillon. (a) application de l’ACP montrant la dispersion des différents spectres par
passage, représentés par les points et constitués en grappes dans l’espace. Certains points
se chevauchent démontrant les similitudes qui peuvent exister entre les différents passages.
(b) Fusion des grappes P2 et P3 à cause des fortes similitudes entre ces milieux. (c, d)
Application de la LDA par détermination des biens classés permet de mieux discriminer
les différences entre les quatre (4) passages.
136
38
Différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSC) en
chondrocytes
. (A) rapport d’intensité des bandes Raman caractéristiques du cartilage
articulaire, après 21 jours de culture. (B, C) expression génique (résultats des tests qPCR)
des principaux marqueurs impliqués dans la chondrogenèse. Les gènes chondrogéniques
137
191
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
sont fortement exprimés au décours de 21 jours de culture dans les hCSM supplémentées
avec du TGF-β3, contrairement aux hCSM sans TGF-β3.
39
Spectres moyens des différents des hCSM différenciées (en bleu) et non différenciées (en
rouge) sans ou avec du TGF-β3.
138
40
Caractéristiques de la dérivée seconde des spectres moyens. (A) dérivée seconde dans la
région de longueur d’onde de 600 – 1200 cm-1 ; (B) dérivée seconde dans la région de
longueur d’onde de 1200 – 1800 cm-1
143
41
Spectres moyens comparatifs entre les hCSM différenciées (en bleu) et le cartilage
articulaire natif (en rouge)
145
42
Caractérisation du cartilage dégradé : (A) Détermination de la teneur en PGs par le
rapport de la surface de la région glucidique [985 – 1185]/la région amide I [1601 -
1760].
L’histogramme présente un rapport d’intensité plus élevé en faveur du cartilage
non dégradé (CA). Ce qui traduit une diminution du taux de PGs dans le cartilage dégradé.
(B)
Rapport d’intensité I1251/I1271 du cartilage dégradé et du cartilage non dégradé
(Bonifacio A et al, 2010 ; Yasuhito et al, 2014). La figure 2 présente un rapport d’intensité
entre les pics à 1251/1271 cm-1 plus élevé en faveur du cartilage dégradé, caractérisant
une structure désordonnée de la protéine.
154
43
Analyse des composants principaux (ACP) et discrimination du cartilage dégradé du
cartilage normal. (A) Tracé des scores ACP utilisant PC1 et PC2. Seule la composante
principale (CP2) sépare les échantillons dégradé/normal ; (B) Graphique des scores ACP
utilisant CP2 et CP3; (C) Spectres Raman moyens du cartilage dégradé et du cartilage
normal (n=50 spectres); (D) Chargement CP2 des bandes Raman responsables
de la
séparation des échantillons de cartilage dégradé et normal.
156
N°
TABLEAUX
Page
I
Composition fractionnelle approximative du cartilage hyalin 26
21
II
Table des pics Raman du cartilage articulaire : Abréviations: (p) Protéine, (l) Lipide, (d) ADN /
ARN, (A) Adénine, (T) Thymine, (G) Guanine, (C) Cytosine, (U) Uracile, (Phe) Phénylalanine,
(Tyr) Tyrosine, (Trp) Tryptophane, (bk) Backbone, (Def) Deformation, (Tw) Twist, (Sym)
Symmetric, (asym) Asymmetric et (Str) Stretching, (rand) Random (Bergholt et al, 2017 ; Matthiew
et al,2010)
69
III
Table des assignations des pics et ou bandes Raman caractéristiques
111
IV
Tableau récapitulatif des pics caractéristiques des différents composants de la matrice
cartilagineuse. En bleu, les pics essentiels de la MEC ; en rouge, ceux de la MPC et en
vert, ceux des chondrocytes
113
V
Table des assignations des pics ou marqueurs caractéristiques identifiés au niveau de
chaque région de la matrice du cartilage articulaire
117
VI
Images hyperspectrales reconstruites de la matrice de cartilage dans les zones
superficielle (a), médiane (c) et profonde (e) après traitement k-means Clustering ;
alignement des spectres Raman moyens isolés des clusters correspondant aux principaux
composants de la matrice du cartilage (vert : chondrocyte, rouge : matrice péricellulaire
et vert bleu : matrice territoriale (ou MEC) suivant les différentes zones superficielle (b),
121
192
ETUDE STRUCTURELLE EN MICROSCOPIE CONFOCALE RAMAN DU
CARTILAGE PRODUIT PAR INGENIERIE TISSULAIRE
zone médiane (d), zone profonde (f). détermination de l’épaisseur de la matrice
péricellulaire dépendante de la profondeur
VII
Tableau récapitulatif des mesures AFM de la matrice du cartilage articulaire humain.
(A, D, G) caractérisation des différentes régions de la matrice du cartilage lors des
mesures AFM. (B, E, H) histogramme des valeurs du module de Young correspondant à
chaque région, (C, F, I) Valeurs moyennes et les écart-types du module de Young
124
VIII
Détermination de la circularité des cellules suivant les passages (P1 à P4) à partir des
images optiques collectées et traitées avec ImageJ®.
Les changements peuvent être
observés avec la diminution de la circularité (S) des cellules décroit au fil des passages.
La circularité à P4 est plus faible par rapport aux autres passages (P1, P2 et P3). Les
cellules à P4 présentent une morphologie plus grande avec un aspect plus allongé. Les
cellules à P2 et P3 présentent sensiblement la même densité cellulaire, mais aussi la même
morphologie et un aspect un peu moins allongé par rapport à P4. Abréviations : Count =
Estimation nombre des cellules/boite ; Perim = Périmètre ; Cir = Circularité
132
IX
Table des assignations des pics et ou bandes Raman caractéristiques
134
X
Modes vibratoires et assignations des bandes Raman des spectres moyens transformés
des hCSM supplémentées avec le TGFβ et les hCSM sans TGFbβ
144
XI
Assignations et caractérisation biochimique des bandes Raman de différenciation entre
les hCSM différenciées et le cartilage natif
146
XII
Table des assignations des pics ou bandes Raman majeur(e)s impliqué (e)s dans la
caractérisation du cartilage articulaire dégradé vs cartilage non dégradé (normal)
157
