Tarımsal ve Endüstriyel Biyoteknoloji Uygulamaları - Biyoekonomi

Abstract

Yeşil devrim ile başlayan tarımsal ürünlerdeki üretim artışı politikası, tarım yapılabilecek alan sayısının her geçen gün azalması, sanayi kaynaklı iklim değişikliğinin tarım bitkilerinde verim düşüşüne sebep olması ve en önemlisi insan nüfusunun hızlanarak artması ile sekteye uğramış durumdadır. Dünya nüfusunun 2050 yılında yaklaşık 10 milyara ulaşacağı düşünüldüğünde gittikçe azalan tarım alanlarında daha fazla ürün ve gittikçe bozulan iklimsel şartlarda daha verimli tarım ürünlerinin üretilmesi bir zorunluluk haline gelmiştir. Bu durum genetik mühendisliği, moleküler belirteçler, moleküler tanılama araçları, doku kültürü ve canlıların genetiğinin değiştirilmesi gibi bilimsel araç ve tekniklerin kullanıldığı tarımsal biyoteknolojinin önemini arttırmakta ve bu bilim dalını günümüz ve geleceğin en önemli bilim dalı haline gelmesini sağlamaktadır. Bu kitapta gıda ürünlerinin moleküler biyoloji temelli teknikler ile nasıl tespit edilebileceği, moleküler belirteçlerin bitki ıslahında nasıl kullanılabileceği, doku kültürü ile tarımsal ürünlerin mikroçoğaltımlarının nasıl yapılabileceği ve endüstriyel biyoteknolojinin biyoekonomiye nasıl katkıları olabileceği konularına yer verilirken günümüz ve gelecekte ihtiyaç duyulacak biyoteknolojik yöntemler detaylı bir şekilde açıklanmıştır. Her bir bölümü, konusunda uzman akademisyenlerce yazılmış olan bu kitabın Lisans, Yüksek Lisans ve Doktora öğrencilerine rehberlik etmesini diliyorum. Kitabın hazırlanmasında emeği geçen kıymetli yazarlara, kitabın basım ve yayımında bizlere destek olan İktisadi Kalkınma ve Sosyal Araştırmalar Enstitüsü (İKSAD) yayınevine ve ismi kitapta yer almayan fakat kitabın hazırlanmasında emeği geçen herkese teşekkür ederim.

Full text

TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL
BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI - BİYOEKONOMİ
EDİTÖR: Dr. Kaan HÜRKAN
Yazarlar:
Doç. Dr. Arzu ÜNAL
Dr. Adnan AYDIN
Dr. Kaan HÜRKAN
Uzm. Biyolog Yasemin KEMEÇ HÜRKAN

TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL
BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI - BİYOEKONOMİ
Editör:
Dr. Kaan HÜRKAN
Yazarlar:
Doç. Dr. Arzu ÜNAL
Dr. Adnan AYDIN
Dr. Kaan HÜRKAN
Uzm. Biyolog Yasemin KEMEÇ HÜRKAN

Copyright © 2020 by iksad publishing house
All rights reserved. No part of this publication may be reproduced,
distributed or transmitted in any form or by
any means, including photocopying, recording or other electronic or
mechanical methods, without the prior written permission of the publisher,
except in the case of
brief quotations embodied in critical reviews and certain other
noncommercial uses permitted by copyright law. Institution of Economic
Development and Social
Researches Publications®
(The Licence Number of Publicator: 2014/31220)
TURKEY TR: +90 342 606 06 75
USA: +1 631 685 0 853
E mail: iksadyayinevi@gmail.com
www.iksadyayinevi.com
It is responsibility of the author to abide by the publishing ethics rules.
Iksad Publications – 2020©
ISBN: 978-625-7914-98-7
Cover Design: İbrahim KAYA
April / 2020
Ankara / Turkey
Size = 16 x 24 cm

İÇİNDEKİLER
EDİTÖRDEN
ÖNSÖZ
Dr. Kaan HÜRKAN…………………………………………………3
BÖLÜM 1
BİTKİSEL ÜRÜNLERİN GÜVENİRLİĞİNİN BELİRLENMESİNDE
KULLANILAN BAZI MODERN MOLEKÜLER BİYOLOJİ
YÖNTEMLERİ
Dr. Kaan HÜRKAN…………………………………………………5
BÖLÜM 2
BİTKİ ISLAHINDA MOLEKÜLER BELİRTEÇLERİN
KULLANIMI
Dr. Adnan AYDIN…………………………………………………39
BÖLÜM 3
BİTKİ BİYOTEKNOLOJİSİNDE DOKU KÜLTÜRÜ
YÖNTEMLERİ
Uzm. Biyolog Yasemin KEMEÇ HÜRKAN……………………...71
BÖLÜM 4
ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI VE
BİYOEKONOMİ
Doç. Dr. Arzu ÜNAL……………………………………………...121

1
Sevgili kızım Doğa’ya…

2
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ

3
ÖNSÖZ
Yeşil devrim ile başlayan tarımsal ürünlerdeki üretim artışı politikası,
tarım yapılabilecek alan sayısının her geçen gün azalması, sanayi
kaynaklı iklim değişikliğinin tarım bitkilerinde verim düşüşüne sebep
olması ve en önemlisi insan nüfusunun hızlanarak artması ile sekteye
uğramış durumdadır. Dünya nüfusunun 2050 yılında yaklaşık 10
milyara ulaşacağı düşünüldüğünde gittikçe azalan tarım alanlarında
daha fazla ürün ve gittikçe bozulan iklimsel şartlarda daha verimli
tarım ürünlerinin üretilmesi bir zorunluluk haline gelmiştir. Bu durum
genetik mühendisliği, moleküler belirteçler, moleküler tanılama
araçları, doku kültürü ve canlıların genetiğinin değiştirilmesi gibi
bilimsel araç ve tekniklerin kullanıldığı tarımsal biyoteknolojinin
önemini arttırmakta ve bu bilim dalını günümüz ve geleceğin en
önemli bilim dalı haline gelmesini sağlamaktadır.
Bu kitapta gıda ürünlerinin moleküler biyoloji temelli teknikler ile
nasıl tespit edilebileceği, moleküler belirteçlerin bitki ıslahında nasıl
kullanılabileceği, doku kültürü ile tarımsal ürünlerin
mikroçoğaltımlarının nasıl yapılabileceği ve endüstriyel
biyoteknolojinin biyoekonomiye nasıl katkıları olabileceği konularına
yer verilirken günümüz ve gelecekte ihtiyaç duyulacak biyoteknolojik
yöntemler detaylı bir şekilde açıklanmıştır.
Her bir bölümü, konusunda uzman akademisyenlerce yazılmış olan bu
kitabın Lisans, Yüksek Lisans ve Doktora öğrencilerine rehberlik
etmesini diliyorum.
Kitabın hazırlanmasında emeği geçen kıymetli yazarlara, kitabın
basım ve yayımında bizlere destek olan İktisadi Kalkınma ve Sosyal
Araştırmalar Enstitüsü (İKSAD) yayınevine ve ismi kitapta yer
almayan fakat kitabın hazırlanmasında emeği geçen herkese teşekkür
ederim.
Editör
12 Nisan 2020

4
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ

5
BÖLÜM 1
BİTKİSEL ÜRÜNLERİN GÜVENİRLİĞİNİN
BELİRLENMESİNDE KULLANILAN BAZI MODERN
MOLEKÜLER BİYOLOJİ YÖNTEMLERİ
Dr. Kaan HÜRKAN
1
1
Iğdır Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü, Iğdır,
Türkiye. kaan.hurkan@igdir.edu.tr

6
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ

7
GİRİŞ
Bitkisel ürünler arasında coğrafi işareti alınmış, patent ile tescil
edilmiş, çeşitli ödüller almış veya oldukça sınırlı alanlardan çok az
miktarlarda elde edilebilir özellikte olanlar piyasada yüksek miktarda
talep görmekte ve ekonomik açıdan daha yüksek değerlere imal
edilerek satılmaktadır. Bu tip değerli ürünlerin içerisine daha ucuza
mal edilen farklı içeriklerin karıştırılması ile tüketicilerin aldatılması
oldukça sık karşılaşılan bir durumdur. Hatta bu aldatmaca,
tüketicilerin sağlığı üzerinde olumsuz etkiler oluşturabilmektedir. Bu
bölümde özellikle bitkisel ürünlerdeki aldatmacaların modern
moleküler biyoloji yöntemleri ile tespit edilmesinde kullanılan başlıca
yöntemler ele alınmıştır.
1. DNA BARKODLAMA YÖNTEMİ
DNA’nın molekül yapısının 1953 yılında ortaya çıkarılması ile birlikte
moleküler biyolojide devrim yaşandı. DNA’yı oluşturan dört adet baz
(Adenin, Guanin, Sitozin ve Timin) yeryüzündeki tüm canlılarda ortak
olarak bulunmaktadır. Bu dört bazın anlamlandırdığı nükleotitlerin
DNA boyunca farklı sıralarda dizilmesi, biyolojik çeşitliliğin temelini
oluşturmaktadır.
Genomda daha önceden belirlenmiş olan bölgelerde bulunan kısa (600
– 1500 bç) nükleotit dizilerinin ortaya çıkarılarak bu bölgelerin türleri
birbirinden ayırt edebilmek amacıyla kullanılmasına DNA barkodlama
denilmektedir (Lahaye ve diğerleri, 2008). Bu bölgelerde oluşan

8
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
mutasyonlar, türler arasında ve hatta genotipler arasında baz dizilişi
farklılıklarını doğurarak canlıların birbirlerinden ayırt edilebilmelerini
sağlamaktadır. Bu mutasyonlardan en temel olanı bir bazın, farklı bir
baz ile yer değiştirdiği baz değişimi mutasyonudur. Eğer baz
değişimleri aynı grup bazlar arasında gerçekleşiyorsa (ör: Pürin-Pürin
veya Pirimidin-Pirimidin) bu mutasyona transisyon, eğer farklı grup
bazlar arasında gerçekleşiyorsa (ör: Pürin-Pirimidin veya tam tersi) bu
mutasyona transversiyon denilmektedir. Baz değişimleri haricinde
DNA dizisinde bazı bazların eksilmesi (delesyon), baz eklenmesi
(insersiyon) veya tekrar etmesi (duplikasyon) şeklinde de mutasyonlar
olabilmektedir. Canlı genomundaki tüm bu değişimler, DNA
barkodlamanın temel mantığını oluşturmaktadır. DNA barkodlama
temel olarak DNA ekstraksiyonu, Polimeraz Zincir Reaksiyonu
(PZR), DNA dizileme, Biyoenformatik analizler ve DNA barkodunun
gen bankalarında saklanması aşamalarından oluşmaktadır (Şekil 1).
Şekil 1. DNA Barkodlama İş Akışı Şeması

9
1.1. DNA Barkodlamada Temel İş Akışı
1.1.1. DNA ekstraksiyonu
DNA barkodlamada ilk adım, DNA molekülünün organizmadan
başarılı ve temiz bir şekilde izole edilmesidir. Bu amaçla yapılan tüm
işlemlere DNA ekstraksiyonu denilmektedir. Günümüzde DNA
ekstraksiyonunu kolaylaştırmak ve harcanan zamanı azaltmak için
birçok firma tarafından farklı özelliklerde ticari DNA ekstraksiyon
kitleri üretilmektedir. İster ticari kitler kullanılsın, isterse de manuel
yöntemler, DNA ekstraksiyonu parçalama (liziz), çöktürme
(presipitasyon) ve saflaştırma (pürifikasyon) şeklinde üç temel
adımdan oluşmaktadır. Bu bölümde moleküler biyoloji
laboratuvarlarında en yaygın kullanılan DNA ekstraksiyonu yöntemi
olan değiştirilmiş Doyle & Doyle 1987 yöntemi anlatılmıştır (Doyle
ve Doyle 1987).
Değiştirilmiş Doyle & Doyle (1987) DNA Ekstraksiyon Yöntemi
 Yaklaşık 50 mg yaprak dokusu sıvı azot kullanılarak toz haline
getirilir,
 Toz 1,5 ml’lik tüp içerisine alınır ve tüpe 700 µl %2 CTAB
(Cetyl trimethylammonium bromide) içeren ekstraksiyon
tamponu [20 mM EDTA, 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,4 M NaCl,
%2 CTAB ve %0,4 β-mercaptoethanol (kullanılmadan hemen
önce)] eklenir,
 Karışım 65°C’de 45 dakika boyunca her 15 dakikada bir
hafifçe karıştırılarak bekletilir,

10
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
 Karışıma 500 µl kloroform:izoamil alkol (24:1) eklenir ve tüp
1 dakika boyunca hafifçe karıştırılır,
 Örnek 12000 devirde 10 dakika boyunca santrifüj edilir, oluşan
üst fazdan yaklaşık 600 µl’lik kısım mikropipet aracılığı ile
dikkatlice alınarak yeni tüpe aktarılır ve üzerine tekrar 500 µl
kloroform:izoamil alkol (24:1) eklenerek 12000 devirde 10
dakika boyunca santrifüj edilir,
 Üst fazdan 500 µl’lik kısım yeni tüpe alınarak üzerine 700 µl
soğuk (-20°C) izopropanol eklenir, hafifçe karıştırıldıktan sonra
12000 devirde 10 dakika boyunca santrifüj edilir ve bu aşamada
DNA molekülünün tüpün tabanına yapıştığı gözlemlenir,
 DNA’ya yapışan tuz kalıntısının giderilmesi için oluşan DNA
peleti 700 µl % 70 etanol ile iki defa yıkanır,
 Tüp ters çevrilerek etanolün tamamen kuruması beklenir,
 Son adımda DNA peletinin çözünmesi için tüpe 100 µl TE
tamponu [10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0]
eklenir ve 37°C’de bir saat bekletildikten sonra -20°C’de
saklanır.
1.1.2. Barkod Bölgelerinin Seçimi
DNA barkod bölgelerinin geliştirilmesi ve test edilmesi her bitki
grubu için ayrı ayrı yapılması gereken uzun bir süreci kapsamaktadır.
Farklı canlı gruplarına ait DNA bölgelerinin farklı hızlarda değişime
uğraması, tüm canlılar için evrensel bir barkod bölgesinin
kullanılamamasına neden olmaktadır (Hollingsworth ve diğerleri,
2009). Mitokondri genomunda bulunan sitokrom oksidaz-1 (CO1)

11
geni tüm hayvan gruplarında kullanılabilirken, daha karmaşık genoma
sahip bitkiler için farklı barkod bölgelerinin kullanılması
gerekmektedir. Bu bölümde bitkilerde en yaygın kullanılan barkod
bölgelerinden ITS, LEAFY, rbcL, matK, accD-psaI ve trnH-psbA
üzerinde durulacaktır.
Internal Transcribed Spacer (Transkripsiyonu Yapılan İç Ara
Bölgeler – ITS)
ITS bölgesi kromozomal DNA üzerinde, ribozomun küçük alt birimi
ile büyük alt birimini kodlayan genler arasında bulunan ve bitkilerde
yaklaşık 600 – 750 bç uzunluğunda olan bölgedir ve genomda
yüzlerce kopyası bulunmaktadır (Şekil 2).
Şekil 2. ITS Bölgesinin Yapısı Ve Pozisyonu (Hürkan, 2017). IGS:
Intergenic Spacer (Genler Arası Bölge)
ITS bölgesi gen kodlamayan ITS1 ve ITS2 ile birlikte bu bölgelerin
arasında bulunan ile birlikte gen kodlamasında görev alan 5.8S
bölgelerinden oluşmaktadır. Bitkilerde ITS bölgesinin tamamının PZR
ile çoğaltılmasında genellikle evrensel bağlanma özelliğine sahip bir
primer ile birlikte sadece kapalı tohumlulara (angiosperm) bağlanan
bir primer kullanılmaktadır. Fakat oldukça karmaşık genoma sahip
olan bitkilerde bu primer setinin her zaman için çalışma garantisi

12
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
yoktur. Bu nedenle farklı bitki grupları için özelleşmiş primer setleri
kullanılmalı veya tasarlanmalıdır. Ayrıca ITS bölgesi mantarlarda da
bulunduğu için primerler tasarlanırken en az bir tanesinin bitkilere
özgü olması, PZR aşamasında spesifik olmayan ürünlerin oluşumunun
önüne geçecektir. Yaygın olarak kullanılan ve kapalı tohumlulara
özgü ITS primerleri Baldwin ve diğerleri (1995), tarafından
tasarlanmış ve uzun yıllar kullanılmıştır. Yakın bir zamanda ise Cheng
ve diğerleri (2016), tarafından tasarlanan yeni nesil primerler bilim
insanlarının kullanımına sunulmuştur.
LEAFY
Arabidopsis türlerinde çiçek meristem dokusunun gelişiminde görevli
olan ve çiçeklenme zamanını kontrol eden LEAFY geni kromozomal
DNA’da bulunmaktadır ve diploit kapalı tohumlularda sadece bir
kopyasının bulunduğu bilinmektedir (Balquez ve diğerleri, 1997). Bu
gen tohumlu bitkilerde oldukça korunmuştur ve üç ekzon ile iki intron
bölgesinden oluşmaktadır (Şekil 3).
Şekil 3. LEAFY Bölgesinin Yapısı (Hürkan, 2017)
LEAFY bölgesi genomda tek kopya olarak bulunduğundan ITS
bölgesinde olduğu gibi fonksiyonel olmayan kopyalarının PZR ile
çoğaltılması riski içermemektedir. LEAFY bölgesinin iç kısmında
bulunan intron bölgeleri polimorfizme açık bölgelerdir ve özellikle tür

13
ve tür altı sistematik kategorilerde çözünürlüğü oldukça başarılıdır
(Oh ve Potter, 2003). Yaklaşık 2200 bç uzunluğunda bir bölge olduğu
için en az iki çift primer kullanılarak çoğaltılması gerekmektedir.
rbcL
Kloroplast kökenli olan rbcL ribulose-1,5-bis-phosphate carboxylase /
oxygenase (RuBisCO) enzimini kodlayan bir gen bölgesidir (Chase ve
diğerleri, 1993). Kloroplast genomunda atpB ve accD genleri arasında
bulunmaktadır (Şekil 4). Hem gen kodladığı için hem de kloroplast
kökenli (maternal kalıtım göstermektedir) olduğu için polimorfizm
oranı düşüktür ve bu nedenle cins ve üstü sistematik kategoriler için
kullanılması uygundur (Li ve diğerleri, 2015).
Şekil 4. Rbcl Bölgesinin Yapısı (Hürkan, 2017)
GenBank veri tabanında (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)
bitkilere ait 173 bin rbcL nükleotit dizisi bulunmaktadır ve bitkilerde
en çok kullanılan DNA barkod bölgeleri arasındadır. rbcL bölgesinin
uzunluğu yaklaşık 1400 bç olduğundan iki çift primer seti kullanılarak
çoğaltılması önerilmektedir.

14
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
matK
MaturaseK kloroplast kökenlidir, iki trnK ekzonu arasında bulunur ve
kapalı tohumlularda yaklaşık 1500 bç uzunluğundadır (Hilu ve
diğerleri, 1999) (Şekil 5).
Şekil 5. Matk Bölgesinin Yapısı (Hürkan, 2017)
matK bölgesi, ITS bölgesine göre daha düşük transisyon/transversiyon
oranına sahiptir ve uzunluk olarak barkodlama için kullanılmaya
uygundur (Min ve Mickey, 2007). matK bölgesinin diğer kloroplast
bölgelerine göre daha hızlı evrim geçiren bir bölge olması, tür
sistematik kategorisinde kullanılmasına olanak sağlamaktadır. Lahaye
ve diğerleri (2008), bölgeyi tek primer çifti ile çoğaltmayı
başarabilmişken, Cuenoud ve diğerleri (2002), bölgenin iki parça
halinde toplam dört primer çifti ile çoğaltılmasını önermişlerdir.
accD-psaI
Bu bölge kloroplast kökenlidir. İki gen ve bir genler arası bölgeden
oluşan barkod bölgesinin toplam uzunluğu yaklaşık 940 bç’dir (Şekil
6). Kodlayan bölge içerdiğinden dolayı dizileme sonrasında çoklu dizi
hizalaması işleminde oldukça sorunsuz bir bölgedir.
Şekil 6. Accd-Psaı Bölgesinin Yapısı (Hürkan, 2017)

15
Bölgenin PZR ile çoğaltılabilmesi için gerekli primer çifti Dong ve
diğerleri (2012), tarafından verilmiştir. Bu bölge bazı bitki gruplarında
yer almamaktadır ve bazı bitki gruplarında ise çok fazla polimorfik
olduğundan dolayı barkod bölgesi olarak kullanılmadan önce,
kullanılması planlanan bitki grubu için detaylı literatür incelemesi
yapılması ve primerlerin çok dikkatli seçilmesi veya tasarlanması
gerekmektedir.
trnH-psbA
Gen bankası veri tabanı incelendiğinde son dönemlerde en çok tercih
edilen kloroplast kökenli barkod bölgelerinden biri olduğu
görülmektedir. Bu barkodlama bölgesinin 5’ ve 3’ bölgelerinde birer
ekzon bulunması primer tasarımını kolaylaştırmaktadır (Şekil 7).
Şekil 7. Trnh-Psba Bölgesinin Yapısı (Hürkan, 2017)
Tüm barkod bölgelerinde olduğu gibi bu bölgede de intron alanı
oldukça polimorfiktir ve bu polimorfizmler genellikle insersiyon veya
delesyon şeklindedir (Kress ve Erickson, 2007). İntron bölgesinin
geniş bitki gruplarında çok fazla polimorfizm göstermesi, çoklu dizi
hizalaması sırasında karmaşıklıklara yol açabilmektedir (Chang ve
diğerleri, 2006). Bazı açık tohumlularda (gymnosperm) ve tek
çeneklilerde (monokotil) intron bölgesinin duplikasyona uğramasıyla

16
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
barkod bölgesi 1000 bç’den daha uzun olabilmektedir (Hollingsworth
ve diğerleri, 2009).
1.1.3. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)
Her bölünme öncesinde hücre içerisinde (in vivo) gerçekleşen DNA
replikasyonu ile genetik materyal iki katına çıkar ve yavru hücrelere
aktarılır. Bu replikasyon sırasında hücre içerisinde birçok enzim aktif
rol oynar. DNA’nın hücre dışında, tüp içerisinde (in vitro)
çoğaltılması tekniği ilk defa Kary B. Mullis tarafından 1985 yılında
geliştirilmiş ve bu tekniğin adı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)
olarak adlandırılmıştır. Bu teknik ile birlikte bilim insanları, hücre içi
biyokimyasal olaylara ihtiyaç duymadan DNA’nın herhangi bir
bölgesinin milyonlarca kopyasını elde edebilme fırsatı bulmuşlar ve
moleküler biyoloji çalışmalarında bu andan itibaren devrim
yaşanmıştır. Başlarda oldukça yavaş ve zahmetli olan PZR, sıcaklığa
dayanıklı bir enzim olan Taq Polimeraz Enziminin, jeotermal
bölgelerde yaşayan Thermus aquaticus bakterisinden izole edilerek
PZR’de kullanılmaya başlaması ile son derece pratik ve kolayca
uygulanabilir hale gelmiştir. PZR tekniğinde, hücre içi replikasyonun
aksine DNA sarmalının gevşemesini, her iki iplikçiğin replikasyon
sırasında açık kalmasını, replikasyonun nerede yapılacağını bildiren
primer parçalarının sentezlenmesini, RNA parçalarının çıkarılmasını
ve DNA parçalarının birbirine bağlanmasını sağlayan enzimlere
ihtiyaç duyulmamaktadır. PZR için ihtiyaç duyulan tek enzim,
primerlere nükleotit eklenmesini sağlayan DNA polimeraz enzimidir.

17
Standart bir PZR karışımında yer alan maddeler şu şekilde
sıralanabilir;
 Kalıp DNA
 Reaksiyon Tamponu
 dNTP’ler (ATP, GTP, CTP, TTP)
 İleri ve geri primerler
 Taq polimeraz
 Nükleaz içermeyen saf su
PZR basamakları şu şekildedir;
Denatürasyon: Bu aşamada kalıp DNA’nın ikili sarmal yapısı
(dsDNA) yüksek sıcaklıkta (~94ºC) bozularak denatüre olur ve tek
iplikçikli (ssDNA) forma dönüşür. Böylelikle primerlerin bağanması
için kalıplık edecek DNA zinciri oluşur.
Bağlanma: Bu aşamada birbirinin tamamlayıcısı olan primerler
(ssDNA) ile kalıp DNA (ssDNA) eşleşir ve dsDNA’yı oluşturur.
Kalıp DNA ile primerler arasında iyonik bağlar oluşur ve kırılması
oldukça zordur. Primerlerin bağlandığı bölgeler, Taq polimeraz
tarafından tanınır ve karşı zincirin sentezlenmesi için başlangıç
noktasını oluşturur. Bağlanma sıcaklığı primerin uzunluğunda, Guanin
/ Sitozin içeriğine göre değişebilmektedir.
Uzama: Uzama aşaması, Taq polimeraz enziminin nükleotitleri art
arda yerleştirerek kalıp zincire bir tamamlayıcı (komplementer) zincir
oluşturması aşamasıdır. Bu aşamanın sonucunda çift iplikçikli DNA

18
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
oluşur. Uzamanın gerçekleştirileceği sıcaklık Taq polimeraz
enziminin özelliğine bağlıdır. Bu sıcaklık genel olarak bağlanma
sıcaklığı ile denatürasyon sıcaklığı arasındadır ve optimum sıcaklık
72ºC’dir. Taq polimeraz, primerleri 5ʹ  3ʹ yönünde dizer. Uzama
aşamasının süresi, çoğaltılacak bölgenin uzunluğu ve Taq polimeraz
enziminin hızı ile belirlenir. Bu süre 1000bç için genellikle 1
dakikadır. İdeal şartlarda, her bir döngü sonrasında ürün miktarı ikiye
katlanmaktadır. Otuz döngüden oluşan bir PZR’de kopya sayısı
reaksiyon tamamlandığında 230=1073741824’e ulaşabilmektedir.
Şekil 8. Polimeraz Zincir Reaksiyonunda Kalıp DNA’nın Çoğalma Aşamaları
(Aryal, 2018)
1.1.4. Zincir sonlandırma yöntemi (Sanger Dizileme)
ile DNA dizileme
Kısa DNA parçalarındaki nükleotit dizilerini ortaya çıkarmanın birçok
yöntemi mevcuttur. Günümüz de dâhil bu yöntemlerden en çok
kullanılanı Sanger dizileme yöntemidir. Yöntem Frederick Sanger
tarafından 1977 yılında geliştirilmiştir ve temeli DNA polimeraz
aktivitesi ile dideoksinükleotittrifosfatlar (ddNTP) kullanılarak zincir
sonlandırılmasına dayanır. Reaksiyon tıpkı klasik PZR gibi başlar,

19
fakat farklı floresan boyalar ile işaretlenen ddNTP’ler her bir uzama
reaksiyonunu sonlandırır (Şekil 9). Her bir reaksiyonun, hangi ddNTP
ile sonlandırıldığı floresan boya seviyesini okuyan bir algılayıcı ile
tespit edilir. Bilgisayar ortamına aktarılan floresan verileri Adenin için
yeşil, Guanin için siyah, Timin için kırmızı ve Sitozin için mavi renkte
temsil edilir ve bir elektroferogram verisi oluşturulur (Şekil 10).
Elektroferogramda her renk bir nükleotiti ve floresan sinyal gücünü
gösterir.
Şekil 9. Sanger Yöntemi İle Gerçekleştirilen DNA Dizileme İşleminde
Floresan Boyalı ddNTP’lar DNA Polimeraz İle Uzatılmaya Başlanan Zincirleri
Sonlandırır
(Https://En.Wikipedia.Org/Wiki/Sanger_Sequencing#/Media/File:Sequencing.Jpg)
1.1.5. Temel biyoenformatik analizler
Her laboratuvar işleminin ardından olduğu gibi DNA barkodlama
sürecinde de laboratuvar işlemleri tamamlandığında elde edilen

20
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
verilerin bilgisayar ortamında (in silico) işlenmesi ve anlamlı bir
sonuç haline getirilmesi gerekmektedir. Verilerin bilgisayar ortamında
işlenmesi süreci, en az laboratuvar işlemleri kadar titizlikle
gerçekleştirilmelidir. Çünkü verilerin işlenmesi sırasında oluşabilecek
hatalar DNA barkodlarını doğrudan etkilemektedir.
Sanger DNA dizileme sonuçları, araştırıcılara ab1 dosya formatında
teslim edilir. Bu dosya içerisinde hem nükleotit dizileri hem de
elektroferogram verileri yer alır (Şekil 10).
Şekil 10. DNA Dizileme İşlemi Sonucunda Oluşturulan Elektroferogram
Verisi Görünümü
DNA dizleme dosyasını bilgisayarda görüntüleyebilmek için birçok
farklı yazılım kullanılabilir. Bunlardan ücretsiz olan bazı yazılımlar;
 BioEdit (Hall, 1999)
 FinchTV (https://digitalworldbiology.com/FinchTV)
 Chromas (http://technelysium.com.au/wp/chromas/)
 MEGA (https://www.megasoftware.net/)
 Chromatogram Explorer
(http://www.dnabaser.com/download/chromatogram-explorer/)
 Seqverter (http://www.genestudio.com/download_seq.htm)

21
Yukarıda listelenen ücretsiz yazılımlar veya satın alınabilecek daha
kapsamlı yazılımlar ile ab1 formatındaki elektroferogram dosyaları
açılıp düzenlenebilir ve DNA dizi verileri herhangi bir metin
düzenleyicisi tarafından açılabilir özelliğe sahip olan FASTA
formatına dönüştürülebilir.
DNA dizileme dosyası üzerinde yapılacak ilk işlem, dizi verilerinin
başında ve sonunda bulunan düşük kaliteli okumaların
temizlenmesidir ve bu işlem “trim” olarak adlandırılır (Şekil 11).
Şekil 11. DNA Dizileme Dosyasında Her İki Uçta Bulunan Ve Temizlenmesi
Gereken Düşük Kaliteli Bölgelerin Görünümü (Kırmızı İle Gösterilmiştir)
Düşük kaliteli okuma bölgelerinin temizlenmesinin ardından doğru
bölgenin dizilendiğini teyit etmek amacıyla National Center for
Biotechnology Information (NCBI) hizmetinde bulunan Basic Local
Search Alignment Tool (BLASTn - https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
Blast.cgi) kullanılarak nükleotit BLAST işlemi yapılması ve eşleşen

22
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
sonuçların incelenerek istenilen organizmaya ait olduğu kontrol
edilmelidir. Beklenen organizma yerine farklı ve filogenetik açıdan
uzak bir organizma ile yüksek oranda eşleşme sağlanıyorsa,
laboratuvar işlemlerinde bulaşma (kontaminasyon) durumundan veya
DNA dizileme hizmetinin alındığı biyoteknoloji firmasından kaynaklı
bir sorun olabileceği göz önünde bulundurulmalıdır ve tüm işlemler
titizlikle kontrol edilmelidir.
Elde edilen barkod bölgesinin kodlayan dizi (coding sequence – CDS)
içermesi durumunda bu bölgenin etiketlenmesi (annotation), daha
sonra yapılacak çalışmalarda kolaylık sağlayacaktır. Etiketleme işlemi
için birçok yöntem mevcuttur. Basit ve ücretsiz olan yöntem, elde
edilen barkod bölgesine BLASTn işleminin uygulanması ve sonuç
gösterim ekranında “Alignment” sekmesinin altında bulunan “CDS”
seçeneğinin işaretlenmesidir (Şekil 12). Böylelikle barkod dizisinde
kodlayan bölgeler, NCBI veri tabanında bulunan kodlayan bölgeler ile
eşleştirilecektir (Şekil 12).
Şekil 12. LFY Barkod Bölgesinin Blastn İşlemi Sonrasında CDS Seçeneği İle
Kodlayan Bölgesinin Gösterimi

23
Yukarıda belirtilen temel biyoenformatik analizler gerçekleştirildikten
sonra DNA barkod bölgeleri, çalışmanın amacına göre ileri
biyoenformatik analizler için hazır duruma gelmektedir.
Değerlendirme
DNA yapısının detaylı bir şekilde keşfedilmesinden sonra, genomda
bulunan kısa DNA dizilerinin bitki sistematiğinde ve filogenisinde
kullanımı, hem bitki sistematikçileri hem de moleküler biyologlar için
bir dönüm noktası olmuştur. Klasik morfolojiye dayalı sistematik,
özellikler karmaşık bitki gruplarında (Ör: orkideler) türlerin ve hatta
cinslerin birbirlerinden ayrımı noktasında tıkanmış durumdadır.
DNA barkodlama, sistematik ve filogenetik kullanım avantajlarının
yanı sıra, bitkisel ve hayvansal ürünlerin içeriklerinin tespitinde de
oldukça sık kullanılmaktadır. Bitkisel ürünlerin güvenirliğinin
kontrolünde ve gıda aldatmacalarının tespit edilmesinde yukarıda
değinilen DNA barkodlama bölgeleri yoğun bir şekilde
kullanılmaktadır. Analizler öncesinde, üzerinde çalışılacak olan bitki
grubuna özel DNA barkodlama bölgesinin belirlenmesi için literatür
taraması titizlikle yapılmalı, gerekli görüldüğü durumlarda çalışılacak
bitki grubuna özgü primerlerin sentezlenmesi gerektiği
unutulmamalıdır.

24
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
2. GERÇEK-ZAMANLI KANTİTATİF POLİMERAZ ZİNCİR
REAKSİYONU TEMELLİ YÜKSEK ÇÖZÜNÜRLÜKLÜ
ERİME YÖNTEMİ (HIGH RESOLUTION MELTING VEYA
HRM)
DNA’nın in vitro şartlarda polimeraz zincir reaksiyonu yöntemiyle
çoğaltılmaya başlandığı 1983 yılı, moleküler biyoloji için bir
kilometre taşıdır. Teknik, temel olarak yüksek ısıya dayanıklı Thermus
aquaticus bakterisinden izole edilen polimeraz enziminin (Taq
polimeraz) çok az miktardaki DNA’yı, tekrar eden döngüler halinde
milyonlarca kopya halinde çoğaltmasına dayanır.
Gerçek-Zamanlı Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Real-Time
qPCR), in vitro şartlarda çoğalan amplikonların çeşitli floresan
boyalar ile işaretlenerek gerçek zamanlı olarak takip edilebildiği,
çoğalmanın ne kadar oranda gerçekleştiğinin hesaplanabildiği ve hatta
çoğalan amplikon sayısının belirlenebildiği bir yöntemdir.
Çoğalmanın takip edilebilmesi ve hesaplanabilmesi, özellikle
canlıların gen anlatım seviyelerinin belirlenmesinde kullanılmaktadır.
qPCR temelli oldukça yeni bir teknoloji olan HRM, amplikonlara
kademeli olarak sıcaklık artışı uygulamasıyla floresan boyalı olan çift
iplikçikli DNA’nın (dsDNA) denatüre olup tek iplikçikli DNA’ya
(ssDNA) dönüşürken meydana gelen floresan ışıma oranındaki
değişimin sürekli olarak ölçülmesine dayanır (Şekil 13 ve 14).
DNA’nın denatürasyon süresi DNA molekülünün uzunluğuna,
Guanin/Sitozin içeriğine ve içerdiği nükleotit çeşitlerine bağlıdır.
Sıcaklık artışına bağlı olarak denatüre olan DNA’nın floresan ışıması

25
azalmaya başlar ve son derece hassas bir detektör tarafından algılanır.
Sonuç olarak farklı amplikonlar farklı zamanlarda ışıma farklılığı
gösterir ve bu şekilde tek nükleotit polimorfizmleri (SNP) dahi son
derece hassas olarak algılanır. HRM tekniğinin bu denli hassas oluşu,
genotipleme, metilasyon seviyesinin ölçümü, popülasyon genetiği,
gıda ürünlerindeki sahteciliğin tespiti, gıda güvenirliğinin korunması
ve daha bir çok alanda kullanımına olanak sağlamaktadır.
Şekil 13. Farklı Genotiplere Ait HRM Erime Eğrileri
Şekil 14. Bir Genotipe (Genotip B) Normalleştirilmiş HRM Erime Eğrileri

26
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
HRM yönteminde işlem basamakları temelde şu şekilde
sıralanmaktadır;
2.1. Çalışılacak Bitki Grubuna Özgü Moleküler
Belirteçlerin Belirlenmesi
Tıpkı DNA barkodlamada olduğu gibi, HRM yönteminin doğru
sonuçlar verebilmesi için doğru moleküler belirteçlerin (markır)
seçilmesi gerekmektedir. HRM yönteminde sonucun doğruluğu,
çalışılan bitki genotiplerinin birbirlerinden ayırt edilebilmeleri, yani
qPCR ile çoğaltılacak bölgelerin SNP içermeleri anlamına
gelmektedir. HRM yönteminin kullanıldığı çalışmalarda genomdaki
basit dizi tekrarlarının (Simple Sequence Repeat veya SSR) oldukça
yoğun olarak kullanıldığı görülmektedir. Bitki genetik çalışmalarında
oldukça önemli rolü olan SSR belirteçler, özellikle genotipleme
amacıyla uzun bir süredir kullanılmaktadır. Genom boyunca tekrar
eden bu dizilerin tekrar sayıları ve motifleri (nükleotit sıralamaları),
bitki gruplarının birbirlerinden ayırt edilebilmesine yardımcı
olmaktadır.
Bitkisel ürünlerin ve gıda ürünlerinin HRM yöntemi ile analizleri
yapılmadan önce, çalışılacak bitki grubuna özgü (spesifik) SSR
belirteçler detaylı literatür taraması ile belirlenmelidir. Her Real-Time
qPCR analizinde olduğu gibi en verimli sonuç için amplikon
boyutunun 150 bç’den küçük olması (ideal olarak 120 bç)
gerekmektedir.

27
HRM analizlerinde günümüzde SSR belirteçleri haricinde DNA
barkod bölgeleri de kullanılmaya başlanmıştır ve bu yöntem BAR-
HRM olarak isimlendirilmektedir. Filogenetik açıdan yakın bitki
gruplarını ayırt edebilme gücüne sahip barkod bölgeleri, amplikon
boyutu 150 bç’nin altında olacak şekilde yeni primerler tasarlanarak
HRM analizleri için kullanılmaya uygun olmaktadır. Druml ve
Cichna-Markl (2014), tarafından yapılan bir derleme makalede, HRM
ile gıda ürünlerinin analizlerinin yapıldığı birçok çalışma derlenmiş ve
hangi gıda ürünlerinde hangi HRM işaretçilerinin kullanımının yaygın
olduğu tablo halinde verilmiştir.
2.2. HRM reaksiyonu
Oda sıcaklığında son derece durağan (stabil) olan çift iplikçikli DNA,
artan sıcaklıklarda denatüre olur ve belirli sıcaklığa geldiğinde her bir
iplikçik birbirinden ayrılmaktadır. Çift iplikçikli DNA’nın %50’sinin
denatüre olduğu sıcaklık erime sıcaklığı (Melting Temperature veya
Tm) olarak adlandırılmakta ve Tm, DNA parçasındaki nükleotit
çeşidine, parçanın uzunluğuna ve Guanin/Sitozin içeriğine göre
değişiklik göstermektedir. Guanin ve Sitozin bazları arasında bulunan
üçlü hidrojen bağı, Adenin ve Timin arasındaki ikili hidrojen bağına
göre daha sağlam olmakta ve daha yüksek Tm’da kopmaktadır. Bu da
Guanin ve Sitozin bazlarınca zengin olan DNA parçalarının daha
yüksek sıcaklıklarda denatüre olması anlamına gelmektedir. Bütün bu
farkların tespit edilebilmesi DNA’nın floresan olarak boyanmasına
bağlıdır. Örneğin SYBR® Green boyası, çift iplikçikli DNA’ya,
nükleotit dizisi ne olursa olsun bağlanmaktadır. SYBR® Green çift

28
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
iplikçikli DNA’ya bağlanmadığı durumda oldukça az floresan
parlaklığa sahipken, çift iplikçikli DNA’ya bağlandığı durumda son
derece yüksek parlaklığa sahiptir. HRM sırasında kademeli olarak
artan sıcaklık (ör: 0,05°C/s) DNA’yı denatüre edeceğinden floresan
parlaklığında sürekli bir azalmaya neden olacaktır. Bu yöntemde
hassas bir detektör tarafından ölçülen floresan parlaklık seviyesine ait
veriler, yazılım tarafından sıcaklık değerleri ile bağdaştırılarak iki
boyutlu bir grafik haline dönüştürülmekte ve reaksiyondaki genotipler
arasındaki farklar ortaya çıkarılmaktadır.
2.3. Veri analizi
Sıcaklığın kademeli olarak arttırıldığı erime işlemi sırasında
kaydedilen floresan parlama (F) ve sıcaklık (T) verileri cihaz
tarafından sağlanan yazılım veya harici istatistik yazılımları
kullanılarak anlamlı hale dönüştürülebilmektedir. Yazılım tarafından
oluşturulan erime eğrileri arasındaki farklar, reaksiyona sokulan
bitkisel ürünler arasındaki genotip, çeşit veya tür farklarını ortaya
koymaktadır. Bir örnekle açıklamak gerekirse, sadece A bitkisinden
elde edilmesi gereken bir bitkisel ürünün içerisinde farklı bitkisel
katkı maddelerinin olduğundan şüphelenildiği durumda, HRM analizi
A bitkisi referans alınarak gerçekleştirilir. Yani reaksiyona hem A
bitkisi hem de şüphelenilen bitkisel ürün aynı anda dahil edilir ve
sonuçta yazılım tarafından oluşturulan erime eğrilerinin A bitkisine ait
erime eğrisi ile tam olarak örtüşüp örtüşmediği gözlemlenir. Tam
olarak örtüşme durumunda bitkisel ürünün orijinalliği teyit edilirken,

29
farklı erime eğrilerinin görülmesi, bitkisel ürün içerisinde farklı katkı
ürünlerinin olduğunu göstermektedir.
Değerlendirme
Son on yılda HRM yönteminin bitkisel gıda ürünlerinin orijinalliğinin
belirlenmesinde, gıda ürünlerine eklenen katkı maddelerinin
belirlenmesinde, gıda aldatmacasının tespitinde kullanılabilmesi için
oldukça yoğun çalışmalar yapılmakta ve HRM yöntemine ve en çok
gıda aldatmacasının yapıldığı bitkisel ürünlere özgü primerler
geliştirilmektedir. Yöntemin düşük maliyetli, son derece hızlı ve en az
laboratuvar işlemi kullanılarak gerçekleştirilebilir olması, gelecekte
gıda ürünlerinin orijinalliğinin tespitinde güvenle kullanılabilecek bir
yöntem olabileceğini biz araştırıcılara göstermektedir.
3. YENİ NESİL DİZİLEME TEMELLİ YÖNTEMLERE GENEL
BİR BAKIŞ
Uzun yıllardır kullanılan ve DNA polimeraz enzimi ile zincir
sonlandırmalı dideoksinükleotitlerin seçici olarak dâhil edilmesine
dayanan Sanger dizileme yöntemi ilk defa 1977 yılında Frederick
Sanger ve meslektaşları tarafından geliştirilmiştir. Yaklaşık 40 yıldan
fazladır geniş çapta kullanılan bu yöntemin yerini günümüzde Yeni
Nesil Dizileme (Next Generation Sequencing veya NGS) almıştır.
Patel ve diğerleri, 2006, tarafından gerçekleştirilen maliyet analizi
çalışmasına göre Hepatit C virüsünün tespit edilebilmesi için Sanger
dizilemede £178 (yaklaşık ₺1280) harcanması gerekirken NGS’de
£119 (yaklaşık ₺856) harcanması yeterlidir (2020 yılı için yaklaşık

30
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
fiyatlandırma). Başta fark küçük gibi görünse de milyonlarca
nükletitin olduğu genom dizileme söz konusu olduğunda bu fark on
binlerce Türk Lirası’na denk gelmektedir. Sanger dizilemenin aksine,
NGS’de paralel olarak aynı anda milyonlarca dizileme reaksiyonunun
gerçekleştirilmesi, tüm dizileme işleminin oldukça kısa sürede
gerçekleştirilmesini sağlamaktadır.
Tüm bu avantajları ile NGS, transkriptom dizilerinin ortaya
çıkarılmasında, plastit ve çekirdek genomlarının ortaya çıkarılmasında
günümüzde kullanılan en verimli yöntemdir. Farklı firmalar tarafından
NGS sistemi sürekli olarak geliştirilmekte, firmalar arasındaki bu
yoğun rekabet moleküler biyologlar ve biyoteknologların işlerini
oldukça kolaylaştırmaktadır.
3.1. RNA-Seq
Moleküler biyoloji biliminde santral dogma, DNA’da genler içerisinde
saklanan bilginin önce RNA’ya (transkripsiyon), sonra da proteine
(translasyon) aktarılmasını tanımlamaktadır (Crick, 1970). DNA’da
yer alan bu genetik bilginin fenotipe dönüşebilmesi, çevresel
faktörlerin de dâhil olduğu birçok uyarana bağlıdır. Bu nedenle
canlılarda fenotipin belirlenmesini sağlayan RNA’nın tamamının
(transkriptom) dizilenmesi, canlıların genetik ve morfolojik
ilişkilendirilmesi için önemli veriler sağlayabilmektedir.

31
Yüksek verimli yeni nesil dizileme teknolojilerinin gelişimi,
transkriptomiklerin analiz edilebilmesini sağlamıştır. Bu yöntemde
RNA öncelikle tamamlayıcı DNA’ya (complementary DNA veya
cDNA) dönüştürülür. Daha sonra bu cDNA’dan, seçilen NGS
teknolojisine göre bir kütüphane oluşturulur ve NGS işlemini
gerçekleştiren cihaz ile dizi okumaları gerçekleştirilir.
Transkriptom dizilemenin ilk aşaması RNA’nın organizmadan
izolasyonudur. RNA-Seq analizlerinin güvenilir olabilmesi için
yüksek kaliteli RNA’ya ihtiyaç duyulmaktadır. Bu nedenle RNA
ekstraksiyon sürenin son derece dikkatli yapılması ve herhangi bir
DNA kontaminasyonunun olmaması gerekmektedir. Farklı organizma
ve doku çeşitlerinden yüksek kaliteli RNA izolasyonu sağlanabilmesi
için piyasada bir çok markaya ait RNA izolasyon kitleri
bulunmaktadır. Araştırıcıya düşen görev, çalışacağı organizmaya en
uygun kite karar vermek, üreticinin protokolünü takip etmek ve
gerekirse protokolü değiştirerek en verimli RNA ekstraksiyonu
yöntemini oluşturmaktır.
Tüm NGS işlemlerinde ortak olan adım kütüphane hazırlanmasıdır.
RNA’nın dokudan izolasyonu sonrasında ters transkripsiyon enzimi
kullanılarak cDNA sentezi yapılır. cDNA’nın NGS teknolojisine
uygun hale getirilmesine kütüphane hazırlama aşaması denilmektedir.
Kütüphane hazırlama aşaması kullanılan RNA çeşidine ve NGS
teknolojisine göre farklılık göstermektedir. Kütüphane hazırlama
işlemi; istenilen RNA molekülünün dokudan izolasyonu, ters

32
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
transkriptaz enzimi ile cDNA sentezlenmesi, rastgele primerler
kullanılarak cDNA’nın çoğaltılması veya küçük parçalara ayrılması ve
son olarak bu parçalara dizileme adaptörlerinin bağlanması
adımlarından oluşmaktadır. Araştırıcının hangi NGS teknolojisini
kullanacağını önceden belirlemesi ve teknolojiye uygun protokoller
kullanarak NGS öncesi işlemleri titizlikle yapması gerekmektedir.
İster RNA-Seq olsun, ister diğer NGS yöntemleri, dizileme işleminin
son aşaması, elde edilen milyonlarca dizi okumasının
birleştirilmesidir. Bu aşamada sırasıyla dizi okumaları temizlenir
(trim), hizalanır (align), parçalar bir araya getirilir (assemble), okuma
kalitesinin değerlendirilir ve son olarak birleştirilen veriler
değerlendirilir (Şekil 15).
Şekil 15. NGS Verilerinin Biyoenformatik Olarak İşlenmesi

33
RNA-Seq ile genomda fonksiyonel diziler ortaya çıkarılabilmekte,
genetik bilgi fenotip ile ilişkilendirilebilmekte ve bitki grupları
birbirinden ayırt edilebilmektedir.
3.2. Genom dizileme
NGS teknolojisinin sağladığı en önemli getirisi kuşkusuz canlı
genomlarının kısa sürede ve uygun maliyetli olarak ortaya
çıkarılmasıdır. Birçok NGS teknolojisi mevcuttur (Illumina, NovaSeq,
IonTorrent Pacific BioSciences, Oxford Nanopore ve her geçen gün
eklenen yeni teknolojiler) ve bütün bu teknolojilerin temeli
milyonlarca küçük dizinin paralel olarak okunmasına dayanmaktadır.
Tıpkı RNA-Seq yöntemindeki gibi iş akışı neredeyse tamamen
aynıdır. Genom dizilemedeki en büyük fark, başlangıç molekülü
olarak RNA’nın değil, DNA’nın kullanılmasıdır. Böylece cDNA
sentezleme aşaması da iş akışından çıkarılmaktadır.
Genom dizilemede karar verilmesi gereken en önemli nokta özellikle
bitkilerde hangi genomun dizisinin elde edilmesine ihtiyaç
duyulduğudur. Bitki hücrelerinde, hayvan hücrelerinin aksine yer alan
kloroplast, bitki genomu çalışan araştırıcılar için bir ek seçenektir.
Çekirdek genomuna göre çok daha küçük olması, dizileme işleminin
çok daha kısa sürmesini ve çok daha az maliyetli olmasını
sağlamaktadır. Ayrıca kloroplast genomunda, bitki gruplarının
birbirlerinden ayırt edilebilmesini sağlayan barkod bölgelerinin
bulunması, kloroplast genomunu bitki gruplarının teşhisi ve bitkisel
ürünlerin tanımlanmasında kullanımına olanak tanımaktadır. Bunun
yanı sıra mitokondri genomunun dizilenmesi ile de hem bitki hem de

34
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
hayvan gruplarının teşhisinde kullanılabilecek birçok moleküler
işaretçi ortaya çıkarılabilmektedir.
Genel Değerlendirme
Geçtiğimiz son 100 yıl, hem teknolojide hem de teknolojiye bağlı
olarak moleküler biyolojideki gelişmelerin en fazla ivme kazandığı
dönemdir. DNA yapısının keşfedilmesinin üzerinden (1953) 30 yıl
sonra, DNA’nın polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılmaya
başlanmıştır (1983). DNA parçalarının baz dizileri Sanger’in zincir
sonlandırma yöntemiyle ortaya çıkarılmıştır (1977) ve günümüzde bu
teknoloji halen kullanılmaktadır. Moleküler biyologlar ile birlikte
çalışan mühendislerin ve bilgisayar programcılarının azmi ile
günümüzde bir organizmaya ait tüm genom dizisi sadece birkaç saat
içerisinde ortaya çıkarılabilir duruma gelmiştir. Moleküler biyolojinin
tüm bu imkânlarından yararlanılarak insan sağlığına etki eden ilk
faktör olan besinlerin testlerini yapmak, insanların daha kaliteli besin
maddelerine erişebilmelerini ve gıda maddeleri içerisine katılabilecek
katkı maddelerine karşı daha bilinçli olmalarını sağlamaktadır.
Bu kitap bölümünde anlatılan modern moleküler biyoloji yöntemleri,
bitkisel gıda ürünlerinin içeriklerinin tespit edilmesinde, bitkisel
ürünlerin içeriklerine eklenen katkı maddelerinin belirlenmesinde ve
bitkisel ürünlerde gıda aldatmacalarının tespit edilmesinde
kullanılabilen yüzlerce yöntemden sadece birkaçıdır. Araştırıcılar,
hangi bitki grubu ile çalışacaklarsa bu konuda literatür çalışmalarını
titizlikle gerçekleştirmeli, literatürdeki boşlukları iyi tespit etmeli ve
bu boşlukları doldurabilecek kendi yöntemlerini geliştirmelidirler.

35
KAYNAKÇA
Aryal, S. (2018). URL: https://microbiologyinfo.com/polymerase-chain-reaction-
pcr-principle-procedure-types-applications-and-animation/. Erişim tarihi:
07.02.2020.
Baldwin, B. G., Sanderson, M. J., Porter, J. M., Wojciechowski, M. F., Campbell, C.
S. ve Donoghue, M. J. (1995). The its Region of Nuclear Ribosomal DNA: A
Valuable Source of Evidence on Angiosperm Phylogeny. Annals of the
Missouri Botanical Garden, 82(2), 247–277.
Blázquez, M. A., Soowal, L. N., Lee, I. ve Weigel, D. (1997). LEAFY expression
and flower initiation in Arabidopsis. Development, 124(19), 3835–3844.
Chang, C. C., Lin, H. C., Lin, I. P., Chow, T. Y., Chen, H. H., Chen, W. H., Chaw,
S. M. (2006). The chloroplast genome of Phalaenopsis aphrodite
(Orchidaceae): Comparative analysis of evolutionary rate with that of grasses
and its phylogenetic implications. Molecular Biology and Evolution, 23(2),
279–291. doi:10.1093/molbev/msj029
Chase, M. W., Soltis, D. E., Olmstead, R. G., Morgan, D., Les, D. H., Mishler, B.
D., Albert, V. A. (1993). Phylogenetics of Seed Plants: An Analysis of
Nucleotide Sequences from the Plastid Gene rbcL. Annals of the Missouri
Botanical Garden, 80(3), 528–580.
Cheng, T., Xu, C., Lei, L., Li, C., Zhang, Y. ve Zhou, S. (2016). Barcoding the
kingdom Plantae: new PCR primers for ITS regions of plants with improved
universality and specificity. Mol Ecol Resour, 16: 138-149.
doi:10.1111/1755-0998.12438.
Crick, F. (1970). Central dogma of molecular biology. Nature, 227(5258), 561
Cuenoud, P., Savolainen, V., Chatrou, L. W., Powell, M., Grayer, R. J. ve Chase, M.
W. (2002). Molecular phylogenetics of Caryophyllales based on nuclear 18S
rDNA and plastid rbcL, atpB, and matK DNA sequences. American Journal
of Botany, 89(1), 132–144. doi:10.3732/ajb.89.1.132
Dong, W., Liu, J., Yu, J., Wang, L. ve Zhou, S. (2012). Highly Variable Chloroplast
Markers for Evaluating Plant Phylogeny at Low Taxonomic Levels and for
DNA Barcoding. PLoS ONE. doi:10.1371/journal.pone.0035071

36
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
Doyle, J.J. and Doyle, J.L. (1987). A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, 19, 11-15.
Druml, Barbara & Cichna-Markl, Margit. (2014). High resolution melting (HRM)
analysis of DNA – Its role and potential in food analysis. Food Chemistry.
158. 245–254. 10.1016/j.foodchem.2014.02.111
Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and
analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-
98.
Hilu, K. W., Alice, L. A. ve Liang, H., (1999). Phylogeny of Poaceae inferred from
matK sequences. Annals of the Missouri Botanical Gardens 86:835-851.
Hollingsworth, P. M., Forrest, L. L., Spouge, J. L., Hajibabaei, M., Ratnasingham,
S., van der Bank, M., Little, D. P. (2009). A DNA barcode for land plants.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 106(31), 12794–12797.
doi:10.1073/pnas.0905845106
Hurkan, K. (2017). Karasal bitkilerde DNA barkodlama: Bazı DNA barkod
bölgelerinin incelenmesi. Uluslararası Fen Araştırmalarında Yenilikçi
Yaklaşımlar Dergisi, 1(1), 57-67. doi: 10.29329/ijiasr.2017.99.6.
Kress, W. J. ve Erickson, D. L. (2007). A Two-Locus Global DNA Barcode for
Land Plants: The Coding rbcLGene Complements the Non-Coding trnH-
psbA Spacer Region. PLoS ONE, 2(6), e508.
doi:10.1371/journal.pone.0000508
Lahaye, R., van der Bank, M., Bogarin, D., Warner, J., Pupulin, F., Gigot, G.,
Savolainen, V. (2008). DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(8), 2923–2928.
doi:10.1073/pnas.0709936105.
Li, X., Yang, Y., Henry, R. J., Rossetto, M., Wang, Y. ve Chen, S. (2015). Plant
DNA barcoding: from gene to genome. Biological Reviews, 90(1), 157–166.
doi:10.1111/brv.12104.
Min, X. J. ve Hickey, D. A. (2007). Barcoding: Assessing the effect of varying
sequence length on DNA barcoding of fungi. Molecular Ecology Notes, 7(3),
365–373. doi:10.1111/j.1471-8286.2007.01698.x

37
Oh, S. H. ve Potter, D. (2003). Phylogenetic utility of the second intron of LEAFY
in Neillia and Stephanandra (Rosaceae) and implications for the origin of
Stephanandra. Molecular Phylogenetics and Evolution, 29, 203–215.
doi:10.1016/S1055-7903(03)00093-9.
Patel, Nishma & Ferns, BR & Nastouli, Eleni & Kozlakidis, Zisis & Kellam, Paul &
Morris, S. (2016). Cost analysis of standard Sanger sequencing versus next
generation sequencing in the ICONIC study.
DOI:https://doi.org/10.1016/S0140-6736(16)32322-4

38
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ

39
BÖLÜM 2
BİTKİ ISLAHINDA MOLEKÜLER BELİRTEÇLERİN
KULLANIMI
Dr. Adnan AYDIN
2
2
Iğdır Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü, Iğdır,
Türkiye. adnan.aydin@igdir.edu.tr

40
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ

41
GİRİŞ
Moleküler belirteçlerin ortaya çıkmasını gerektiren en önemli
faktörlerden biri klasik bitki ıslahının çok zaman alması ve daha hızlı,
daha etkin bir şekilde, eldeki bitki materyalinin daha verimli kullanımı
açısından moleküler belirteçlerin kullanımını gerektirmiştir.
Moleküler belirteçlerin bitki ıslahında seleksiyon stratejilerini
geliştirmek için geniş kapsamlı yeni uygulamaların benimsenmesinde
önemli ölçüde etkilemiştir (Yorgancılar vd. 2015).
Günümüzde teknolojnin gelişmesiyle birlikte genetik düzeyde olan
çalışmalar da giderek hız kazanmaktadır. Bu bağlamda bitki ıslahı,
bitki grupları arasındaki genetik çeşitlilikten kaynaklanan çeşitliliği ve
genetik yapıyı anlamak başarıyı artırmada en önemli faktörlerden
biridir (Abdellatif ve Soliman 2013). Kültür bitkilerinde farklı çeşit
üretebilmek için ıslah çalışmalarında iyi ebeveynler seçilerek başarı
şansı artırılabilir. Bitki popülasyon yapısını anlamak ve heterotik
grupları tanımlamak için genetik çalışmalarda moleküler belirteçlerin
kullanımı oldukça önemlidir. Genetik çeşitliliğin ortaya konmasında
morfolojik belirteçler (Van Esbroeck vd. 1999), biyokimyasal
belirteçler (Wendel vd. 1992) ve DNA’ya dayalı moleküler belirteçler
(Yu vd. 2012) kullanılarak yapılmaktadır. Her ne kadar morfolojik ve
biyokimyasal belirteçler kullanılsa da bu belirteçler çevre şartlarından
etkilendiklerinden bitki genomunu tanımlamakta yetersiz
kalmaktadırlar (Lukonge vd. 2007). Moleküler belirteçler ise
doğrudan allellik çeşitliliğini ölçebildikleri ve organizmalar arasındaki

42
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
genetik uzaklıkları verdiklerinden dolayı daha güvenilir ve bilgi
vericidirler (Tyagi vd. 2014). Özellikle 1985 yılında Polimeraz Zincir
Reaksiyonunun (PZR) icat edilmesiyle farklı çalışmalarda kullanılmak
üzere moleküler belirteçlerin üretimi daha da artmıştır. PZR tabanlı
moleküler belirteçler, popülasyon genetiği, genotip tanımlamaları ve
korunması, tohum saflığı ve hibrit kalitesinin izlenmesi, gen
etiketlemesi, germplazm değerlendirmesi, filogenetik çalışmalar,
akrabalık çalışmaları, teşhis, genetik ve adli tıp, konservasyon gibi
moleküler genetik çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır
(Alzohairy vd 2015). İdeal bir moleküler belirteç tekniğinin;
1. Polimorfik olması ve bütün genomda kullanılabilir olması
2. Genetik farklılıkların ortaya çıkarılmasında güçlü olması
3. Çok sayıda olması, bağımsız olması ve güvenilir belirteçler
üretiyor olabilmesi
4. Karmaşık olmamalı, hızlı sonuç veriyor olmalı ve ucuza mal
edilmesi
5. Az miktarda Nükleikasite veya dokuya ihtiyaç duyması
6. Farklı fenotiplerle bağlantı oluşturması gibi özelliklere sahip
olması istenen özellikleri arasındadır.
Fakat hiçbir moleküler belirteç tekniği yukarıda bahsedilen ideal bir
belirteç tekniğinin hepsine aynı anda sahip olamamaktadır. Moleküler
belirteçler, kodlama yapan veya kodlama yapmayan lokuslarda
genomun farklı bölgelerini hedefler. Buna bağlı olarak günümüze dek
100 yakın belirteç tekniği geliştirilmiştir. Bunlardan bazıları Tablo
1’de geliştirilme dönemlerine bağlı olarak gruplandırılmıştır.

43
Tablo 1. Günümüze Değin Geliştirilmiş Bazı Moleküler Belirteçlerin Bilgileri
(Alzohairy vd 2015)
KISALTMA
YIL
TEKNİK
KAYNAK
A) Birinci Nesil belirteçler
ASO
1986
Allele Specific Oligonucleotides
Saiki et al. (1986)
AS-PCR
1988
Allele Specific Polymerase Chain
Reaction
Landegren et al.
(1988)
OP
1988
Oligonucleotide Polymorphism
Beckmann (1988)
PCR
1985
Polymerase Chain Reaction
Saiki et al. (1985)
RFLP
1974
Restriction Fragment Length
Polymorphism
Grodzicker et al.
(1974)
SSCP
1989
Single Stranded Conformational
Polymorphism
Orita et al. (1989)
STS
1989
Sequence Tagged Site
Olsen et al. (1989)
VNTR
1985
Variable Number Tandem Repeats
Jeffreys et al. (1985)
B) İkinci Nesil Belirteçler
AP-PCR
1990
Arbitrarily Primed Polymerase Chain
Reaction
Welsh and
McClelland (1990)
ARMS
1992
Amplification Refractory Mutation
System PCR
Newton et al. (1989)
CAPS
1992
Cleaved Amplified Polymorphic
Sequence
Akopyanz et al.
(1992)
DOP-PCR
1992
Degenerate Oligonucleotides Primer -
PCR
Telenius (1992)
ISJ-PCR
1991
Intron-Exon Splice Junction PCR
Weining and
Langridge (1991)
ISSR
1994
Inter Simple Sequence Repeats
Zietkiewicz et al.
(1994)
MAAP
1993
Multiple Arbitrary Amplicon Profiling
Caetano-Anolles et al.
(1993)
RAPD
1990
Randomly Amplified Polymorphic
DNA
Williams et al. (1990)
Double-RAPD
1991
RAPD by using two primers
Klein-Lankhorst et al.
(1991)
RLGS
1991
Restriction Landmark Genome
Scanning
Hatada et al. (1991)

44
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
SAMPL
1994
Selective Ampl. MicroSatellite
Polymorph. Loci
Morgante and Vogel
(1994)
SCAR
1993
Sequence Characterized Amplified
Region
Paran and Michelmore
(1993)
SSR
1992
Simple Sequence Repeats
Akkaya et al. (1992)
STMS
1990
Sequence Tagged Micro Satellite Sites
Beckmann and Soller
(1990)
Tetra-PCR
1992
Allele specific amplification by tetra-
primer PCR
Ye et al. (1992)
C) Üçüncü Nesil Belirteçler
AFLP
1995
Amplified Fragment Length
Polymorphism
Vos et al. (1995)
ASAP
1995
Allele Specific Associated Primers
Gu et al. (1995)
CFLB
1996
Cleavage Fragment Length
Polymorphism
Brow (1996)
DAMD-PCR
1997
Directed Ampl. of Mini Satellite DNA-
PCR
Bebeli et al. (1997)
IMP
2001
Inter-MITE Polymorphism
Chang et al. (2001)
IRAP
1999
Inter- Retrotransposon Amplified
Polymorphism
Kalendar et al. (1999)
ISTR
1996
Inverse Sequence-Tagged Repeats
Rohde (1996)
MITE
2000
Miniature Inverted-Repeat Transposable
Element
Casa et al. (2000)
qRT-PCR
1996
quantitative Real Time PCR
Heid et al. (1996)
RBIP
1998
Retrotransposon Based Insertional
Polymorphism
Flavell et al. (1998)
REMAP
1999
Retrotransposon-MicroSatellite Ampl.
Polym.
Kalender et al. (1999)
R-ISSR
2005
Combinations of RAPD-ISSR and
RAPD-SSR
Ye et al. (2005)
R-PCR
1995
Restricted-PCR
Puskás and Bottka
(1995)
RT-PCR
1993
Real-Time PCR
Higuchi et al. (1993)
SNP
1994
Single Nucleotide Polymorphisms
Jordan and Humphries

45
(1994)
SRAP
2001
Sequence Related Ampl. Polymorphism
Li and Quiros (2001)
SSAP
1997
Sequence Specific Ampl. Polymorphism
Waugh et al. (1997)
TE-AFLP
2000
Three Endonuclease AFLP
Van der Wurff et al.
(2000)
Triple-RAPD
2008
Triple RAPD by using three primers, or
more
Mansour et al. (2008)
D) Yeni Nesil Belirteçler
DArt
2004
Diversity ARrays Technology
Wenzl et al. (2004)
KASP
2013
Kbioscience Allele-Specific Polym.
Assay
Uitdewilligen et al.
(2013)
MSAP
2003
Methylation Sensitive Ampl.
Polymorphism
Baurens et al. (2003)
RGF
2008
Recursive Genome Function
Pellionisz (2008)
sRNA-qRT-
PCR
2010
Small RNA qRT-PCR
Varkonyi-G and
Hellens (2010)
E) Genom Dizileme (Birinci ve Yeni Nesil)
AFFYMETRIX
1991
DNA and RNA Microarrays / Chip
Fodor et al. (1991,
2007)
ddNTPs
1980
Dideoxynucleotide Sequencing (ABI)
Sanger et al. (1980)
ILLUMINA /
SOLEXA
2008/2006
The first Short Read Sequencer /
bridgePCR
in: Bentley (2006)
Ion Torrent
2010
Proton sequencing (Portable sequencer)
/ emPCR
Pennisi (2010)
NanoPorSeq
(?)
2015/1995
Nanopore genome sequencer
Hayden (2012)
ROCHE454
1996
Pyrosequencing (the 1st Next Gen. Seq.)
/ emPCR
Ronaghi et al. (1996,
1999)
RT-SEQ
(SMRT)
2013/2010
Single Molecule Real Time seq./
PACBIOSCI
http://pacbiodevnet.com
SOLiD/ABI
2006
Seq. by Oligonucl. Ligation and
Detection / emPCR
in: Tang et al. (2009)
StarLight (?)
2015
Single-molecule sequencing with
quantum dots
in: Glenn et al. (2011)

46
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
1. BİYOKİMYASAL BELİRTEÇLER
Biyokimyasal belirteçlerin kullanımı, tohum depolama, proteinlerinin
ve izozimlerinin analizini içerir. Bu teknik enzimatik fonksiyonları
kullanır ve spesifik genler için alel frekanslarının ölçülmesinde
kullanılan güçlü ve nispeten ucuz bir yöntemdir. Allozimler,
populasyonlar arasında ve populasyonlar içerisinde gen ve genotipik
frekansların bir tahminini sağlar. Bu bilgi genetik çeşitliliği, gen
akışını, türlerin genetik yapısını ve türlerin dışa geçiş oranları,
populasyon yapısı ve bitki yabani akrabalarında olduğu gibi
populasyon ayrışması arasındaki karşılaştırmaları ölçmek için
kullanılabilir (Brown 1979, Hamrick ve Godt 1997, Guarino 1999,
Volis vd. 2001, Gonzalez vd. 2005, Spooner vd. 2005).
Biyokimyasal belirteçlerinen önemli avantajları, ko-dominant
özellikte olması, epistatik ve pleiotropik etkilerin olmaması,
kullanımlarının kolay olması ve düşük maaliyerde kullanılabilir
olmasıdır. İzozimlerin dezavantajları ise şunlardır:
1. Karşılık gelen az sayıdaki belirteçe sahip tür başına yalnızca
birkaç izozim sistemi vardır;
2. Mevcut olan polimorfik enzimatik sistemlerin sayısı sınırlıdır
ve enzimatik lokuslar, genomun (ifade edilen kısım) sadece
küçük ve rastgele olmayan bir kısmını temsil eder (bu nedenle,
gözlenen değişkenlik tüm genomu temsil etmeyebilir);
3. Bu belirteçlerin çok sayıda numunenin analiz edilmesine izin
vermesine rağmen, farklı türlerden, lokuslardan ve
Laboratuvarlardan numunelerin karşılaştırılması problemlidir

47
çünkü ekstraksiyon metodolojisi, bitki dokusu ve bitki
aşamasından etkilenirler (Mondini vd. 2009).
2. RESTRİKSİYON-HİBRİDİZASYON TABANLI
MOLEKÜLER BELİRTEÇLER
Restiriksiyon-hibridizasyon tekniklerine dayanan moleküler
belirteçler, bitki çalışmaları alanında nispeten erken kullanılmış ve
restriksiyon endonükleazlarının ve hibridizasyon yönteminin
kullanımının birleştirilmesiyle ortaya çıkmıştır. Restiriksiyon
endonükleazları, DNA'yı kesebilen, spesifik palindromik dizilerini
tanıyan ve farklı boyutlarda DNA dizi parçaları üreten bakteriyel
enzimlerdir (Southern 1975). DNA dizilerindeki herhangi bir
değişiklik (nokta mutasyonları), iki bölge arasındaki mutasyonlar
(delesyonlar ve translokasyonlar) veya enzim bölgesi içindeki
mutasyonlar, DNA dizilerinin endonükleazlarla muamelesinden sonra
farklı uzunluktaki fragmentlerin ortaya çıkmasına neden olmakta ve
varyasyon üretilebilmektedir. RFLP ve VNTRs belirteçleri,
Restiriksiyon-hibridizasyon tekniklerine dayanan moleküler
belirteçlere örnektirler. RFLP’de DNA polimorfizmi kimyasal olarak
etiketlenmiş bir DNA probunun hibridizasyonu sonucu ortaya
çıkmaktadır.

48
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
RFLP tekniğinin avantajları:
1. Tür, Cins ve Familyalar arası transfer edilebilirliği yüksektir.
2. Farklı laboratuvar ve farklı araştırıcılar tarafından aynı
sonuçlar elde edilebildiğinden güvenilirdir.
3. RFLP belirteçleri ko-dominant özellikte olduklarından
homozigot ve heterizogot bireylerin bir birinden ayrılmasında
kullanılabilmektedirler.
4. Polimorfizim düzeyleri orta derecededir.
RFLP tekniğinin dezavantajları:
1. Analizlerin zaman alıcı, yüksek maliyette ve çok iş gücü
gerektirmektedir.
2. Radyoaktif etiketleme yönteminin kullanılıyor olması
çevreye ve sağlığa zarar vermektedir.
3. Kullanılan DNA’nın yüksek kalitede olması DNA izolasyonu
zorluğunu ortaya koymaktadır.
4. Az kopya edilen dizilişlerin genomlarda belli noktalarda
kümelenmelerinden dolayı RFLP belirteçleri genom üzerinde
rastgele dağılım göstermediklerinden haritalamayı olumsuz
yönde etkilemektedir. (Yorgancılar vd. 2015).
3. BAZI PZR TABANLI MOLEKÜLER BELİRTEÇLER
3.1. RAPD
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tekniğinin geliştirilmesiyle, bir
genomun spesifik bölgelerinin çoğaltılması ve analiz edilmesini daha
mümkün bir hale getirmiştir (Althoff vd. 2007). Bunların arasında ilk

49
geliştirilen PZR tabanlı belirteç RAPD tekniğidir. RAPD belirteçleri
basit, kısa oligonükleotid primerlerin kullanılmasıyla genomik
DNA’nın herhangi bir parçasının rastgele olarak PZR yardımıyla
çoğaltılması sonucu oluşan amplifikasyonlar arasındaki polimorfizime
dayanır (Williams vd. 1990). Uzunluğu 10 nükletidten oluşan ve
Operon sistemiyle geliştirilen tek tip primer kullanılmaktadır.
Kullanılan bu primer, her iki DNA ipliğinde de 5′→3′ yönünde çalışır.
Dolayısıyla kullanılan primerin yapışabildiği DNA üzerinde birbirine
yakın iki bölgenin amplifikasyonu yapılır (Şekil 1).
PZR ile çoğaltılmış amplikonlar agaroz veya poliakrilamid jel
elektroforez yöntemiyle ayrılabilmekte ve bu şekilde polimorfizim
belirlenebilmektedir. RAPD tekniğinin uygulanmasındaki kolaylık,
oligonükleotidlerin çok fazla sayıda bulunabilmesi ve kolay bir
yöntem olması, RFLP tekniğinin tersine az miktarda DNA’ya ihtiyaç
duyulması gibi avantajlarından dolayı tercih edilen bir belirteç
yöntemidir.
RAPD tekniği de diğer PZR tabanlı teknikler gibi karakterizasyon ve
haritalama çalışmalarında daha az çalışmaya, daha az zamana ve daha
az maliyete gereksinim duyduğundan ötürü çok tercih edildiği rapor
edilmektedir (Yorgancılar vd 2015). RAPD tekniğini diğer büyük
avantajlarından biriside genomik DNA (gDNA) bilgisine ihtiyaç
duyulmamasıdır.
RAPD belirteçlerinin bu avantajlarına karşılık, dominant özellikte
olmasından kaynaklanan yorumlamanın zorluğu, karmaşık olması ve

50
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
tekrar edilebilirliğinin olmaması en büyük dezavantajları arasında
gelmektedir (Williams vd. 1990).
Şekil 1. RAPD Amplifikasyonunun Çoğaltım Şeması
RAPD tekniğinin, genetik varyasyon araştırmalarında, bitki genetik
haritalarının çıkarılmasında ve markır yardımıyla seleksiyonda (MAS
“Marker Asissted Selection”) yoğun olarak kullanılmasının nedeni,

51
tekniğin diğer moleküler tekniklere göre daha ucuz, daha az DNA
gerektirmesi ve kullanılabilirliğini daha kolay olmasından
kaynaklanmaktadır Aydın 2004).
RAPD tekniğinin avantajları:
1. Az iş gücü gerektiri, ucuzudur ve hızlı sonuç verir.
2. Çok fazla DNA’ya ihtiyaç duymaz
3. gDNA bilgisine ihtiyaç yoktur.
4. Polimorfizim oranı yüksektir.
RAPD tekniğinin dezavantajları:
1- Güvenilirliği düşüktür.
2- Farklı laboratuvarlarda farklı sonuçlar elde edilebilmekte ve
farklı PZR cihazları arasında da farklı sonuçlar
oluşabilmektedir.
3- Dominant belirteç olması dezavantajları arasında
sayılmaktadır.
3.2. AFLP
Vos vd. (1995) tarafından geliştirilen bu teknik, RAPD tekniğinin
prensiplerinden yararlanarak RAPD tekniğinin dezavantajlarını
gidermek için AFLP tekniğini geliştirmişlerdir. AFLP tekniğinin
tekrarlanabilirliği ve polimorfizim düzeyi RAPD tekniğine göre daha
yüksek olması bu tekniğin kullanılabilirliğini artırmıştır. Bu teknikte
gDNA önce altı baz dizisini tanıyan EcoRI (5’…G^AATTC…3’) ve

52
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
daha sonra dört baz dizisini tanıyan MseI (5’…T^TAA…3’)
restriksiyon enzimleri tarafından kesilir.
Kesilen parçaların uçlarına nükleotid dizilişi sentetik olan DNA’lar
eklenir. Eklenen sentetik DNA’nın nükleotid dizilişini de taşıyan
başlatıcı DNA’lar (primerler) kullanımıyla nispeten spesifik DNA
çoğaltımı yapılır. Bu çoğaltma iki aşamada gerçekleştirilir. İlk
aşamada, her iki uçtan DNA kesim enzimlerinin tanıdığı diziden
sonraki ilk nükleotide göre seçici çoğaltımın yapıldığı ön üretim
yapılır. Asıl üretimde ön üretimde elde edilen parçaların kullanımıyla
kesim enzimi tanıma yerinden sonraki ikinci ve üçüncü nükleotidler
için seçici üretim yapılır. Bütün başlatıcılar sentetik uçların nükleotid
dizilişini de taşıdığı için üretim oldukça spesifik şartlarda yapılmış
olur.
AFLP tekniğinin avantajları:
1. RAPD’den yavaş RFLP’den hızlıdır.
2. Masraf, işgücü ve güvenirlik açısından RAPD ve RFLP
arasındadır.
3. Çok sayıda aynı anda etkili bir şekilde tarama yapması nedeni
ile parmak izi analizine çok uygundur.
4. Sayıları RAPD ve RFLP’den daha fazladır.
5. Genomik DNA ile ilgili ön bilgiye gerek yoktur.
6. Polimorfizm oranı çok yüksektir.
7. Bu özelliklerinden dolayı otomasyona uygundur.

53
AFLP tekniğinin dezavantajları:
1. Çoğunlukla dominant belirteç özelliğindedir. Ancak son
zamanlarda ko-dominant belirteçler de verdiği bildirilmiştir.
2. Farklı genetik haritalar arasında transferleri güçtür.
3.3. ISSR
ISSR yöntemi, ökaryotik genomlarda tekrar eden 2, 3, 4, 5 gibi
nükleotid birimlerinin lokustan bağımsız bir şekilde genomda rastgele
dağılımlarını esas alan ve bu tekrar bölgeleri arasındaki bölgelerin
çoğaltımı sağlayan ancak RAPD yöntemine göre çok daha hassas ve
tekrarlanabilirliği yüksek olan bir yöntem olarak rapor edilmektedir
(Şekil 2) (Zietkiewicz vd. 1994, Yorgancılar vd. 2015).

54
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
Şekil 2. ISSR Amplifikasyonunun Çoğaltım Şeması
ISSR belirteçleri genetik varyasyonun ortaya konmasında,
germplazmlar arasındaki genetik ilişkiyi ortaya koyan çalışmalarda,
genom haritalarının oluşturulmasında ve evrim biyolojisinin
anlaşılmasında birçok bitki de uygulanabilen etkili bir yöntemdir
(Reddy vd. 2002).
ISSR belirteçlerinin kullanımı hızlı olması, uygulanmasının kolay
olması ve SSR bölgeleri arasını çoğaltan primerlerin RAPD tekniği
primerlerine göre daha uzun olması bu yöntemin güvenirliğini

55
artırmaktadır (Bornet ve Branchard, 2001). Yeterli bilgi sunan ISSR
yönteminde kullanılan primerlerin düşük bir maliyet sunması,
zamandan tasarruf etmesi ve genetik analizlerde kolaylık sağlaması bu
yöntemin avantajları arasındadır.
ISSR yöntemi bazı durumlarda ko-dominant belirteç sunmalarına
karşı genelde Mendel kalıtımına uygun olarak dominant belirteçler
vermektedir (Wang vd. 1998). Genelde dominant belirteç üretiyor
olması da bazı moleküler belirteç yöntemlerine karşı dezavantaj olarak
karşımıza çıkmaktadır.
ISSR belirteçleri AFLP belirteçlerinin yüksek maliyeti, RAPD
belirteçlerinin düşük güvenirliği ve Primer sentezlenebilmesi için
sekans bilgisi gerektiren SSR belirteçlerinin olumsuzluklarını
gidererek önemli ölçüde avantaj sağlamaktadır (Zietkiewicz vd.
1994).
3.4. SSR (Mikrosatellit)
Ökaryotik genomlar önemli miktarda ardışık olan ve ardışık olmayan
tekrarlı DNA dizleri içermektedir. Ardışık tekrarlar (TR - “tandem
repeat”), en az iki bitişik tekrarlayan birimi içeren DNA dizi
motifleridir. Ardışık tekrarlar hem prokaryotik hem de ökaryotik
genomlarda bulunmaktadırlar (Victoria vd. 2011). Ardışık dizileri
farklı tekrar birim büyüklüğüne ve tekrarlanma sayısına göre üç
kategoriye ayrılmaktadırlar (Aydın 2018).

56
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
Bunlar:
1. Basit tekrarlı diziler (SSR’lar) olarak da adlandırılan
mikrosatallitlerdir (Şekil 3) ve 1-50 baz çifti “base pair”
(bp) büyüklüğündeki DNA tekrar dizilerinden oluşurlar, 5-
100 kez arasında tekrarlarlar ve sıklıkla genomun
ökromatin bölgelerde bulunurlar,
2. Minisatallitler, genellikle genomun ökromatin ve
heterokromatin bölgelerinde bulunan 20-50 kez tekrarlanan
ve 10-400 bp büyüklüğünde olan DNA tekrar dizilerinden
oluşur,
3. Satallitler ise birim boyutu 5-300 bp’dir, genellikle
sentromer ve telomerlerin heterokromatin bölgelerinde
bulunan 10,000-1,000,000 kez tekrar eden bölgelerdir
(Jeffreys vd. 1985; Gemayel vd. 2012; Bagshaw 2017).
Son yıllarda ardışık tekrar eden DNA dizileri arasında mikrosatellitler,
bitki genotiplemeleri için en yaygın şekilde ve güvenilir kullanılan
moleküler belirteç tipi olmuştur. İlk olarak Litt ve Lutty (1989)
tarafından isimlendirilen bu basit tekrarlı DNA dizileri mono-, di-, tri-,
tetra-, penta-, ve hexanükleotit motiflerinin bitki ve hayvan
genomlarında ardışık olarak dizilmektedirler (Ashley 2010).
Mikrosatallitler ko-dominant özellikte olması, genomda bol miktarda
bulunmaları ve düzgün dağılış göstermeleri, polimorfizim
düzeylerinin yüksek olması, multi-lokus ve multi-allellik özelliği
göstermesi, tekrarlanabilirliklerinin yüksek düzeyde olması ve
güvenilir özellikte olmaları bu belirteç tekniğinin hem güvenirliğini

57
artırmış hem de kullanılırlığını yaygınlaştırmıştır (İnce vd. 2017). Bu
belirteçler başta genetik çeşitlilik, popülasyon yapısını anlama,
hibritlerin tanımlanmasında, genetik haritalamalarda, çeşit teşhisinde,
ebeveynleri bir birinden ayırmada, filogenetik çalışmalarda,
popülasyon genetiğinde, MAS ve pek çok agronomik çalışmalarda
dahil olmak üzere bir çok çalışmada kullanımı yaygınlaşmıştır
(Azpilicueta vd. 2013; Dufresnes vd. 2014).
Mikrosatallitler (SSR) hücre içinde bulunan organel DNA’sı ya da
nüklear genomda bulunma durumlarına göre sınıflandırılabilir. Bunlar
mitokondri, kloroplast veya çekirdekteki bulunma durumuna göre
değişir. Aynı zamanda SSR’lar DNA dizisi üzerindeki bulunduğu
bölgeye göre de sınıflandırılmaktadırlar. DNA dizisi üzerindeki
bulunduğu bölgeye göre genomik-SSR ya da EST-SSR’lar olarak
sınıflandırılmaktadırlar. Genomik tabanlı SSR’lar gelenekseldir ve
genomun ifade edilmeyen bölgeleri üzerinde bulunmaktadırlar. EST
tabanlı SSR’lar ise genin ifade edilebilen kısmından elde edilmekte ve
agronomik özellikleri de etkilemektedirler (Aydın 2018).

58
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
Şekil 3. SSR Amplifikasyonunun Çoğaltım Şeması
SSR’lar arasında epistatik ve pleiotropik etkilerinin olmaması hem de
diğer lokuslarla etkileşimlerini engeller hemde polimorfizim düzeyleri
çevre şartları, bitki gelişim, doku-organ varyasyonlarından etkilenmesi
durumunu ortadan kaldırmakta ve bu belirteç tekniği için büyük bir
avantaj sağlamaktadır. Buna karşın SSR’lardaki Null allelerin varlığı
ve homoplasi durumu dezavantaj sağlamaktadır (Aydın 2018). Null
allelerin varlığı SSR belirteçlerinin trasnfer edilebiliriğini olumsuz
yönde etkilemekte ve homozigot ile heterozigot bireylerin ayırt
edilmesinde sorunlar ortaya koymaktadır.

59
3.5. SNP
SNP belirteçleri aynı DNA dizileri arasındaki tek nükleotidten
kaynaklanan polimorfizim olarak tanımlanmaktadır (Jordan and
Humphries 1994). SNP’ler, genomda en fazla miktarda bulunan
moleküler belirteçtir. Genomun kodlanmayan bölgelerinde genelde
daha yaygın bulunurlar. Kodlama bölgelerinde, bir SNP mevcut
olduğunda, bir amino asit sekansı değişimine (Sunyaev vd. 1999)
neden olan eşanlamlı olmayan mutasyonlar veya amino asit sekansını
değiştirmeyen eş anlamlı mutasyonlar üretebilir. Bununla birlikte, eş
anlamlı değişiklikler mRNA eklemesini değiştirerek fenotipik
farklılıklara neden olabilir (Richard ve Beckman 1995).
SNP genotipleme analizlerinin çoğu, alel spesifik hibridizasyon,
oligonükleotit ligasyonu ya da primer uzatma gibi yöntemlere dayanır
(Sobrino vd. 2005). Genotipleme yöntemleri, DNA çipleri dahil,
SNP’lere dayanan allel spesifik PZR ve primer uzatma yaklaşımları,
yüksek veri çıkışları ve otomasyona uygun olmaları açısından
özellikle çekicidir. Bitki çeşitlerinin hızlı tanımlanması ve ultra
yüksek çözünürlükte genetik haritaların oluşturulması da dahil olmak
üzere çok çeşitli amaçlarla kullanılmaktadırlar (Mondini vd. 2009).

60
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
Tablo 2. Bazı Moleküler Belirteçlerin Farklı Özelliklerinin Karşılaştırılması.
Molecular Belirteçler
RFLP
RAPD
AFLP
SSR
CAPS
SCAR
IRAP/
REMAP
RAMP
SSCP
SNP
Polimorfizim Derecesi
O
O
O
O
D
O
O
O
D
Y
Lokus Spesifikliği
E
H
H
H
E
E
E
E
E
E
Dominant/Kodominant
Ko
Do
Do
Ko
Ko
Ko
Do
Do
Ko
Ko
Çoğaltma Kolaylıı
Y
D
Y
O
Y
Y
Y
O
O
Y
Bulunma sıklığı
Y
Y
Y
O
D
D
Y
O
D
Y
Dizi Bilgi İsteği
E
H
H
H
E
E
E
H
E
E
DNA Kalitesi
Y
D
O
D
D
D
D
D
D
D
Otomasyon
H
E
E
E
E
E
E
E
H
E
Maliyet
Y
D
O
D/O
O
D
D
O
Y
D
Teknik Gereksinim
Y
D
O
D/O
Y
O
Y
Y
Y
O
Anahtar: Y: Yüksek, O: Orta, D: Düşük, E: Evet, H: Hayır, Do:
Dominant, Ko: Kodominant
SONUÇ
Moleküler belirteçlerin gelişmesiyle bitki genomu daha çok
tanınmakta ve bu bağlamda bitki ıslahındaki gelişmeler hız kazanarak
daha da ileri düzeye gelmektedir. Moleküler belirteçler geliştirildikçe
ve teknolojinin ilerlemesi ile hem sağlık alanında hem de tarım
alanında ilerlemeler sağlanmaktadır. Ayrıca biyoloji bilimi ile evrim
süreci daha iyi analiz edilip organizmaların gelişme süreçleri ve
populasyonlar hakkında daha fazla bilgiye ulaşılmaktadır.
Moleküler belirteçlerin geliştirilmesinden önce morfolojik
belirteçlerin çevre şartlarından etkilenmesi yapılan ıslah
çalışmalarında yanıltıcı sonuçların ortaya çıkmasına neden olmuştur.
Fakat moleküler belirteçlerin geliştirilmesi, PZR’nin ortaya
çıkmasıyla artmış ve ıslah çalışmaları daha hızlı ve kesin bilgilerle

61
sonuçlanmıştır. Moleküler belirteçlerin geliştirilmesi en ideal belirteç
yönteminin ortaya konmasını amaçlamış ve bu bağlamda çok sayıda
moleküler belirteç geliştirilmiştir. Islah amacına göre, farklı belirteç
teknikleri kullanılmakta ve bu amaçla da gen piramitleri
oluşturulmakta, istenen özellikler moleküler ıslah teknikleri ile
seleksiyon yapılabilmekte, Populasyon yapısı anlaşılarak istenen
genetik varyasyonlar ortaya çıkarılabilmekte, türlerin ve çeşitlerin
tanısı teşhis edilebilmekte, yabani gen kaynaklarından istenen
özellikteki genlerin transferi daha hızlı şekilde yapılarak yeni
çeşitlerin geliştirilmesi hız kazanabilmektedir. Gelişen moleküler
belirteç teknolojisi ve MAS tekniği sayesinde bitki ıslahı çalışmaları
daha olumlu bir şekilde yürütülebilecek, klasik ıslaha oranla çok daha
hızlı bir zaman diliminde başarılı ve güvenilir sonuçların elde edilmesi
mümkün kılacaktır.

62
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
KAYNAKÇA
Akkaya, M. S., Bhagwat, A. A. and Cregan, P. B. (1992). Length polymorphisms of
simple sequence repeat DNA in soybean. Genetics, (132), 1131-1139.
Akopyanz, N., Bukanov, N. O., Westblom, T. U. and Berg, D. E. (1992) PCR-based
RFLP analysis of DNA sequence diversity in the gastric pathogen
Helicobacter pylori. Nucleic Acids Research, (20), 6221-6225.
Althoff, D. M., Gitzendanner, M. A., Segraves, K. A. (2007). The utility of
amplified fragment length polymorphisms in phylogenetics: a comparison of
homology within and between genomes. Systematic Biology, (56), 477-484.
Alzohairy, A. M., Gyulai, G., Ohm, H., Szabó, Z., Ragheb, S. M., Ajmal Ali, M.,
Elsawy, H. and Bahieldin, A. (2015). Plant DNA Barcoding and
Phylogenetics. Eds. M. Ajmal Ali, Gábor Gyulai and Fahad Al-Hemaid.
Lambert Academic Publishing, Germany. Nuclear and Organelle Specific
PCR Markers, Pages: 501-524.
Ashley, M. V. (2010). Plant Parentage, Pollination, and Dispersal: How DNA
Microsatellites have Altered the Landscape. Critical Reviews in Plant
Sciences, (29), 148-161.
Aydın, A. (2018). Türkiye'de Tescillenmiş Bazı Ticari Pamuk çeşitlerinin Moleküler
Karakterizasyonu Üzerine Bir Araştırma. Akdeniz Üniversitesi, Doktora
Tezi.
Azpilicueta, M. M., Gallo, L. A., van Zonneveld, M., Thomas, E., Moreno, C. and
Marchelli, P. (2013). Management of Nothofagus Genetic Resources:
Definition of Genetic Zones Based on a Combination of Nuclear and
Chloroplast Marker Data. Forest Ecology and Management, (302), 414-424.
Bagshaw, A. T. M. (2017). Functional Mechanisms of Microsatellite DNA in
Eukaryotic Genomes. Genome Biology and Evolution, (9), 2428-2443.
Baurens, P., Bonnot, F., Bienvenu, D., Causse, S., and Legavre, T. (2003). Using
SD-AFLP and MSAP to assess CCGG methylation in the banana genome.
Plant Molecular Biology Reporter, (21), 339–348.

63
Bebeli, P. J., Zhou, Z., Somers, D. J. and Gustafson, J. P. (1997). PCR primed with
mini satellite core sequences yields DNA fingerprinting probes in wheat.
Theoretical and Applied Genetics, (95), 276–283.
Beckmann, J. S. (1988). Oligonucleotide polymorphisms: A new tool for genomic
genetics. Bio/Technology, (6), 161–164.
Beckmann, J. S. and Soller, M. (1990). Toward a unified approach to genetic
mapping of eukaryotes based on sequence tagged micro satellite sites.
Bio/Technology, (8), 930–932.
Bentley, D. R. (2006). Whole-genome re-sequencing. Current Opinion in Genetics
& Development, (16), 545–552.
Bornet, B. & Branchard, M. (2001). Nonanchored inter-simple sequence repeat
(ISSR) markers: Reproducible and specific tools for genome fingerprinting.
Plant Molecular Biology Reporter, (19), 209–215.
Brow, M. A., Oldenburg, M. C., Lyamichev, V., Heisler, L. M., Lyamicheva, N.,
Hall, J. G., Eagan, N. J., Olive, D. M., Smith, L. M., Fors, L. and Dahlberg, J.
E. (1996). Differentiation of bacterial 16S rRNA genes and intergenic regions
and Mycobacterium tuberculosis katG genes by structure-specific
endonuclease cleavage. Journal of Clinical Microbiology, (34), 3129–3137.
Brown, A. H. D. (1979). Enzyme polymorphism in plant populations. Theoretical
Population Biology, (15), 1-42.
Caetano-Anollés, G., Bassam, B. J. and Gresshoff, P. M. (1993). Enhanced detection
of polymorphic DNA by multiple arbitrary amplicon profiling of
endonuclease-digested DNA: identification of markers tightly linked to the
super nodulation locus in soybean. Molecular Genetics and Genomics, (241),
57–64.
Casa, A. M., Brouwer, C., Nagel, A., Wang, L., Zhang, Q., Kresovich, S. and
Wessler, S. R. (2000). The MITE family Heartbreaker (Hbr): Molecular
markers in maize. Proceedings of the National Academy of Sciences, (97),
10083–10089.
Chang, R. Y., O'Donoughue, L. S. and Bureau, T. E. (2001). Inter-MITE
polymorphisms (IMP): a high throughput transposon-based genome mapping

64
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
and fingerprinting approach. Theoretical and Applied Genetics, (102), 773-
781.
Dufresnes, C., Brelsford, A., Beziers, P., Perrin, N. (2014). Stronger Transferability
but Lower Variability in Transcriptomic- than in Anonymous Microsatellites:
Evidence From Hylid Frogs. Molecular Ecology Resources, (14), 716-725.
Flavell, A. J., Knox, M. R., Pearce, S. R. and Ellis, T. H. N. (1998). Retro
transposon-based insertion polymorphisms (RBIP) for high throughput
marker analysis. The Plant Journal, (16), 643–650.
Fodor, A. A., Tickle, T. L. and Richardson, C. (2007). Towards the uniform
distribution of null P values on Affymetrix microarrays. Genome Biology,
(8), R69.
Fodor, S. P., Read, J. L., Pirrung, M. C., Stryer, L., Lu, A. T. and Solas, D. (1991).
Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science,
(251), 767–73.
Gemayel, R., Boeynaems, J. C. S. and Verstrepen, K. J. (2012) Beyond Junk-
Variable Tandem Repeats as Facilitators of Rapid Evolution of Regulatory
and Coding Sequences. Genes, (3), 461-480.
Glenn, T. C. (2011). Field guide to next-generation DNA sequencers. Molecular
Ecology Resources, (11), 759–769.
Gonzalez, A.A., Wong, A., Delgado-Salinas, R., Gepts, P. (2005). Assessment of
inter simple sequence repeat markers to differentiate sympatric wild and
domesticated populations of common bean. Crop Science, (45), 606-615.
Grodzicker, T., Williams, J., Sharp, P. and Sambrook, J. (1974). Physical mapping
of temperaturesensitive mutations of adenoviruses. Cold Spring Harbor
Symposia on Quantitative Biology, (39), 439–446.
Gu, W. K., Weeden, N. F., Yu, J. and Wallace, D. H. (1995). Large-scale, cost-
effective screening of PCR products in marker-assited selection applications.
Theoretical and Applied Genetics, (91), 465–470.
Guarino, L. (1999). Approaches to Measuring Genetic Erosion. In Proceedings of
the Technical Meeting on the Methodology of the FAO World Information

65
and Early Warning System on Plant Genetic Resources; Prague, Czech
Republic, June 21-23.
Hamrick, J. L., Godt, M. J. W. (1997). Allozyme diversity in cultivated crops. Crop
Science, (37), 26-30.
Hatada, I., Hayashizaki, Y., Hirotsune, S., Komatsubara, H. and Mukai, T. (1991). A
genome scanning method for higher organism using restriction sites as
landmarks. Proceedings of the National Academy of Sciences, (88), 397–400.
Hayden, E. C. (2012). Nanopore genome sequencer makes its debut. Technique
promises it will produce a human genome in 15 minutes. Nature,
doi:10.1038/nature.10051.
Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J. and Williams, P. M. (1996). Real time
quantitative PCR. Genome Research, (6), 986–993.
Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G. and Watson, R. (1993). Kinetic PCR
analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions.
Biotechnology, (11), 1026–1030.
Ince, A. G., Karaca, M., Uygur Göçer, E. and Aydin, A. (2017). Descriptive
Statistics and PIC Values of Genomic- and Trascriptomic-Microsatellites in
Several Plant Species. Jornal of Scientific and Engineering Research, (4),
236-246.
Jeffreys, A. J., Wilson, V. and Thein, S. L. (1985). Hyper variable mini satellite
regions in human DNA. Nature, (314), 67–73.
Jordan, S. A. and Humphries, P. (1994). Single nucleotide polymorphism in exon 2
of the BCP gene on 7q31-q35. Human Molecular Genetics, (3), 1915
Kalendar, R., Grob, T., Regina, M., Suoniemi, A. and Schulman, A. H. (1999).
IRAP and REMAP: two new retrotransposon-based DNA fingerprinting
techniques. Theor Appl Genet, (98), 704–711.
Klein-Lankhorst, R. M., Vermunt, A., Weide, R., Liharska, T. and Zabel, P. (1991).
Isolation of molecular markers for tomato (L. esculentum) using random
amplified polymorphic DNA (RAPD). Theoretical and Applied Genetics,
(83), 108–14.

66
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
Landegren, U., Kaiser, R., Sanders, J. and Hood, L. (1988). DNA diagnostics.
Molecular techniques and automation. Science, (241), 1077–1080.
Li, G. and Quiros, C. F. (2001). Sequence-relatedamplified polymorphism (SRAP),
a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to
mapping and gene tagging in Brassica. Theoretical and Applied Genetics,
(103), 455–461.
Litt, M. and Luty, J. A. (1989). A Hypervariable Microsatellite Revealed by In Vitro
Amplification of a Dinucleotide Repeat within the Cardiac Muscle Actin
Gene. The American Journal of Human Genetics, (44), 397-401.
Mansour, A., Omayma, M. I., Solliman, M. and EL-Din, M. (2008). Diversity
assessments among Mango (Mangifera indica L.) cultivars in Egypt using
ISSR and three-primer based RAPD fingerprints. The African Journal of
Plant Science and Biotechnology, (2), 87–92.
Morgante, M. and Vogel, J. (1994). Compound microsatellite primers for the
detection of genetic polymorphisms. U. S. Patent Appl., 08/326456.
Newton, C. R., Graham, A., Heptinstall, L. E., Powell, S. J., Summers, C.,
Kalsheker, N., Smith, J. C. and Markham, A. F. (1989). Analysis of any point
mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS).
Nucleic Acids Research, (17), 2503–2516.
Olsen, M., Hood, L., Cantor, C. and Botstein, D. (1989). A common language for
physical mapping of the human genome. Science, (245), 1434–1435.
Orita, M., Suzuki, Y., Sekiya, T. and Hayashi, K. (1989). Rapid and sensitive
detection of point mutations and DNA polymorphisms using polymerase
chain reaction. Genomics, (5), 874–879.
Paran, I. and Michelmore, R. W. (1993). Development of reliable PCR-based
markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theoretical and
Applied Genetics, (85), 985–993.
Pellionisz, A. J. (2008). The Principle of Recursive Genome Function. Cerebellum,
(7),348–359.
Pennisi, E. (2010). Semiconductors Inspire New Sequencing Technologies. Science,
(327), 1190.

67
Puskás, L. G. and Bottka, S. (1995). Reduction of mispriming in amplification
reactions with restricted PCR. Genome Research, (5), 309–11.
Reddy, M. P., Sarla, N. and Siddiq, A. (2002). Inter simple sequence repeat (ISSR)
polymorphism and its application in plant breeding. Euphytica, (128), 9–17.
Richard, I., and Beckman, J. S. (1995). How neutral are synonymous codon
mutations? Nature Genetics. (10), 259.
Rohde, W. (1996). Inverse sequence-tagged repeat (ISTR) analysis, a novel and
universal PCR-based technique for genome analysis in the plant and animal
kingdom. Journal of Genetics & Breeding, (50), 249–261.
Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. and Nyren, P. (1996).
Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.
Analytical Biochemistry, (242), 84–89.
Ronaghi, M., Nygren, M., Lundeberg, J. and Nyren, P. (1999). Analyses of
secondary structures in DNA by pyrosequencing. Analytical Biochemistry,
(267), 65–71.
Saiki, R. K., Bugawan, T. L., Horn, G. T., Mullis, K. B. and Erlich, H. A. (1986).
Analysis of enzymatically amplified beta-globin and HLA-DQ alpha DNA
with allele-specific oligonucleotide probes. Nature, (324), 163–166.
Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A. and
Arnheim, N. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic
sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science, (230), 1350–1354.
Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G, Smith, A. J. H. and Roe, B. A. (1980).
Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.
Journal of Molecular Biology, (143), 161–178.
Sobrino, B.; Briona, M.; Carracedoa, A. (2005). SNPs in forensic genetics: a review
on SNP typing methodologies. Forensic Science International. (154), 181-
194.
Southern, E. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments
separated by gel-electrophoresis. Journal of Molecular Biology, (98), 503.

68
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
Spooner, D., van Treuren, R., and de Vicente, M. C. (2005). Molecular Markers for
Genebank Management. Bioversity International: Rome, Italy.
Sunyaev, S., Hanke, J., Aydin, A., Wirkner, U., Zastrow, I., Reich, J., Bork, P.
(1999). Prediction of nonsynonymous single nucleotide polymorphisms in
human disease-associated genes. Journal of Molecular Medicine. (77), 754-
760.
Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X.,
Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K. and Surani, M. A. (2009).
mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods,
(6), 377–82.
Telenius, H., Carter N. P., Bebb, C. E., Nordenskjold, M., Ponder, B. J. and
Tunnacliffe, A. (1992). Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general
amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics, (13),
718–725.
Uitdewilligen, J. G., Wolters, A. M., D'hoop, B. B., Borm, T. J., Visser, R. G., and
van Eck, H. J. (2013). A next-generation sequencing method for genotyping-
by-sequencing of highly heterozygous autotetraploid potato. PLoS One, 8(5),
e62355.
van der Wurff, A. W. G., Chan, Y. L., van Straalen, N. M. and Schouten, J. (2000).
TE-AFLP: combining rapidity and robustness in DNA fingerprinting.
Nucleic Acids Research, (28), 105–109.
Varkonyi-Gasic, E. and Hellens, R. P. (2010). qRT-PCR of small RNAs. Methods
Journal of Molecular Biology, (631), 109–22.
Victoria, F. C., Maia, L. C. and Oliveira, A. C. (2011). In silico Comparative
Analysis of SSR Markers in Plants. BMC Plant Biology, doi:10.1186/1471-
2229-11-15.
Volis, S., Mendlinger, S., Turuspekov ,Y., Esnazarov, U., Abugalieva, S., Orlovsky,
N. (2001). Allozyme variation in Turkmenistan populations of wild barley
Hordeum Spontaneum. Koch. Annals. Botany, (87), 435-446.

69
Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., Van de Lee, T., Hornes, M., Frijters,
A., Peleman, J., Kuper. (1995). AFLP: A new technique for finger printing.
Nucleic Acids Research, (23), 4407–4414.
Wang, R., Mahalingan, G., and Knap, H. T. (1998). (C-A) and (GA) anchored
simple sequence repeats (ASSRs) generated polymorphism in soybean,
Glycine max (L.) Merr. Theoretical and Applied Genetics, (96), 1086–1096.
Waugh, R., McLean, K., Flavell, A. J., Pearce, S. R., Kumar, A., Thomas, B. T. and
Powell, W. (1997). Genetic distribution of BARE-1 retro transposable
elements in the barley genome revealed by sequence-specific amplification
polymorphisms (S-SAP). Molecular Genetics and Genomics, (253), 687–694.
Weining, S. and Langridge, P. (1991). Identification and mapping of polymorphisms
in cereals based on polymerase chain reaction. Theoretical and Applied
Genetics, (82), 209–216.
Welsh, J. and McClelland, M. (1990). Fingerprinting genomes using PCR with
arbitrary primers. Nucleic Acids Research, (18), 7213–7218.
Wenzl, P., Carling, J., Kudrna, D., Jaccoud, D., Huttner, E., Kleinhofs, A. and Kilian
A. (2004). Diversity Arrays Technology (DArT) for whole-genome profiling
of barley. Proceedings of the National Academy of Sciences, (101), 9915–
9920.
Williams, J. G. K., Kubelik, A. R., Livak, K. L., Rafalski, J. A. and Tingey, S. V.
(1990). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as
genetic markers. Nucleic Acids Research, (18), 6531–6535.
Ye, C., Yu, Z., Kong, F., Wu, S. and Wang B. (2005). R-ISSR as a new tool for
genomic fingerprinting, mapping, and gene tagging. Plant Molecular Biology
Reporter, (23), 167–177.
Ye, S., Humphries, S. and Green, F. (1992). Allele specific amplification by tetra-
primer PCR. Nucleic Acids Research, (20), 1152.
Yorgancilar, M., Yakisir, E., Tanur Erkoyuncu, M. (2015). Moleküler Markörlerin
Bitki Islahında Kullanımı. Journal of Bahri Dagdas Crop Research, 4 (2),1-
12.

70
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
Zietkiewicz, E., Rafalski, A. and Labuda, D. (1994). Genome finger-printing by
simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction
amplification. Genomics, (20), 176–183.

71
BÖLÜM 3
BİTKİ BİYOTEKNOLOJİSİNDE DOKU KÜLTÜRÜ
YÖNTEMLERİ
Uzm. Biyolog Yasemin KEMEÇ HÜRKAN
3
3
Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü,
Çanakkale, Türkiye. kemecyasemin@gmail.com

72
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ

73
GİRİŞ
Bitki biyoteknolojisi, tarımsal üretimde kayıpları önlemek, verim ve
kaliteyi arttırmak, bitki verimliliğini sınırlayan hastalık, zararlıları
engellemek, genetik kaynaklarımızı gen ve protein düzeyinde
tanımlamak, biyotik ve abiyotik stres koşularına karşı dayanıklılığın
arttırılmasını sağlamak amacıyla bitkileri, hayvanları ve
mikroorganizmaları modifiye etmek için genetik mühendisliği,
moleküler biyoloji, fizyoloji ve biyokimya gibi alanların
kullanılmasını sağlayan multidisipliner bir teknolojidir. Ayrıca klasik
ıslah yaklaşımların süresini kısaltmak ve başarısını artırmak amacıyla
üstün nitelikli bitki genotiplerinin etkin biçimde seçimine olanak
sağlamak, yerel bitki gen kaynaklarımızın belirlenmesini,
korunmasını, değerlendirilmesini ve karakterizasyonunu sağlamak,
gen aktarım çalışmaları ve bitki doku kültürü çalışmaları ile yeni nesil
bitkiler elde etmeye olanak sağlayan bir teknolojidir. Herbisit ve
pestisitlere dayanıklı, raf ömrü uzun, tarımsal ürünlerden yüksek
verim elde etmek için üstün özelliklerin seçilip yeni nesil bitkiler elde
etmek için kullanılan gen aktarım (bitki transformasyon) tekniklerinin
çoğunun ön koşulu bitki doku ve hücrelerinin steril besiyerinde
çoğaltılmasına imkan verecek olan doku kültürü yöntemlerinin
kullanılmasıdır (Gürel, 2016; Onay ve diğerleri, 2012).
Bitki doku kültürü steril koşullar altında (in vitro ortamda), yapay bir
besiyerinde, hücre, doku organ gibi bitki kısımlarından veya bütün bir
bitkiden yeni bir bitki veya bitkisel ürün elde etmeyi sağlayan bitki

74
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
biyoteknolojisinin önemli bir alanıdır. Bu sayede birçok bitki çeşidi
klonal olarak çoğaltılabilir, endemik ve tehlike altındaki türler
korunabilir, meristem kültürü ile hastalık ve virüsten ari bitkiler elde
edilebilir, somatik embriyolardan sentetik tohumlar üretilebilir,
bitkisel gen kaynakları korunabilir ve kallus-hücre süspansiyon
kültürlerinden sekonder metabolitler elde edilebilir (Babaoğlu ve
diğerleri, 2002; Gürel, 2016). Bütün bunların hepsi bitki hücrelerinin
totipotensi yeteneğine sahip olmalarından kaynaklıdır. Totipotensi,
farklılaşmış her bir bitki hücresinin rejenerasyonla, uygun büyüme
ortamı, ışık ve sıcaklık gibi çevre koşulları sağlandığında ana bitkiye
benzer tam bir bitki meydana getirme yeteneğidir (Babaoğlu ve
diğerleri, 2002; Onay ve diğerleri, 2012). Bu özellik bitki hücrelerini
hayvan hücrelerinden ayırır ve onu eşsiz kılar.
Bu bölümde;
 Bir doku kültürü laboratuvarı ve düzeni nasıl olmalı,
 Kullanılacak malzemelerin ve çalışılacak bitki parçasının
(eksplant) sterilizasyonu nasıl yapılmalı,
 Besiyerleri ve bitki büyüme düzenleyicilerin temel özellikleri
nelerdir,
 Kültür ortamı ve şartları nasıl olmalı,
 Kültür çeşitleri ve rejenerasyon sistemleri nelerdir bunlar
üzerinde durulacaktır.

75
1. DOKU KÜLTÜRÜ LABORATUVARI
Bir doku kültürü laboratuvarı diğer laboratuvarlardan bağımsız ve ayrı
bir yerde kurulmalıdır. Çünkü bir doku kültürü laboratuvarında en
önemli faktör aseptik şartların sağlanmasıdır. Laboratuvarın kurulumu
sırasında kullanılan malzemeler (yalıtım, pencereler, su tesisatı, klima
sistemi, elektrik tesisatı, dolaplar, bençler vb.) laboratuvar düzeni ve
şartlarına uygun bir şekilde seçilmelidir.
Genel olarak standart bir doku kültürü laboratuvarı aşağıdaki tesisleri
içermelidir;
1.1. Yıkama Odası
Yıkama odası çalışmalar sırasında kullanılan tüm cam malzemenin ve
kültür kaplarının yıkanması, distile su üretilmesi, besiyeri ve kültür
kaplarının sterilitasyonu için gereklidir. Yıkama odası büyük bir
yıkama lavabosu, su muslukları, asitlere ve bazlara dayanıklı boşaltma
sistemleri, raflar, çalışma tezgâhları ve distile su üretim cihazlarını
(Şekil 1) içermelidir. Yıkanmış malzemeleri kurutmak için sıcak hava
fırınlarının, bulaşık makinelerinin, asit banyoları ve pipet
yıkayıcılarının yıkama alanında bulunması gerekmektedir.

76
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
Şekil 1. Distile Su Üretim Cihazı
1.2. Hazırlık Odası
Laboratuvarın bu bölümü besiyeri hazırlanması için kullanılır.
Besiyeri hazırlanması için gerekli malzemeler ve cihazlar şunlardır:
 Çalışma tezgahı (benç),
 Sıcaklığa duyarlı kimyasalların ve stok çözeltisinin
depolanması için bir buzdolabı ve dondurucu,
 Sürekli saf su ihtiyacı için distile su cihazı,
 pH metre,
 Hassas terazi,
 Isıya dayanıklı maddeleri sterilize etmek için filtre
sterilizasyon üniteleri,
 Besiyerini steril etmek için otoklav,

77
 Besiyeri hazırlarken kullanılan kimyasalları çözmek için
manyetik karıştırıcı,
 İnorganik kimyasalları depolamak için steril bir raf veya
dolap,
 Besiyerini ve stok çözeltileri saklamak için borosilikat cam
şişeler ve besiyerini dağıtmak için kültür kapları-magentalar,
 Bir hava ve vakum pompası, ispirto ocağı veya gaz ocağı
(Şekil 2),
 Besiyerini hazırlamak için bir mikrodalga fırın,
Şekil 2. Sıra İle Ph Metre, Hassas Terazi, Otoklav Ve Borosilikat Cam Şişeler,
Kültür Kapları, İspirto Ocağı
Kültür ortamı hazırlarken, analitik saflıktaki kimyasallar kullanılmalı
ve çok hassas tartılmalıdır. Besiyerini hazırlarken kullanılan su en

78
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
yüksek saflıkta ve en yüksek kalitede olmalıdır. Musluk suyu uygun
değildir çünkü katyonlar (amonyum, kalsiyum, demir, magnezyum,
sodyum, klorürler, florürler, fosfatlar vb.), mikroorganizmalar (algler,
mantarlar, bakteriler), gazlar (oksijen, karbon dioksit, azot) ve partikül
maddeler (silt, yağlar, organik madde vb) içerebilir.
1.3. Ekim Odası
Bu oda ekimi yapılacak eksplantın besiyeri içeren kültür kaplarına
aktarıldığı steril odalardır. Herhangi bir kontaminasyondan kaçınmak
için hava akımını kontrol etmek gereklidir. Bunun için laminar hava
akışlı HEPA filtreli steril kabinlere ihtiyaç vardır (Şekil 3). Ekim
öncesi kabinin içi %70-95’lik etil alkol ile silinmeli ve çalışılacak
malzemeler kabine konulup ultraviyole ışıkla steril edilmelidir.
Şekil 3. Laminar Hava Akışlı HEPA Filtreli Steril Kabin

79
1.4. Kültür Odası
Kültürler büyüme odalarında veya bitki büyütme kabinlerinde
büyütülürler (Şekil 4). Kültürlerin iyi bir şekilde büyütülmeleri için
kültür odasının sıcaklığı, nemi ve ışığı kontrol altında tutulması
gerekmektedir. Bu çevresel faktörler, kültür sırasında veya dolaylı
olarak sonraki nesillerde tepki olarak büyüme ve farklılaşma sürecini
doğrudan etkilemektedir. Sıcaklık genel olarak 22-25 °C civarında
tutulur ve bunun için büyüme odaları çok iyi yalıtımlı olup sıcaklığı
sabit tutmak için klimalar kullanılmaktadır. Odanın bağıl nemi %50-
60 arasında olmalıdır. Kültür odasında kullanılan rafların her birine
25-50 µmol m-2 s-1 ışık şiddetine sahip beyaz floresan lambalar
kullanılmalıdır. Floresan lambalar kültür kapları ile arasında 40-50 cm
mesafe olacak şekilde yerleştirilmelidir. Sıcaklık sensörü ve ışık
zamanlayıcısı, kültür şartının gerektirdiği şekilde sırasıyla sıcaklığı ve
fotoperiyodu düzenlemek için kültür odasına yerleştirilir. Hem ışık
hem de sıcaklık, genel olarak 16 saat aydınlık ve 8 saat karanlık
kültürlerin inkübe edilmesi için 24 saatlik bir süre boyunca
programlanabilir olmalıdır. Kültürler magenta kapları, tüpler, petri
kapları, şişeler ve erlenler gibi değişik kültür kaplarına
ekilebilmektedir.

80
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
Şekil 4. Sırsı İle Bitki Büyütme Kabini Ve Bitki Büyütme Odası (Şahin, 2016)
1.5. Seralar
Çoğaltılmış kültürlerin iklimlendirilmesi (aklimatizasyon) için uygun
nem, ışık ve sıcaklığa sahip seralara ihtiyaç vardır. Kültürler dış
ortama karşı çok hassas oldukları için olası bir enfeksiyon,
kontaminasyon ya da başka bir problem için çevrenin buna uygun
olarak düzenlenmesi kültürlerin kaybını engellemek için son derece
önemlidir. Seranın, bitkilerin ihtiyaç duyduğu su ve uygun nemliliği
sağlamak için sisleme sistemi ya da buhar ve iyi bir sulama sistemi
için donanımlı olması gerekmektedir (Samal ve Rout, 2018; Gürel,
2016; Onay ve diğerleri, 2012).
2. STERİLİZASYON
2.1. Çalışma Ortamının ve Malzemelerin Sterilizasyonu
Steril bir çalışma alanı oluşturmak için öncelikle çalışılacak alan ve
kabin içi (laminar flow hood) en az 10-15 dakika önce %10’luk ticari
sodyum hipoklorit çözeltisi (%5 NaOCl) veya %70’lik etil alkol ile

81
silinir. Eğer kabinin ultraviyole lambası var ise çalışma öncesi
çalıştırılır.
Bisturi, pens vb. aletler kullanımdan önce etil alkole daldırılıp aleve
tutularak, yüksek sıcaklıkta ısıtılmış cam boncuklar (glass beads)
kullanılarak ya da alüminyum folyoya sarılıp otoklav içerisinde steril
edilir. Çalışılacak tüm malzemeler otoklavda (kültür kapları, erlenler,
beherler, cam şişeler, besiyerleri, fayanslar, petri kapları, tüpler vb.)
15 dakika boyunca 105 kPa basınçta 121 °C’de steril edilir. Ağzı açık
olan malzemeler (erlenler, beherler, tüpler), petri kapları ve fayanslar
alüminyum folyo ile kaplanarak otoklava konulur. Besiyerlerinin
hazırlandığı cam şişelerin ağızları otoklava konmadan önce gevşek
bırakılmalı çıkarıldıktan sonra hemen sıkılmalıdır. Besiyerine
eklenecek olan bitki büyüme düzenleyicileri, vitaminler ve sıcaklıktan
etkilenen diğer organik maddeler 0.22-0.45 µm poroziteye sahip steril
şırınga filtreler ile steril edilir. Çalışma ortamında mutlaka sürekli
ispirto ocağının açık olması gerekmektedir. Kültür kapları ve petri
kapları açıldıktan sonra boğaz ve ağız kısımları mutlaka aleve
tutulmalıdır. Bu işlem sayesinde kapların ağız kısmından gelebilecek
olası kontaminantların engellenmesi sağlanır. Ayrıca çalışma sonunda
kültür kaplarının ve petri kaplarının kenarları streç film ile sıkıca
sarılmalıdır. Bu işlem sayesinde dışarıdan gelebilecek kontaminasyon
kaynaklı patojenlerin içeri girmesi engellenir. Çalışma öncesinde
mutlaka temiz bir önlük giyilmeli, eller yıkanmalı, saçlar toplanarak
bone takılmalı, yüze maske takılmalı ve kabine girmeden önce eller
etil alkol ile steril edilmelidir. Böylelikle dışarıdan gelebilecek

82
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
bakteriyel ve fungal kontaminantlar engellenmiş olunur. Aksi taktirde
kabine giren ufacık bir kontaminasyon kaynağı bütün bir denemenin
kaybedilmesine neden olabilir.
2.2. Eksplantların Yüzeysel Sterilizasyonu
Yüzey sterilizasyonu doku kültürü işlemleri içerisinde en önemli
noktadır. Bitki materyallerinin yüzeylerinde faklı pşaral ve funguslar
bulunmaktadır. Bu bakteriler ve funguslar bitki materyalleri üzerinde
çoğalarak toksik ve öldürücü etkiye neden olurlar. Ortamda gelişen
bakteriler ve funguslar da bitkiler ile besin rekabetine girerler ve
bitkilerin ölmesine neden olurlar. Bütün bunlar tüm bir denemenin
yok olmasına neden olarak zaman ve emeğin boşa gitmesine neden
olur. Bunların olmaması için, doku kültürü çalışmaları için en ideal
eksplant kaynağı steril tohumdan elde edilmiş fidelerdir. Böylelikle bu
şekilde elde edilmiş fidelerin kullanılması ile sterilizasyon işlemine
ihtiyaç olmayacak ve eksplantlar sterilizasyon işleminin zararlı
etkilerinden korunmuş olacaklar. Aksi taktirde böyle bir imkan yok ise
dış koşullardan (tarla, sera vb.) alınan eksplantlar (tohum, yaprak,
sürgün, yumru, gövde vb.) kullanılır. Dış ortamdan alınan eksplant
öncelikle musluk suyu altında en az yarım saat yıkanmalıdır. Bir
deney için kullanılan dezenfektanlar kullanılacak eksplant tipine ve
bitki türüne göre değişiklik göstermektedir. Genellikle yüzey
sterilizasyonu için kullanılan dezenfektan türleri etil alkol, sodyum
hipoklorit, civa klorür, hidrojen peroksit ve gümüş nitrattır.
Sterilizasyon süresi ve kullanılacak dezenfektanın konsantrasyonu
kullanılacak eksplant tipine göre değişmektedir. Sterilizasyon

83
sırasında ortama yayıcı yapıştırıcı olarak 2 damla Tween-20
eklenebilir. Çok küçük tohumların sterilizasyonu filtre kağıdı
içerisinde yapılabilir. Bazı eksplant tipleri (yumru, gövde, kalın
kabuklu tohum vb.) endojen kontaminasyon etmenleri taşımaktadır.
Bunları yok etmek için eksplant tipine göre farklı süre ve
konsantrasyonda biyositler kullanılabilir (Gürel, 2016; Babaoğlu ve
diğerleri, 2002).
3. BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ ORTAMI
3.1. Temel Besiyeri
Doku kültürü çalışmalarında başarının sağlanması için en önemli
unsur çalışılacak eksplanta uygun besiyerinin seçimidir.
Besiyerlerinde bitkinin ihtiyaç duyduğu makro ve mikro elementler,
vitaminler, şekerler, bitki büyüme düzenleyicileri mevcuttur. Bunların
yanı sıra jel yapıcı maddeler, antibiyotikler, biyositler ve diğer
içerikler vardır.
Bitkiler büyüme ve gelişme için en az 17 besin maddesine ya da
elementine ihtiyaç duymaktadırlar. Bunlardan üç tanesi hidrojen (H),
oksijen (O) ve karbondur (C). Bitkiler diğer 14 tane zorunlu elementi
doğrudan topraktan aldıkları için besiyeri içerisinde bulunması
gerekmektedir. Bütün bu elementler her bitkinin ihtiyacına göre farklı
konsantrasyonlarda bulunur ve bitkinin yaşamını devam ettirebilmesi
için olması gereken, diğer elementler ile yeri doldurulamayan yani
yokluğunda bitkinin yaşamının tehlike altında olduğu olmazsa olmaz

84
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
elementlerdir. Bitkilerde büyüme, gelişme ve farklılaşma için son
derece önemli rollere sahiptirler.
MS besiyeri araştırmacılar tarafından en sık kullanılan kültür
ortamıdır. Murashige ve Skoog (1962) tarafından tütün için
geliştirilmiş tuz konsantrasyonu yüksek olan bir ortamdır. B5 besiyeri,
soya kallus kültürleri için geliştirilmiş nitrat azotu yüksek bir ortamdır
(Gamborg ve diğerleri, 1968). LS besiyeri, MS besiyerine benzerdir
(Linsmaier ve Skoog, 1965). MS besiyerinden farkı ise organik
bileşikler bakımından farklılık göstermesidir. WH besiyeri, domates
köklerinin kültürü için geliştirilmiş düşük tuz konsantrasyonlu bir
ortamdır (White, 1963). NN besiyeri anter kültürü için geliştirilmiştir
(Nitsch ve Nitsch, 1969). WPM besiyeri odunsu (ağaç) türlerin
kültüründe yaygın olarak kullanılmaktadır (McCown ve Lloyd, 1981).
DKW besiyeri nodal eksplantlardan sürgünlerin çoğaltımı için
geliştirilmiştir (Driver ve Kuniyuki, (1984); McGranahan, ve diğerleri,
(1987)). Knudson (Knudson, 1946) ve Orchimax besiyerleri orkide
doku kültürü için geliştirilmiştir. Piyasada bunun gibi pek çok kültür
ortamı mevcuttur. Bu yüzden kullanılacak besiyeri bitki ve eksplantın
türüne ve ayrıca ne üretmek istediğimize bağlı olarak deney
tasarımından önce belirlenmelidir (Babaoğlu ve diğerleri, 2002, Gürel,
2016; Gardiner ve Miller, 2008; White, 2006; Fageria, 2009; Rice,
2007).

85
3.1.1. Makro Elementler
Azot (N), fosfor (P), potasyum (K), kalsiyum (Ca), magnezyum (Mg)
ve kükürt (S) önemli makro elementlerdir. Bitkiler için önemli bazı
rollere sahiptirler. Onlardan bazıları şunlardır: Azot bitkilerin büyüme
hızını etkilemektedir. Nükleik asitlerin, proteinlerin, klorofilin, amino
asitlerin, alkaloitlerin ve bazı bitki hormonlarının moleküler yapısında
önemli bir elementtir (Samal ve Bout, 2018; Aktaş ve Ateş, 1998;
Boşgelmez vd., 2001; Güzel vd., 2004; Kacar ve Katkat, 2010).
Bitkilerde köklerin solunumunda, meyvelerin olgunlaşmasında,
çiçeklenmenin zamanında gerçekleşmesinde ve yeni hücrelerin
oluşumunda son derece önemlidir (Kantarcı, 2000; Fageria, 2009).
Azot eksikliğinde bitkilerde büyüme oranı düşer, vegetatif gelişimi
olumsuz etkiler ve yapraklarda klorozis görülür. Azot fazlalığı
bitkilerde vegetatif gelişme periyodunu uzatır, çiçeklenme zamanını
geciktirir, meyvenin geç olgunlaşmasına neden olur ve hastalıklara
karşı dayanıklılığı azaltır (Foth, 1984; Aktaş ve Ateş, 1998;
Boşgelmez vd., 2001; Güzel vd., 2004; Kacar ve Katkat, 2010).
Besiyerlerinde farklı formlarda bulunmaktadır (NH4+, NO3-), fakat en
fazla NO3- formda bulunur. Bitkiler ilk önce NH4+ formunda azotu
kullanır, daha sonra pH düşünce NO3- formunu kullanmaya başlar
(Babaoğlu ve diğerleri, 2002).
Fosfor, DNA ve ATP (Adenozin trifosfat) moleküllerinin bir parçası
olarak meristematik ve diğer hızlı gelişen dokularda bol miktarda
bulunur (Samal ve Bout, 2018). Fosfor, hücre bölünmesi, çiçek ve
meyve oluşumunda önemli rol oynar, bitkilerin olgunlaşmasını

86
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
hızlandırır, potasyumun bitkiler tarafından alınmasını sağlar, bitkinin
hastalık ve zararlılara karşı dayanıklılığını artırır ve bitki köklerinin
suyu almasını düzenler (Foth, 1984; Plaster, 1992; McCauley vd.,
2009; Aktaş ve Ateş, 1998; Boşgelmez vd., 2001). Fosfor eksikliği
bitkilerde büyümeyi yavaşlatır. Meyve ve ağaçlarda sürgün ve
tomurcuk oluşumu azalır, kök gelişimi zayıflar, hastalık ve don
olaylarında bitkinin dayanıklılığı azalır (Foth, 1984; Aktaş ve Ateş,
1998; Boşgelmez vd., 2001; Plaster, 1992).
Potasyum normal hücre bölünmesi için gereklidir ve meristematik
büyümeyi teşvik eder. Bitki protoplazmasının, yağlarının veya
karbonhidratlarının gerçek bir bileşeni olmamasına rağmen, bitkilerde
birçok reaksiyonda rol oynar (Samal ve Bout, 2018). Protein ve
nişasta oluşumu, enzim ve koenzim aktivasyonunda, fotosentez, şeker
transferinde rol oynarlar. Bitkinin su dengesini sağlamasında, kuraklık
ve don olaylarında dayanıklılığı arttırır (Brady, 1990; McCauley vd.,
2009; Kantarcı, 2000). Potasyum bitkilerin hastalıklara karşı
dayanıklılığını arttırır, kök sisteminin gelişimini sağlar, klorofil
oluşumunda rol oynar, stomaların açılıp kapanmasını sağlar (Brady,
1990; McCauley vd., 2009; Foth, 1984; Boşgelmez vd., 2001; Kacar
ve Katkat, 2010). Potasyum eksikliği yaprak oluşumunu olumsuz
etkiler, turgor basıncını düşürerek bitkide su kıtlığına sebep olur,
kuraklığa ve dona karşı bitkinin daha hassas olmasına sebep olur,
floem ve ksilem dokularının oluşumunun gerilemesine neden olur
(Aktaş ve Ateş, 1998; Boşgelmez vd., 2001).

87
Kalsiyum pektat formundaki kalsiyum, bitki hücre duvarlarının
ayrılmaz bir bileşenidir (Samal ve Bout, 2018). Bitkileri hastalık ve
zararlılara karşı korur ve protein oluşumunda, karbonhidratların
taşınmasında rol oynar (Boşgelmez vd., 2001; Kacar ve Katkat, 2010;
Plaster, 1992). Bitkilerde kalsiyum eksikliği yapraklarda nekrozlara
neden olur. Bitkinin gelişimini sağlayan meristem dokularının
gelişimini yavaşlatır, sürgün ve kök ucu büyüme ve gelişimini
olumsuz etkiler (Boşgelmez vd., 2001; Güzel vd., 2004; McCauley
vd., 2009). Fazla olması durumunda diğer besin elementlerini
bitkilerin yararlanamayacağı formlara dönüştürür (Aktaş ve Ateş,
1998; Boşgelmez vd., 2001).
Magnezyum klorofilin yapı taşıdır. Fotosentezde anahtar elementtir.
Protein sentezinde, ATP’nin yapımında, karbondioksit
asimilasyonunda ve enzimlerin aktivasyonunda rol almaktadır (Samal
ve Bout, 2018; Aktaş ve Ateş, 1998; Boşgelmez vd., 2001; Kacar ve
Katkat, 2010; McCauley vd., 2009). Magnezyum eksikliğinde
fotosentez geriler ve klorofil miktarı düşer. Yaşlı yapraklarda
damarlar arasında klorozis görülür (Aktaş ve Ateş, 1998; Kacar ve
Katkat, 2010; Samal ve Bout, 2018).
Kükürt bazı proteinlerin bileşiminde bulunmaktadır. Bazı enzimlerin
yapısında bulunmaktadır (Samal ve Bout, 2018). Kükürt kök
büyümesini ve nodül oluşumunu hızlandırır. Kükürt eksikliğinde
protein ve klorofil sentezi olumsuz etkilenir. Genç yapraklarda

88
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
klorozis görülür. Büyüme ve gelişme geriler, bitkiler bodur kalır ve
gövde ince bir hal alır.
Tablo 1. MS ortamında bulunan makro elementler (Babaoğlu ve diğerleri, 2002;
Samal ve Bout, 2018)
Makro Elementler
Mg/l
KNO3
NH4NO3
KH2PO4
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
1900
1650
170
370
440
3.1.2. Mikro Elementler
Makro elementlerin yanı sıra bitkiler için önemli olan bir diğer
element grubu mikro elementlerdir. Fakat bunlar bitkiler için makro
elementlere kıyasla daha az miktarlarda gereklidirler. Demir (Fe),
manganez (Mn), çinko (Zn), bor (B), bakır (Cu), molibden (Mo) ve
klor (Cl) önemli mikro elementlerdir (Babaoğlu ve diğerleri, 2002;
Gürel, 2016; Samal ve Bout, 2018).
Demir hücre bölünmesinde, solunum ve fotosentez reaksiyonlarında
önemli rollere sahiptir. Demirin bitki hücreleri tarafından daha iyi bir
şekilde kullanılması için şelatlanmış formda ortama ilave
edilmektedir. Demir EDTA ile şelatlandığında kültür ortamında daha
kararlı hale gelir ve bitkiler tarafından daha geniş bir pH aralığında
absorbe edilmektedir (Babaoğlu ve diğerleri, 2002; Gürel, 2016;
Samal ve Bout, 2018). Demir eksikliğinde klorofil üretimi azalır,

89
yapraklarda nekroz ve klorozis görülür. Bitkilerde büyüme ve gelişme
yavaşlar (Aktaş ve Ateş, 1998; Boşgelmez vd., 2001; Kacar ve Katkat,
2010).
Manganez kloroplast membranında önemli bir elementtir. Yaşamsal
öneme sahip enzimlerin aktivasyonunda, fotosentezde suyun
parçalanmasında, tohum çimlenmesinde ve meyve olgunlaşmasında
önemli bir role sahiptir. Bitkilerde manganez eksikliğinin en belirgin
semptomu yapraklarda klorozis oluşmasıdır (Samal ve Bout, 2018;
Aktaş ve Ateş, 1998; Boşgelmez vd., 2001; Kacar ve Katkat, 2010;
McCauley vd., 2009; Plaster, 1992).
Çinko oksin (indol-3-asetik asitin (IAA)) üretiminde olduğu gibi
klorofil oluşumunda da yer alan bir enzim aktivatörüdür (Samal ve
Bout, 2018). Çinko eksikliğinde enzim aktivitesinin azalmasına bağlı
olarak karbonhidrat, protein ve büyüme hormonları (oksin) da zarar
görür. Klorofil içeriğinin azlığından dolayı yaprak damarlarında
klorozis görülür. Sürgünler ölür ve yapraklar erken dökülür
(Boşgelmez vd., 2001; Kacar ve Katkat, 2010; Plaster, 1992).
Bor, şeker, su ve hormonların hareketinde rol oynadığı tahmin edilen
önemli bir iz elementtir. Hücre duvarlarının oluşumunu ve dokuların
yeniden çoğalmasını sağlamaktır. Karbonhidrat biyosentezi, nükleik
asit ve protein metabolizmaları üzerinde rol oynar. Bor eksikliğinde
yapraklarda klorozis görülür ve ayrıca yapraklar ve gövde gevrek,

90
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
kolay kırılır ve biçimsiz bir hal alır (Samal ve Bout, 2018; Boşgelmez
vd., 2001; McCauley vd., 2009; Plaster, 1992).
Bakır solunum ve protein sentezinde, klorofil üretiminde, çeşitli
oksidaz enzimlerin aktivasyonunda, protein ve karbonhidrat
metabolizmasında rol oynamaktadır. Bakır eksikliğinde bodur
gelişme, şekil bozukluğu, genç yapraklarda klorozis, geç olgunlaşma
ve mantar hastalıklarına karşı hassasiyet oluşur (Plaster, 1992; Aktaş
ve Ateş, 1998; Boşgelmez vd., 2001; McCauley vd., 2009; Kacar ve
Katkat, 2010).
Molibden protein sentezinde, enzim aktivitesinde ve baklagillerde azot
fiksasyonu için gerekli bir elementtir. Molibden eksikliğinde
baklagillerde bodur bir büyüme ve yapraklarda klorozis meydana gelir
(Samal ve Bout, 2018; Boşgelmez vd., 2001; Kacar ve Katkat, 2010;
McCauley vd., 2009).
Klor fotosentezde, turgor basıncında, ATP enzim aktivasyonunda,
stoma hareketlerinin düzenlenmesinde ve hücre çoğalmasında etkili
bir elementtir (Plaster, 1992; Boşgelmez vd., 2001; McCauley vd.,
2009; Kacar ve Katkat, 2010). Klor eksikliğinde klorozis görülür,
yaprak kenarları solar, transpirasyon etkilenir, bazı bitkilerde hücre
çoğalması geriler ve yaprakların büyümesinde yavaşlama meydana
gelir (Boşgelmez vd., 2001). MS ortamında bulunan mikro elementler
Tablo 2’de verilmiştir.

91
Tablo 2. MS ortamında bulunan mikro elementler (Babaoğlu ve diğerleri, 2002;
Samal ve Bout, 2018)
Mikro Elementler
Mg/l
MnSO4.7H2O
ZnSO4
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
22.3
8.6
6.2
0.83
0.25
0.025
0.025
FeSO4.7H2O
Na2EDTA.2H2O
27.8
37.3
3.1.3. Vitaminler ve Şekerler
Vitaminler enzim sistemlerinde katalitik fonksiyonlara sahiptir ve
sadece eser miktarda gereklidir. Thiamin (B1), nikotik asit (B3) ve
pridoksin (B6) en sık kullanılan vitaminlerdir. Myo-inositol, d-biotin
(H), riboflavin (B2), d-pantotenik asit (B5), askorbik asit (C), α-
tokoferol (E), retinol (A), folik asit (M) ve kolekalsiferol (D3)
besiyerine eklenen diğer vitaminlerdir. MS ortamına eklenen
vitaminler Tablo 3’de verilmiştir.

92
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
Tablo 3. MS ortamında bulunan vitaminler (Babaoğlu ve diğerleri, 2002; Samal ve
Bout, 2018)
Vitaminler
Mg/l
Myo-İnositol
Thiamin-HCl
Nikotinik asit
Pridoksin-HCl
Glisin
100.0
0.1
0.5
0.5
2.0
Bitkiler in vitro koşullarda henüz yeterince fotosentez
yapamadıklarından dolayı karbon ihtiyacını karşılamak için dışarıdan
karbon kaynağı olarak şeker ilave edilir. En sık kullanılan karbon
kaynağı sakkarozdur. Besiyerinde sıkça kullanılan diğer şekerler
glikoz, maltoz, rafinoz ve fruktozdur. MS ortamında, genellikle litre
başına 30 g sakkaroz karbon kaynağı olarak eklenir (Babaoğlu ve
diğerleri, 2002; Gürel, 2016; Samal ve Bout, 2018).
3.1.4. Jel Yapıcılar, Antibiyotikler ve Biyositler
Jel yapıcılar besiyerini yarı katı hale getiren bileşiklerdir. Bunlar
genellikle kırmızı deniz alglerinden elde edilirler. En sık kullanılanları
agar, agaroz, PhytagelTM ve ya GelriteTM, Sea-Kem agaroz, silikajel,
aljinat, nişasta ve jelatindir.
Kullanılan eksplantın türüne göre kontaminasyonu engellemek amacı
ile karbenisilin, eritromisin, genetisin, sefotaksim, kanamisin,
higromsin, gentamisin ve streptomisin gibi antibiyotikler besiyerine

93
eklenebilmektedir. Besiyerinin kontaminasyonunu engellemek amacı
ile en sık kullanılan biyosit PPM (bitki koruma solüsyonu)’dir
(Babaoğlu ve diğerleri, 2002; Gürel, 2016).
3.1.5. Besiyerine Eklenen Diğer Maddeler
Doku kültürü ortamına kimyasal olarak tanımlanamayan birçok destek
maddesi eklenmektedir. Bunlardan bazıları farklı konsantrasyonlarda
bir amino asit, peptid, yağ asidi, karbonhidrat, vitamin ve bitki
yetiştirme maddesi kaynağı olarak günümüzde hala yaygın olarak
kullanılmaktadır. Bitki doku kültürünün ilk başarılı kültürü maya
ekstraktı ile yapılmıştır. Kültür ortamına eklenen diğer ilaveler
şunlardır:
 Et, malt ve maya ekstraktı ve fibrin özütü,
 Muz, ananas, domates de dahil olmak üzere çeşitli
meyvelerden meyve suları, meyve ekstraktları,
 Olgunlaşmamış zigotik embriyoları besleyen sıvılar,
 Fide veya bitki yapraklarının özleri,
 Haşlanmış patates özü ve mısır maserasyon sıvısı,
 Bitki özsuyu, kök veya rizomların ekstraktları. Bitki
köklerinin bitkilerde sitokinin sentezinin ana bölgesi olduğu
düşünülmektedir.
 Protein (genellikle kazein) hidrolizatları (Robbins, 1922;
White, 1934; Steward ve Shantz, 1959; Rangaswamy, 1963;
Guha ve Maheshwari, 1964; La Rue, 1949; Saalbach ve
Koblitz, 1978; Borkird ve Sink, 1983; Fox ve Miller, 1959).

94
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
3.1.6. Bitki Büyüme Düzenleyicileri
Bitki büyüme düzenleyicileri bitkiler tarafından üretilen, bitkilerin
çeşitli bölgelerine taşınarak orada büyüme ve gelişmeyi sağlayan ve
çok düşük konsantrasyonlarda bile etkili olan organik maddelerdir.
Doku kültürü ortamında kallus elde etmek, sürgünlerden kök üretmek
için kültür ortamına eklenmeleri gerekmektedir. En sık kullanılan bitki
büyüme düzenleyicileri oksin, sitokinin, gibberellin, absisik asittir ve
jasmonik asit (Babaoğlu ve diğerleri, 2002; Gürel, 2016). Ayrıca son
yıllarda keşfedilen, strigolakton ve karrikin de doku kültürü
ortamlarında kullanılan bitki büyüme düzenleyicileridir.
Oksinler bitkilerde; hücre gelişiminde ve farklılaşmasında,
fotoperyodizmde, kök oluşumu ve lateral kök gelişiminde, yan
sürgünlerin gelişiminin engellenmesinde, yaşlanmanın (senesens)
geciktirilmesinde yaprak ve meyve dökülmesinin engellenmesinde ve
apikal dominansta rol oynamaktadırlar. Ayrıca etilen fitohormonunun
üretimini de uyarırlar. Doku kültürü ortamında oksinlerin tek başına
kullanımı köklenmeyi, kallus uyarımını, somatik embriyo oluşumunun
uyarımını ve hücre süspansiyonlarının elde edilmesini teşvik ederler.
Sitokininler ile birlikte ise kallus oluşumunda, somatik embriyo
oluşumunun uyarımında ve sürgün rejenerasyonunda rol alırlar. El
edilen sürgünlerin köklendirilmesinde sık olarak kullanılan bir
fitohormondur. Doğal oksin, indol-3-asetik asittir (IAA), sentetik
oksinler ise, naftalen asetik asit (NAA), indol bütirik asit (IBA), 2,4-
diklorofenoksiasetik asit (2,4-D) (Babaoğlu ve diğerleri, 2002; Gürel,
2016; Eyidoğan ve Ekmekçi, 2016; Ünsal, 1993; Baktır, 2010).

95
Sitokininler bitkilerde; hücre bölünmesini, sürgün büyümesini,
yeniden farklılaşmayı, rejenerasyonu ve yaşlanmayı geciktirmeyi
teşvik eder. Doku kültürü ortamında sürgün gelişimini teşvik ederler,
kültür ortamına oksin ile birlikte eşit konsantrasyonda eklenirse kallus
oluşumunu teşvik ederler. Doğal sitokininler zeatin, dihidrozeatin,
izopentenil adenin (2İP) ve dimetilaliladenin’dir. Sentetik sitokininler
ise kinetin (N6 furfurilamino purin), benziladenin (BA) ve
tetrahidropiranilbenzil adenin (PBA)’dir. Uygulamalarda en sık
kullanılan sitokinin benziladenin’dir. Son yıllarda keşfedilen
thidiazuron da (TDZ) bitki rejenerasyonunda oldukça başarılı sonuçlar
vermektedir (Babaoğlu ve diğerleri, 2002; Gürel, 2016; Ünsal, 1993).
Gibberellinler bitkilerde; hücre uzamasında, bodurluğun ortadan
kaldırılmasında, partenokarpik meyve tutumunda, çimlenmeyi teşvik
etmede, tohum ve tomurcuk dormansisinin kırılmasında, soğuklama
ihtiyacının (vernelizasyon) giderilmesinde oldukça yaygın kullanıma
sahiptir. Ayrıca embriyo ve ovül kültüründe, meristemlerde bitki
rejenerasyonunda, organogenesisi ve adventif kök oluşumunu
engellemede ve kallus gelişiminde kullanıma sahiptir. En sık
kullanılan gibberellin GA3’tür (Babaoğlu ve diğerleri, 2002; Tyler ve
diğerleri, 2004; Olszewski ve diğerleri, 2002).
Absisik asitler bitkilerde; tohumlarda dormansiyi ve tohum depo
proteinlerini uyarmaktadır, stomaların kapanmasını teşvik eder ve
gövde büyümesini inhibe eder. Kuraklık ve diğer stres faktörlerinde
rol alır. Gibberellik asit ile antogonist çalışır. Absisik asitin doku

96
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
kültüründeki rolü tam olarak anlaşılamamış olmasına rağmen somatik
embriyoların olgunlaşmasında kullanılmaktadır. Kültür ortamına
absisik asit ilavesinin anormal embriyo gelişimini engellediği
belirtilmektedir. En sık kullanılan absisik asit ABA’dır (Babaoğlu ve
diğerleri, 2002).
Jasmonik asitler bitkilerde; kök oluşumunu teşvik eder, etilen
biyosentezini etkileyerek meyve olgunlaşmasını teşvik eder, hastalık
ve zararlılara karşı dayanıklılığı arttırır, dormant durumdaki
tohumların dormansisini kırarak çimlenmeyi teşvik eder, dışarıdan
uygulandığında kök büyümesini, tohum çimlenmesi, klorofil
üretimini, kallus oluşumunu ve polen taneciklerinin çimlenmesini
engeller. Gaz halinde patates bitkisine püskürtülmesi halinde ya da
doku kültürü ortamında yumru oluşumunu (tuberizasyon) teşvik
etmektedir (Yıldız ve Yılmaz, 2001; Fan ve diğerleri, 1997; Koda ve
diğerleri, 1991).
Strigolaktonlar (SL) ilk kez pamuk bitkisinin köklerinden (Gossypium
hirsutum) izole edilmiştir ve parazitik bitki olan Striga lutea
tohumlarının çimlenmesini uyarma kabiliyetine bağlı olarak strigol
olarak adlandırılmıştır. Strigolaktonlar metillenmiş butenolid (D-
halkası) ve bir enol eter kısmından oluşmaktadır. Strigolaktonun
bitkiler üzerindeki görevleri arasında, Striga spp. ve Orobanche spp.
gibi parazitik bitkilerin çimlenmesini teşvik eder, angiospermlerde yan
köklerin ve kök tüylerinin gelişiminde ve sürgün dallanmasında
(aksiller tomurcuk büyümesi) rol oynadığı bilinmektedir. Ayrıca,

97
köklerden sentezlenen SL'ler, arbusküler mikorhizal (AM)
mantarlarının hif oluşumunu indükleyerek mantar ve konakçı
arasındaki teması kolaylaştırdığı gösterilmiştir. Birçok çalışmada
strigolaktonun, bitkinin besin, kuraklık ve tuz stresine karşı
adaptasyonunda önemli bir role sahip olduğu ortaya konmuştur. En
çok kullanılan strigolakton GR24’tür (Van der Berg ve Ewing, 1991;
Cook ve diğerleri, 1966; De Cuyper ve diğerleri, 2017).
Bazı bitki fizyologlarına göre Akdeniz biyomunda bazı bitki türlerinin
tohumlarının çimlenmesi için yangın gereklidir. Araştırmacılar
duman içindeki bazı kimyasalların bu tohumları çimlendirdiğini
düşünmüşlerdir. Bitki kaynaklı dumanın tohum çimlenmesini
uyardığını ilk bildiren De Lange ve Boucher (1990) olmuştur.
Baldwin vd. (1994) çalışmalarında GC-MS ve atomik absorbsiyon
(AA) spektrofotometresi kullanarak dumanın aktif olan kısmında 71
tane bileşik tanımlamışlardır. Aynı çalışmada ayrıca yanmış
selülozdan elde edilen duman ile çimlenme aktivitesinin
sağlanabileceği belirtilmiştir. Flematti vd., (2004), duman içindeki bu
kimyasalı keşfetmişler ve karrikin olarak adlandırmışlardır. Yani
karrikinler; yanan bitkisel materyallerin (şeker ve selüloz da dahil
olmak üzere karbonhidratların ısıtılması veya yakılmasıyla oluşur)
dumanında bulunan bir grup bitki büyüme düzenleyicisidir. Yapılan
çalışmalar sonucunda dumanın içerisinde nitrojen oksitlerin ve
siyanohidrinlerin tohum çimlenmesini uyardığı bildirilmiştir, fakat
Van Staden vd., (2004)’nın yapmış olduğu bir çalışma sonucunda
dumanın içeriğinde var olan butenolid ailesinden olan karrikinlerin de

98
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
çimlenmeyi uyardığı bulunmuştur. Karrikin sadece C, H ve O içeren
bir piran halkasına kaynaştırılmış bir butenolit (3-metil-2H-furo [2,3-
c] piran-2-one) olarak bilinen spesifik bir lakton tipidir. Bu
özelliğinden dolayı strigolaktonlar ile ilişkilendirilmektedir. Bu
zamana kadar altı tane karrikin keşfedilmiştir. Bunlar; KAR1, KAR2,
KAR3, KAR4, KAR5 ve KAR6 olarak adlandırılmıştır, ancak KAR1
en aktif olandır. Karrikinler dormansiyi kırarak dormant durumda
bulunan tohumun çimlenmesini teşvik eder. Bitki materyalinden elde
edilen dumanın (smoke water), Arabidopsis dahil olmak üzere 80
farklı cinsten 1200 bitki türünün tohum çimlenmesini olumlu yönde
etkilediği çalışmalar sonucunda gösterilmiştir. Strigolaktonlar gibi
Striga ve Orobanche gibi parazitik bitkilerin çimlenmesini uyarır, yan
köklerin gelişimini ve sürgün gelişimini kontrol eder, fide uzunluğunu
arttırır ve çeşitli stres (oksidatif stres, kuraklık, düşük ışık
yoğunlukları, yüksek sıcaklık, tuzluluk, düşük ozmotik potansiye vb.)
durumlarında bitki adaptasyonunu (De Cuyper ve diğerleri, 2017;
Nelson ve diğerleri, 2012; Flematti ve diğerleri, 2015; Flematti ve
diğerleri, 2011; Chiwocha ve diğerleri, 2009; George ve diğerleri,
2008).
4. DOKU KÜLTÜRÜ YÖNTEMİ İLE BİTKİLERİN
ÇOĞALTIM AŞAMALARI
4.1. Besiyeri Hazırlama
Besiyerleri çoğunlukla pek çok firmada hazır olarak satılmaktadır ve
hazırlama protokolü üzerlerinde mevcuttur. Fakat çalışmak için temel
bir MS besiyeri hazırlamak istiyorsak kullanılacak olan makro ve

99
mikro elementlerin ve vitaminlerin stok solüsyonlarının hazırlanması
gerekmektedir.
4.1.1. MS Besiyeri İçin Stok Solüsyon Hazırlama
4.1.1.1. MS Makro Element (MS-I, 20X) Stok
Solüsyonu
MS-I stok solüsyon elde etmek için Tablo 4’teki elementler karıştırılır.
Tüm makro elementler tarif edildiği gibi karıştırılır ve çözelti 2000
ml’ye tamamlanır ve kullanılana kadar 4 °C’de saklanır. Bu stok
solüsyondan 20 litre MS besiyeri elde edilebilmektedir. 1 litre MS
besiyeri hazırlamak için 100 ml stok kullanılmalıdır.
Tablo 4. MS makro element (MS-I) stok solüsyonu (Samal ve Bout, 2018)
Makro Elementler
g/ml
Çözgen Madde
KNO3
NH4NO3
MgSO4
KH2PO4
38.0 g
33.0 g
7.4 g
3.4 g
Yaklaşık 1000 ml
distile su içerisinde
çözülmektedir.
CaCl2.2H2O
8.82 g
Yaklaşık 500 ml
distile su içerisinde
çözülmektedir.

100
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
4.1.1.2. MS Mikro Element (MS-II, 100X) Stok
Solüsyonu
FeSO4.7H2O ve Na2EDTA.2H2O dışındaki tüm mikro besinler, MS-II
stoğunu hazırlamak için birlikte çözülür. 100 litre MS besiyeri için
MS-II stoğu Tablo 5’deki gibi hazırlanır. 1 litre MS besiyeri
hazırlamak için 10 ml stok kullanılmalıdır.
Tablo 5. MS mikro element (MS-II) stok solüsyonu (Samal ve Bout, 2018)
Mikro Elementler
g/ml ve mg/ml
Çözgen Madde
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
2.23 g
860 mg
620 mg
83 mg
25 mg
2.5 mg
2.5 mg
Tüm kimyasallar
1000 ml distile su
içerisinde çözdürülür
ve kullanılana kadar 4
°C’de saklanır.
4.1.1.3. MS Demir (MS-III, 20X) Stok Solüsyonu
100 litre MS besiyeri için MS-III stoğu Tablo 6’deki gibi hazırlanır.
Na2EDTA çözeltisine FeSO4 çözeltisini ekleyin ve kuvvetlice
karıştırın. Hacmi 200 ml distile su ile tamamlayın. Stoku 4 °C'de
pyrex şişelere koyarak ya da alüminyum folyo ya sararak saklayın. 1
litre MS besiyeri hazırlamak için bu stoktan 10 ml kullanılmalıdır.

101
Tablo 6. MS demir (MS-III, 20X) stok solüsyonu (Samal ve Bout, 2018)
Demir Elementi
mg/ml
Çözgen Madde
Na2EDTA.2H2O
FeSO4.7H2O
746 mg
556 mg
İkisinide 80 ml
distile suda çözülür.
4.1.1.4. MS vitamin (MS-IV, 100X) stok solüsyonu
100 litre MS besiyeri için vitamin stok solüsyon miktarı Tablo 7’de
verilmiştir. 1 litre MS besiyeri hazırlamak için bu stoktan 10 ml
kullanılmalıdır.
Tablo 7. MS vitamin (MS-IV, 100X) stok solüsyonu (Samal ve Bout, 2018)
Vitamin
g/ml ve mg/ml
Çözgen Madde
Myo-inositol
Thiamine
Nicotinic acid
Pyridoxine HCl
Glycine
10.0 g
10.0 mg
50.0 mg
50.0 mg
200.0 mg
Kimyasal 1000 ml
distile su içerisinde
çözülür ve kullanılana
kadar 4 °C’de
saklanır.
1 litre MS besiyeri hazırlamak için tüm stok solüsyonlar (MS-I, MS-
II, MS-III ve MS-IV) belirtilen miktarda eklenir ve karıştırılır. Karbon
kaynağı eklenir (sakaroz, glikoz, maltoz, rafinoz ve früktoz vb.) ve
yapılan çalışmaya göre içerisine oksin, sitokinin ya da başka bir bitki
büyüme düzenleyicisi eklenir ve pH 5,2-5,8’e ayarlanır. En son ortamı
yarı katı hale getirmek için agar eklenir ve agar eriyene kadar

102
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
karıştırılır. Hazırlanan ortam 15 dakika boyunca 105 kPa basınçta 121
°C’de otoklavda steril edilir.
4.2. Eksplant Seçimi ve Sterilizasyon
Eksplant doku kültüründe çalışılacak olan bitki parçasıdır. Eksplant
olarak, meristem, sürgün ucu, kök parçası, nodyum, tomurcuk, çiçek
ya da çiçek sapı, anter, gövde, yaprak ya da yaprak sapı, tohum,
embriyo, hipokotil, yumru, tek bir hücre ya da protoplast
kullanılabilmektedir. Çalışmanın amacına göre eksplant türleri Tablo
8’de verilmiştir.
Tablo 8. Kültür tipi ve kullanılacak eksplant (Samal ve Bout, 2018)
Kültür Tipi
Kullanılacak Eksplant
Kallus kültürü
Hücre kültürü
Yaprak, anter, kök ve yumru
parçaları, yaprak sapı,
Meristem kültürü
Apikal ve aksiller (koltuk altı)
tomurcuklar
Protoplast kültürü
Kallus/hücre kültürleri, yapraklar
Mikroçoğaltım
Meristemlerden, sürgünlerden ve
apikal tomurcuklardan kesilen
nodyumlar
Germplazm muhafazası
Virüs ve bakteriden ari bitki
kısımları
Organogenez
Yaprak, kök ve yumru parçaları,
protoplast ve kallus
Embriyo kültürü
Olgun veya olgunlaşmamış
tohumlar
Anter kültürü
Anter veya polen taneleri

103
Doku kültürü için hastalıksız bitkilerin kullanılması çok önemlidir.
Bunun için bitkilerin laboratuvar ortamında büyütülmesi daha sağlıklı
sonuçlar verir. Arazi ortamından alınacaksa da 2 hafta ile 6 ay
arasında laboratuvar ortamında kontrollü koşullar altında özel bakım
yapılır ve bitkiler mümkün olduğunca sağlıklı hale getirilir. Doku
kültüründe en önemli işlem bitkileri mantarlardan ve bakterilerden
arındırmaktır. Bunun için kullanılacak eksplantın türüne göre en iyi
sterilizasyon yöntemi seçilmelidir. Eksplantları sterilize etmek için
çeşitli sterilize edici ajanlar / kimyasallar kullanılır, sterilize edici ajan
bitki dokusu için toksiktir, bu nedenle eksplant hasarını en aza
indirgemek için uygun sterilize edici ajan konsantrasyonu ve işlem
süresini standartlaştırmak gerekmektedir. Sterilizasyon ön işlemi için
eksplant akan bir suyun altında yıkanır, yaklaşık %75 etanol içerisinde
40 saniye kadar bekletilir ve birkaç damla Tween-20 ile temizlenerek
durulanır. Bu aşamadan sonra kullanılacak eksplantlar (Kalsiyum ve
sodyum hipoklorit, Hidrojen peroksit, Bromür su, Gümüş nitrat, Civa
klorür) farklı konsantrasyon ve sürede çeşitli kimyasal ajanlar ile
muamele edilir. Sterilizasyon ajanı muamelesinden sonra eksplantlar
yapışan toksik ajanları çıkarmak için steril distile suyla 4-5 kez yıkanır
(Samal ve Bout, 2018).
4.3. Eksplantların Kültür Ortamına Ekimi
Eksplantlar kültür ortamına ekilmeden önce ekim işleminin yapılacağı
odanın sterilizasyonundan emin olmak gerekmektedir. İlk işlem olarak
odanın ve çalışılacak malzemelerin sterilizasyonu yapılmaktadır.
Ekim işlemi laminar hava akışlı HEPA filtreli steril kabin içerisinde

104
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
gerçekleştirilir. Pensler, bisturiler, makaslar ve özelerin %70-95’lik
alkole daldırılıp ekim işleminden önce aleve tutularak steril edilmesi
sağlanmalıdır. Ekim işleminden sonra kullanılan kültür kaplarının
(magenta, petri kabı, cam şişeler vb.) etrafı sıkıca streç film ile
kaplanmalı ve kültür tüplerine pamuk tıkaçlar yerleştirilmelidir. Ekim
işleminden sonra eksplantlar özel kültür odalarına ya da bitki büyütme
kabinlerinde muhafaza edilir. Çalışılan deney gruplarını
kontaminasyon var mı yok mu diye düzenli aralıklarla kontrol etmek
gerekmektedir. Ekimden yaklaşık bir hafta sonra eğer kontaminasyon
var ise bakteri ve mantar kolonileri oluşmaya başlar. Steril olmayan
kültür kapları alınarak bakteri ve mantarlar otoklavda öldürülmelidir.
Kullanılan eksplant türüne ve deneyin özelliklerine göre kültüre alınan
örnekler düzenli aralıklarla (bir hafta ile bir ay arasındaki bir
periyotta) taze besiyerlerine (altkültür işlemi) aktarılmaları
gerekmektedir. Eğer altkültür yapılmazsa kültür kaplarındaki dokular
hem azalan besin kaynağı bakımından rekabete girerler, hem de kültür
kabının içerisinde gereğinden fazla kalabalık olmaya başlarlar (Samal
ve Bout, 2018).
4.4. Dış Ortama Alıştırma (aklimatizasyon)
Steril koşullarda, yüksek nem içeren ve tüm besin maddelerinin
bulunduğu bir ortamda gelişen bitkileri, daha düşük nem içeren ve
steril olmayan bir ortama aktarmak çok dikkat isteyen ve kademeli
olarak yapılması gereken bir işlemdir. Öncelikle bitkiler kültür
kaplarından çıkarılır ve agarlı besiyerinin uzaklaşması için çok
dikkatli bir şekilde yıkanmalıdır. Yüksek nem (%100) içeren sisleme

105
sistemine sahip seralardaki steril topraklara ekimi gerçekleştirilir.
Ayrıca su kaybını minimize etmek için üzerleri kaplanmalıdır.
Herhangi bir kontaminasyona karşı tüm önlemler alınmalıdır. Aksi
takdirde alıştırma süreci uygun bir şekilde tamamlanmaz ya da
herhangi bir nedenden dolayı kontaminasyon gerçekleşirse çalışma
tüm bitkilerin kaybı ile sonuçlanabilir. Bu nedenle aklimatizasyon
doku kültüründe çok önemli bir aşamadır (Samal ve Bout, 2018;
Gürel, 2016).
5. Kültür Tipleri
5.1. Kallus Kültürü
Kallus, bitkiden bir parça (yaprak, kök, gövde vb.) kesilip alınarak
içerisinde bitki büyüme düzenleyicileri (oksin-sitokinin) içeren steril
edilmiş yarı katı besiyerinde büyütülmesi sonucu oluşan
farklılaşmamış hücre kütlesidir. Oksin ve sitokinin bitki büyüme
düzenleyicileri genellikle kallus hücrelerinin sürekli olarak
çoğalmasını ve kallus formunda kalmasını sağlayabilir ya da farklı
konsantrasyonlarda kullanımı kallus dokusunu organogenez ve
somatik embriyogenez oluşumuna yönlendirebilir. Kallus kültürleri
organogenez, bitki rejenerasyonu, somatik embriyogenez ve hücre
süspansiyon kültürlerinin başlangıç noktasını teşkil etmektedir. Ayrıca
kallus hücreleri somaklonal varyasyonların da oluşmasını teşvik
edebilmektedir. Kallus kültürlerinin stabil bir şekilde çoğalmaları ve
büyümeleri için belirli aralıklar ile altkültürleme yapılması çok
önemlidir (Babaoğlu ve diğerleri, 2002; Gürel, 2016; George ve
diğerleri, 2008).

106
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
5.1.1. Somaklonal Varyasyon
Doku kültürü çalışmalarında kullanılan bitki hücreleri in vitro koşullar
altında büyümeleri süresinde bazı genetik ya da hücre ve doku
düzeyinde bazı değişiklikler geçirirler. Bu değişikliklerin bazıları
kültüre alınan eksplantlardaki anormal hücrelerden kaynaklanırken,
bazıları ise kültür ortamında meydana gelen değişikliklerden (bitki
büyüme düzeneyicilerinden oksin ve sitokininin konsantrasyonu,
kültür ortamının bileşimi, kültür koşulları, kültür süresi vb.)
kaynaklanmaktadır. Bunların dışındaki bazı değişiklikler kalıtsal
değildir yani sonraki nesillere aktarılmaz bunlar epigenetik
değişimlerdir. Epigenetik değişikliklerin aksine belli bir genetik
değişikliğin veya mutasyonun sonucunda ortaya çıkan (DNA
metilasyonu, nükleik asit öncüllerinin kaybı, in vitro hücre
bölünmesindeki anormallikler vb.) ve sonraki nesillere aktarılan bu
değişikliklere somaklonal varyasyon denir. Somaklonal varyasyonun
hem iyi hem de kötü yanları vardır. Somaklonal varyasyonun klonal
çoğaltım olarak ifade edilen mikroçoğaltım tekniğinde meydana
gelmesi sonucunda aynı genetik yapıdaki bitkileri üretmek pek
mümkün olmayabilir. Bu yüzden mikroçoğaltım tekniğinde
varyasyonların gerçekleşmemesi için en güvenilir doku kültürü
tekniklerinin kullanılması büyük önem taşımaktadır. Ama bazı
durumlarda mikroçoğaltımda meydana gelen bu istenmeyen fenotipik
ve genotipik değişiklikler bitki ıslahında büyük önem taşımaktadır. Bu
değişiklikler sayesinde doğal varyasyonun daraldığı veya varyasyon
meydana getirmenin zor olduğu durumlarda yeni hücre hatlarının
gelişimi için istenen özelliklere sahip somaklonal varyantların

107
meydana getirilmesi mümkün olmaktadır. Bu genetik olarak farklı
bitkiler kallus dokusundan ya da sürgün tabanında şekillenen kallus
dokusundaki yarı düzenli kültürlerden meydana gelebilir. Bu
varyasyonlar sayesinde bitki ıslahında büyük adımlar atılmıştır ve
hastalıklara, soğuğa, tuzluluğa ve donmaya toleranslı hücre hatları
kallus dokuları kullanılarak elde edilmiştir. Ayrıca fungal toksinlere,
herbisitlere ve tuza dayanıklı hücre hatları in vitro seleksiyon yöntemi
kullanılarak elde edilmiştir (Babaoğlu ve diğerleri, 2002; Gürel, 2016;
George ve diğerleri, 2008).
5.2. Hücre Süspansiyon Kültürü
Hücre süspansiyon kültürü, çalkalanmakta olan bütün besin
elementlerini içeren sıvı besiyerindeki hücre kümeleri ve kallus
hücrelerinden meydana gelmektedir. Bu kültür sayesinde pek çok
alanda ekonomik önemi olan sekonder metabolitler üretilmektedir.
Sekonder metabolitler bitkinin normal büyüme ve gelişmesi için
ihtiyaç duymadığı fakat yan ürün olarak bitkiler tarafından üretilen
kimyasal maddelerdir. Sekonder metabolitlerin bitkilerde, değişen
çevre şartlarından kaynaklı stres ortamına karşı koyma, herbivorlara
ve mikroorganizmalara karşı savunma, polinasyonda hayvanları
cezbetmek için renk ve koku üretmek gibi görevleri vardır. Bitkiler
tarafından üretilen belli başlı sekonder metabolitler flavanoidler,
alkaloidler, terpenler ve tanenlerdir. Sekonder metabolitlerin ilaç
üretiminden, besin katkı maddesi olarak kullanımına, parfümeri ve
zirai mücadelede kullanımına kadar pek çok alanda ekonomik değeri
vardır. Sekonder metabolitleri büyük ölçekli üretmek için

108
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
biyoreaktörlerden (fermentörler) yararlanılmaktadır. Üretimde hücre
süspansiyon kültürlerinden optimum büyüme ve üretimi arzu edilen
sekonder metabolitin maksimum birikiminin sağlanması için öncüller
(precursors), biyodönüşüm (biyotransformasyon), hücre geçirgenliği,
tutuklama (immobilizasyon), elisitasyon, senkronize ve iki aşamalı
kültürler gibi deneysel yaklaşımlar kullanılmaktadır (Babaoğlu ve
diğerleri, 2002; Gürel, 2016; Aktaş ve Çölgeçen, 2017).
5.3. Anter/Mikrospor Kültürü (Haploit Bitki Üretimi)
Anter kültürü, içerisinde olgunlaşmamış polenler (mikrosporlar)
taşıyan anterlerin, tomurcuklardan ayrılarak in vitro koşullarda yapay
bir besiyerinde haploid embriyolar elde edilmesi olarak bilinir. Anter
kültürü mikrospor kültürüne göre daha avantajlıdır. Çünkü içerisinde
binlerce mikrospor barındırmaktadır ve böylece aseptik şartlarda
optimum kültür ortamında birçok haploid bitki elde edilebilmektedir.
Ayrıca haploid bitkiler bazı kimyasallar (kolşisin vb.) ile kromozom
katlanması sağlanır ve dihaploid duruma getirilir. Böylece kısa sürede,
çok sayıda % 100 homozigot bitki hatları elde edilmektedir. Haploid
bitkiler ıslah çalışmalarında genetik analizlerde ve benzer
çalışmalarda kullanılan önemli bir materyaldir. Bu sayede ıslah süresi
kısalarak çok sayıda %100 saf hatlar elde edilir, F1 hibrit çeşit
ıslahında doğrudan ebeveyn olarak kullanılabilir, dayanıklılık
çalışmalarında istenilen özelliklerin seçimine yeni kültürlerin
oluşturulmasına ve mutasyon ıslahında resesif mutasyonların ortaya
çıkarılmasına imkan verir. Bunun yanı sıra bazı dezavantajları vardır;
genotipe bağlı olarak bazı türlerde cevap almak zordur ve bazı türlerde

109
ise albino bitkiler gelişebilir. Bunlar ıslah çalışmaları için büyük
sorunlardır (Babaoğlu ve diğerleri, 2002; Gürel, 2016; Çağlar ve
Abak, 1999).
5.4. Protoplast Kültürü ve Somatik Melezleme
Protoplast, hücre duvarı yok edilmiş hücre zarı ile çevrili hücrenin
bütün unsurlarını içeren yapıdır. Protoplast kültürü ise, aseptik
koşullarda bir hücreden protoplastın izole edilmesi, daha sonra bu
protoplastlardan yeniden hücre duvarının oluşturulması, hücrelerin
mitoz bölünme ile çoğaltılması ve bitki rejenerasyonu ile tam bir bitki
elde edilmesini sağlayan in vitro tekniktir. Selülozik yapıdaki hücre
duvarı ya mekanik olarak ya da enzimatik olarak parçalanarak elde
edilen protoplastları kullanarak, tek bir hücreden tam bir bitki rejenere
etmek ya da somatik melezler geliştirebilmek mümkün olabilmektedir.
Hücre duvarının yapısı pektin, selüloz, hemiselüloz, lipit ve
proteinden meydana gelmektedir. Bu yapıları parçalamak için bir
enzimin varlığı şarttır. En yaygın kullanılan enzimler, selülaz ve
pektinazdır. Protoplast kültüründe eksplant kaynağı olarak, yaprak
mezofil hücreleri, embriyogenik kallus ve hücre süspansiyonları, genç
bitki dokuları (hipokotil, kotiledon vb.), olgunlaşmamış bitki doku ve
organları (embriyo, kotiledon, meyve kabuğu vb.), meristematik
hücreleri içeren dokular (apikal, aksillar ve kök ucu meristemleri),
özel protoplast kaynakları (polen, sepal, petal, stoma hücreleri, yumru
dokular vb.) kullanılmaktadır. Protoplast kültürü sayesinde bitki
ıslahında önemli bir teknik olan somatik melezleme yapılmaktadır ve
bu teknik, klasik yöntemler ile gen akışının sağlanamadığı

110
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
kombinasyonlarda melezlemeye olanak sağlamaktadır. Ayrıca
protoplast kültürü, mutant izolasyonu, hücre organellerinin (nükleus,
kloroplast, mitokondri vb.) izolasyonu, gen aktarımı ve hücre zarından
madde taşınımı ile ilgili çalışmalarda da kullanılabilmektedir.
Somatik melezleme, iki protoplastın çekirdek ve sitoplazmalarının
birbiriyle birleştirilmesi olayıdır. Bir protoplastın çekirdek ve
sitoplazmasının diğer bir protoplastın sitoplazması ile birleşmesi
sonucu oluşan melez bitkiye ise somatik sibrit denir. Protoplast
füzyonu daha çok kimyasal (PEG-polietilen glikol) ya da elektriksel
yollarla gerçekleştirilir. Somatik melezleme çeşitli uyuşmazlıklar
gösteren cins ve türler arası melezlemeye ve yeni türlerin elde
edilmesine olanak sağlamaktadır. Ve hatta cins ve türler arası
mitokondriyel DNA, kloroplast ve sitoplazma gibi çekirdek dışı
genetik elementlerin transferine de olanak sağlamaktadır. Protoplastlar
bitki rejenerasyonu ve gen transferi için çok cazip görülse de
protoplastlar ile çalışmak çok büyük hassasiyet ve dikkat isteyen bir
iştir. Bu nedenle, protoplastlardan bitki rejenerasyonu çalışmalarından
ziyade, proteinlerin yerini belirleme ve geçici transgen analizleri için
yaygın olarak kullanılmaktadır (Babaoğlu ve diğerleri, 2002; Gürel,
2016).
5.5. Embriyo Kültürü
Bitkilerin tohumlarından ya da tohum taslaklarından embriyoların
steril koşullarda izole edilerek yapay bir besiyerinde in vitro
koşullarda kültüre alınması işlemidir. Olgun tohum embriyoların

111
kültürü ve olgunlaşmamış erken bölünme fazındaki proembriyoların
kültürü olmak üzere iki tip embriyo kültürü vardır. Embriyo kültürü,
dormant, inatçı ve sert tohum kabuğuna sahip türlerin çimlenmesinde
kullanılarak ıslah süresini kısaltmak için iyi bir yöntemdir. Bunun yanı
sıra embriyosu tam olarak gelişmeyen türlerden çimlenebilir normal
bitkiler üretilmesinde ve çimlenme yeteneği olmayan tohumlar
oluşturan türler arası melezlerden yaşayan hibrit embriyolar
oluşturulmasında kullanılmaktadır. Ayrıca embriyo kültürü ile haploit
bitki üretimi, tohum canlılık testi, olgunlaşmamış embriyo ve
embriyogenik kallus ile direkt somatik embriyoların üretimi de
sağlanabilmektedir (Babaoğlu ve diğerleri, 2002; Gürel, 2016).
5.6. Meristem Kültürü
Tarla ve sahadan alınan ve in vivo olarak yetiştirilen bitki materyalleri
genellikle fungal, bakteriyal ve viral hastalıklar ile bulaşık olabilirler.
Doku kültürü yolu ile çoğaltım sırasında bitki materyallerini sterilize
etsek bile bazı durumlarda kültür ortamında bakteri ve mantar
kolonileri gelişebilmekte ve büyük kayıplara neden olmaktadır. Bu
durum yüzey sterilizasyonun yeteri kadar yapılmadığı durumlardan,
eksplantın içine gizlenmiş olan mikroorganizmalardan ya da uzun bir
steril kültür döneminden sonra doğal olarak meydana gelen kronik
kontaminasyonlardan kaynaklı olabilir. Bunun için özellikle
mikroçoğaltım çalışmalarında bütün bitkiler hastalıktan ari olması
gerekmektedir. Apikal meristem uçları kullanılarak virüsten,
bakteriden ve mantardan ari hastalıksız bitkiler elde edilebilmektedir.
Meristem kültürü ile virüsten ari bitki materyali elde etmek,

112
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
mikroçoğaltım, germplazm muhafazası, genetik transformasyon,
bakteri ve mantardan ari bitki eldesi mümkün olmaktadır. Meristem
kültüründe kullanılan eksplantın büyüklüğü, fizyolojik durumu,
alındığı mevsim, kültür ortamı (mineral tuzlar, şekerler, agar, büyüme
düzenleyicileri vb.) ve şartları başarıyı etkileyen faktörler arasındadır.
Meristem kültürünün başarısız olduğu durumlarda termoterapi
uygulaması ile virüssüz bitkilerin üretiminde başarı sağlanmıştır
(Babaoğlu ve diğerleri, 2002; Gürel, 2016).
6. In Vitro Bitki Rejenerasyon Yöntemleri
6.1. Organogenez
Somatik hücrelerden ya da dokulardan sürgünler, kökler ya da
yapraklar gibi organların oluşmasına organogenez denilmektedir.
Bitkisel dokular tamamen farklılaşan hücrelere, bozulmamış bir hücre
zarı sistemine ve canlı bir çekirdeğe sahip olduğu sürece tekrar
meristematik bir özellik kazanarak mitoz bölünme gösterebilirler. Bu
bölünmeler sonucunda adventif sürgün ya da kök sistemi doğrudan ya
da farklılaşmamış hücre yığını olan kallus dokusundan sürgün veya
kök meydana getirir. İşte bu farklılaşmamış bitki dokusunun bu
şekilde hücre yığınına dönüşmesine tersine farklılaşma
(dedifferentiation), böyle bir hücre yığınından sürgün ve kök gibi
morfolojik bir değişikliğin olması ise yeniden farklılaşma
(redifferentiation) olarak adlandırılır (Şekil 5). Bütün bu özellikler
bitkisel dokuları eşsiz kılan totipotensi özelliğinden kaynaklanır. İşte
bu özellik sayesinde de protoplastların, hücrelerin, dokuların ve

113
organların kültürleri yapılarak in vitro bitki rejenerasyonu sağlanmış
olunur.
Şekil 5. Organogenez Oluşum Aşamaları
Organogenez indirekt ve direkt olmak üzere ikiye ayrılmaktadır (Şekil
6). İndirekt organogenezde, kullanılan eksplanttan doğrudan kallus
dokusu oluşturulur oksin ve sitokinin gibi bitki büyüme
düzenleyicilerinin farklı konsantrasyonlarda uygulanması ile sürgün
ya da kök oluşumu teşvik edilerek tam bir bitki elde edilmektedir.
Direkt organogenezde ise kullanılan eksplanttan doğrudan sürgün ya
da kök dokusu oluşturularak tam bir bitki rejenerasyonu sağlanmış
olunur.
Şekil 6. Organogenez Çeşitleri

114
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
İndirekt organogenezde klonal çoğaltım pek mümkün olmayabilir,
fakat somaklonal varyantların seçimi ve kitlesel çoğaltım için ideal bir
sistemdir. Bitki transformasyon çalışmalarında da yaygın olarak
kullanılmaktadır. Direkt organogenez ise bitkilerin etkin çoğaltımı,
transgenik bitki üretimi ve en önemlisi klonal çoğaltım için başarılı bir
şekilde uygulanabilmektedir (Babaoğlu ve diğerleri, 2002; Gürel,
2016).
6.2. Somatik Embriyogenez
Bitkinin somatik dokularından kapalı vasküler sisteme sahip kök ile
sürgün yapısını içeren bipolar (iki kutuplu) bir embriyonun
üretilmesini sağlayan aseksüel gelişim sürecine somatik embriyogenez
denir. Kallus ve vejetatif dokulardan gelişen embriyolara somatik
embriyo adı verilmektedir. Somatik embriyogenez in vitro bitki
üretiminde klonal çoğaltım için çok uygun bir tekniktir. Somatik
embriyogenez eksplant kaynağı, genotip, besin ortamının içeriği ve
çevresel şartlar gibi faktörlerden etkilenmektedir. Somatik
embriyogenez de organogenezde olduğu gibi indirekt ve direkt
embriyogenez olmak üzere ikiye ayrılırlar (Şekil 7).

115
Şekil 7. Somatik Embriyogenez Çeşitleri
İndirekt embriyogenezde eksplant öncelikle oksin içeren besiyerine
aktarılır ve kallus oluşumu teşvik edilir. Daha sonra bu kalluslardan
pro-embriyolar oluşur. Kallus oksin içermeyen bir besiyerine
aktarılırsa pro-embriyolardan bipolar embriyolar oluşur. Eğer şartlar
uygun ise bipolar embriyolardan bitkicikler elde edilir. Direkt
embriyogenezde ise eksplant dokusundaki tek bir hücre ya da hücre
gruplarından bitki gelişir. Direkt embriyogenezde en sık kullanılan
eksplant kaynağı olgunlaşmamış somatik embriyolardır. İndirekt
somatik embriyogenez, somaklonal varyantların seleksiyonunda ve
transgenik bitki üretiminde kullanılırken, direkt somatik
embriyogenez somaklonal varyasyon ihtimali düşük olduğundan
klonal çoğaltım için daha avantajlıdır. Somatik embriyogenez tekniği
kullanılarak, klonal çoğaltım, transgenik bitki üretimi ve sentetik
tohum üretimi mümkün olmaktadır (Babaoğlu ve diğerleri, 2002;
Gürel, 2016).

116
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
KAYNAKÇA
Aktaş, M. & Ateş, A. (1998). Bitkilerde Beslenme Bozuklukları Nedenleri
Tanınmaları. Nurol Matbaacılık A.Ş. Ostim-Ankara.
Aktaş, T., & Çölgeçen, H. (2017). Farklı Bitki Türlerinde Bitki Doku Kültürü
Teknikleriyle Flavonoidlerin Üretimi. Karaelmas Science and Engineering
Journal, 7(2), 665-673.
Babaoğlu, M., Yorgancılar, M., Akbudak, M. A. (2002). Bitki Biyoteknolojisi I:
Doku Kültürü ve Uygulamaları. Mehmet Babaoğlu, Ekrem Gürel ve
Sebahattin Özcan (Ed.), Doku Kültürü: Temel Laboratuvar Teknikleri (s.1-
373). Konya: Selçuk Üniversitesi Basımevi.
Baktır, İ. (2010). Bitki Büyüme Düzenleyicileri Özellikleri ve Tarımda
Kullanımları. Hasad Yayıncılık.
Baldwin, I. T., Staszak-Kozinski, L., & Davidson, R. (1994). Up in smoke: I.
Smoke-derived germination cues for postfire annual, Nicotiana attenuata
Torr. Ex. Watson. Journal of Chemical Ecology, 20(9), 2345-2371.
Borkird, C., & Sink, K. C. (1983). Medium components for shoot cultures of
chlorophyll-deficient mutants of Petunia inflata. Plant cell reports, 2(1), 1-4.
Boşgelmez, A., Boşgelmez, İ. İ., Savaşçı, S. & Paslı, N. (2001). Ekoloji – II
(Toprak), Başkent Klişe Matbaacılık, Kızılay-Ankara.
Brady, N. C. (1990). The Nature and Properties of Soils (10. Baskı), Macmillan
Publishing Company, New York, USA.
Chiwocha, S. D., Dixon, K. W., Flematti, G. R., Ghisalberti, E. L., Merritt, D. J.,
Nelson, D. C., ... & Stevens, J. C. (2009). Karrikins: a new family of plant
growth regulators in smoke. Plant science, 177(4), 252-256.
Çağlar, G., & ABAK, K. (1999). Hıyarda (Cucumis sativus L.) in situ uyartım
sonucu elde edilen haploid embriyolardan in vitro haploid bitki oluşturma.
Tr. J. of Agriculture and Forestry, 23, 283-290.
De Cuyper, C., Struk, S., Braem, L., Gevaert, K., De Jaeger, G., & Goormachtig, S.
(2017). Strigolactones, karrikins and beyond. Plant, cell & environment,
40(9), 1691-1703.

117
De Lange, J. H., & Boucher, C. (1990). Autecological studies on Audouinia capitata
(Bruniaceae). I. Plant-derived smoke as a seed germination cue. South
African Journal of Botany, 56(6), 700-703.
Driver, J. A. & Kuniyuki, A. H. (1984). In vitro propagation of Paradox walnut
rootstock. Horticultural Science 19:507–509.
Eyidoğan, F. ve Ekmekçi, Y. (2016). Biyoteknolojisi ve Genetik. Hüseyin Avni
Öktem ve Meral Yücel (Ed.), Bitki Gelişimi ve Fizyolojisi (s. 101-103).
Ankara: Nobel.
Fageria, N. K. (2009). The Use of Nutrients in Crop Plants. CRC Pres, Boca Raton,
Florida, New York.
Fan, X., Mattheis, J. P., Fellman, J. K., & Patterson, M. E. (1997). Changes in
jasmonic acid concentration during early development of apple fruit.
Physiologia Plantarum, 101(2), 328-332.
Flematti, G. R., Dixon, K. W., & Smith, S. M. (2015). What are karrikins and how
were they ‘discovered’by plants?. BMC biology, 13(1), 108.
Flematti, G. R., Ghisalberti, E. L., Dixon, K. W., & Trengove, R. D. (2004). A
compound from smoke that promotes seed germination. Science, 305(5686),
977-977.
Flematti, G. R., Scaffidi, A., Dixon, K. W., Smith, S. M., & Ghisalberti, E. L.
(2011). Production of the seed germination stimulant karrikinolide from
combustion of simple carbohydrates. Journal of agricultural and food
chemistry, 59(4), 1195-1198.
Foth, H. D. (1978). Fundamentals of soil science. Soil Science, 125(4), 272.
Fox, J. E., & Miller, C. (1959). Factors in corn steep water promoting growth of
plant tissues. Plant physiology, 34(5), 577.
Gamborg, O. L., Miller, R., & Ojima, K. (1968). Nutrient requirements of
suspension cultures of soybean root cells. Experimental cell research, 50(1),
151-158.
Gardiner, D. T. & Miller, R. W. (2008). Soils in Our Environment (11. Baskı).
Pearson/Prentice Hall, USA: Upper Saddle Hill.

118
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
George, E. F., Hall, M. A. & De Klerk, G. J. (2008). Plant Propagation by Tissue
Culture (3. Baskı), The Components of Plant Tissue Culture Media II :
Organic Additions, Osmotic and pH Effects, and Support Systems (s. 119-
121). Netherlands: Springer.
Germination of witchweed (Striga lutea Lour.): isolation and properties of a potent
stimulant
Guha, S., & Maheshwari, S. C. (1964). In vitro production of embryos from anthers
of Datura. Nature, 204(4957), 497-497.
Gürel, S. (2016). Bitki Biyoteknolojisi ve Genetik. Hüseyin Avni Öktem ve Meral
Yücel (Ed.), Doku Kültürü: Bitki Gelişiminin Yönlendirilmesi (s. 113-128).
Ankara: Nobel.
Güzel, N., Gülüt, K. Y. & Büyük, G. (2004). Toprak Verimliliği ve Gübreler. Ç.Ü.
Ziraat Fakültesi Genel Yayın No: 246, Ders Kitapları Yayın No: A-80,
Adana.
Kacar, B. & Katkat, V. (2010). Bitki Besleme. 5. Baskı, Nobel Yayın Dağıtım Tic.
Ltd. Şti, Kızılay-Ankara.
Kantarcı, M. D. (2000). Toprak İlmi. İÜ Toprak İlmi ve Ekoloji Anabilim Dalı, İ Ü
Yayın No. 4261, Orman Fakültesi Yayın No. 462, İstanbul, 420 s.
Knudson, L. (1946). A new nutrient solution for germination of orchid seed.
American Orchid Society Bulletin. 15: 214-217.
Koda, Y., Kikuta, Y., Tazaki, H., Tsujino, Y., Sakamura, S. & Yoshihara., T.,
(1991). Potato tuber -inducing activities of jasmonic acid related compounds,
Phytochemistry, 30, 1435-1438.
La Rue, C.D. (1949). Cultures of the endosperm of maize. American Journal of
Botany. 36-798.
Linsmaier, E. M., & Skoog, F. (1965). Organic growth factor requirements of
tobacco tissue cultures. Physiologia plantarum, 18(1), 100-127.
McCauley, A., Jones, C., & Jacobsen, J. (2009). Plant nutrient functions and
deficiency and toxicity symptoms. Nutrient management module, 9, 1-16.

119
McCown, B. H. & Lloyd, G. (1981). Woody Plant Medium (WPM)-a mineral
nutrient formulation for microculture for woody plant species. Horticultural
Science. 16: 453.
McGranahan, G.H., et al. (1962). Cell and Tissue Culture in Forestry Bonga, J. B ve
D. J Durzan (Ed.), Martinus Nijhoff, Dordrecht, 261-271.
Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio
assays with tobacco tissue cultures. Physiologia plantarum, 15(3), 473-497.
Nelson, D. C., Flematti, G. R., Ghisalberti, E. L., Dixon, K. W., & Smith, S. M.
(2012). Regulation of seed germination and seedling growth by chemical
signals from burning vegetation. Annual review of plant biology, 63.
Nitsch, J. P., & Nitsch, C. (1969). Haploid plants from pollen grains. Science,
163(3862), 85-87.
Olszewski, N., Sun, T. P., & Gubler, F. (2002). Gibberellin signaling: biosynthesis,
catabolism, and response pathways. The Plant Cell, 14(suppl 1), S61-S80.
Onay, A., Yıldırım, H., Pirinç, V., Tilkat, E., Çiftçi, Y. Ö., Akdemir, H., Süzerer, V.,
Çalar, N., Binici, M., Akdemir, Ö. F. ve Kılınç, F. M. (2012). Bitkilerin
Biyoteknolojik Yöntemlerle Ticari Çoğaltımı; Mevcut Ve Gelecekteki
Durum. Batman University Journal of Life Sciences, 1(2), 11–28.
Plaster, E. J. (1992). Soil Science and Management (2. Baskı), Delmar Publishers
Inc., Albany, New York, USA.
Ranga Swamy, N.S. (1963). Studies on culturing seeds of Orobanche aegyptiaca.
Maheshwari and Ranga Swamy (Ed.). 345-354.
Rice, R. W. (2007). The physiological role of minerals in the plant. Mineral nutrition
and plant disease. APS Press, St. Paul, MI, 9-29.
Robbins, W. J. (1922). Cultivation of excised root tips and stem tips under sterile
conditions. Botanical gazette, 73(5), 376-390.
Saalbach, G., & Koblitz, H. (1978). Attempts to initiate callus formation from barley
leaves. Plant Science Letters, 13(2), 165-169.
Samal, K. C. & Rout, G. R. (2018). Practical Manual on Plant Tissue Culture and its
Certification (2. Baskı). Bhubaneswar: M.S. Infotech.

120
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
Steward, F. C., & Shantz, E. M. (1959). The chemical regulation of growth (some
substances and extracts which induce growth and morphogenesis). Annual
Review of Plant Physiology, 10(1), 379-404.
Şahin, M. (2016). Bitkilerde Doku Kültürü Yöntemi ve Uygulama Alanları.
Apelasyon, Sayı: 29.
Tyler, L., Thomas, S. G., Hu, J., Dill, A., Alonso, J. M., Ecker, J. R., & Sun, T. P.
(2004). DELLA proteins and gibberellin-regulated seed germination and
floral development in Arabidopsis. Plant physiology, 135(2), 1008-1019.
Ünsal, P. N. (1993). Bitki Büyüme Maddeleri. İstanbul Üniversitesi, Enstitü yayın
no:4 İstanbul.
Van Den Berg, J. H., & Ewing, E. E. (1991). Jasmonates and their role in plant
growth and development, with special reference to the control of potato
tuberization: a review. American Potato Journal, 68(11), 781-794.
Van Staden, J., Jager, A. K., Light, M. E., & Burger, B. V. (2004). Isolation of the
major germination cue from plant-derived smoke.
White, F. F. (1993). Vectors for gene transfer in higher plants. Kung, S. D., Wu, R.
(Ed.), Transgenic Plants (1. Baskı), Engineering and Utilization (s. 15-48),
Academic Press.
White, P. R. (1934). Potentially unlimited growth of excised tomato root tips in a
liquid medium. Plant Physiology, 9(3), 585.
White, R. E. (2006). Principles and Practice of Soil Science: The Soil as a Natural
Resource (4. Baskı). United Kingdom: Wiley-Blackwell Scientific
Publication, London.
Yıldız, K., & Yılmaz, H. (2001). Jasmontlar (Jasmonic acid and Methyl jasmonate)
Yeni Bir Bitkisel Hormon Grubu Olabilir Mi?. Derim, 18(2), 89-95.

121
BÖLÜM 4
ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI VE
BİYOEKONOMİ
Doç. Dr. Arzu ÜNAL
4
4
Iğdır Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü, Iğdır,
Türkiye. arzu.unal@igdir.edu.tr

122
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ

123
GİRİŞ
Endüstriyel Biyoteknolojı’nin tanımına geçmeden önce Biyotek-
noloji’nin tanım ve kapsamını ele alıp değerlendirmek uygun
olacaktır. Sözcük olarak ilk kez 1919 yılında Macar asıllı Karoly
Ereky tarafından kullanılan BİYOTEKNOLOJİ’nin günümüzde
kullanılan birçok tanımı bulunmaktadır. Bunlar arasında ilgili
çevrelerce en yaygın kabul göreni EFB (European Federation of
Biotechnology) tarafından yapılan tanımlamadır. Bu tanımlamaya
göre BİYOTEKNOLOJI Çevre ve insan sağlığına zarar vermeden,
biyolojik sistemlerin mühendislik ilkeleri esas alınarak mal ve hizmet
üretiminde kullanılmasıdır. Söz konusu tanımdaki BİYOLOJİK
SİSTEMLER deyimi, her türlü biyolojik kaynaktan (bitki, hayvan ve
mikroorganizma gibi) elde edilen doku ve hücrelere ek olarak enzim,
nükleik asitler gibi doğal ve yapay biyomolekülleri de kapsar.
Tanımda ÇEVRE VE İNSAN SAĞLIĞI deyimine yer verilmekle,
biyoteknoloji sistem ve süreçlerinin biyolojik-silah gibi insan sağlığını
ve ekolojik yaşamı tehdit etmeyecek şekilde kullanılması gerektiği
vurgulanmak istenmiştir. Diğer yandan, tanımdaki MAL VE HİZMET
ÜRETİMİ deyimi ile ticari değeri olan MAL (örneğin, antibiyotk,
alkol, çeşitli organik asitler vb) üretimi ile katı/sıvı kirliliklerin arıtımı,
insan sağlığı gibi genelde kâr unsuru içermeyen HİZMET’lerin
üretimine işaret edilmek istenmiştir.
Biyoteknoloji sistem ve süreçlerin kullanılmasının insan yaşamındaki
yeri insanlık tarihi kadar eskidir. Örneğin bugün birer biyoteknoloji

124
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
süreci oldukları bilinen bira yapımı, ekmek yapımı ve şarap yapımı
gibi üretim süreçlerinin insanlık tarihinde çok eski bir geçmişi
bulunmaktadır. Fermantasyonun mikroorganizmalarca gerçekleştirilen
(maya ve bakteriler) tarafından bir biyoteknoloji süreci olabileceği, ilk
kez Louis Pasteur tarafından (1856) 19. yüzyılda gösterilmiştir.
Aseton, bütanol ve penisilin gibi fermantasyon ürünlerinin endüstriyel
ölçekte (ticari ölçekte) üretimleri 20. yüzyıllın ilk yarısında
gerçekleştirilmiştir. Özellikle I. Dünya Savaşı sırasında gliserol,
bütanol gibi patlayıcı yapımında ve penisilin gibi enfektif hastalıkların
tedavisinde kullanılan fermantasyon ürünlerine duyulan büyük
gereksinim endüstriyel–ölçekteki Fermantasyon Biyoteknolojsi’nin
kurulma ve gelişmesinde önemli rol oynamıştır. Fermantasyon
Biyoteknolojisi’nin gelişimi sırasında elde edilen teknolojik bilgi
birikimi ve kazanımlar KLASİK BİYOTEKNOLOJİ olarak
tanımlanan biyoteknoloji süreçlerinn ilerlemesine büyük katkıda
bulunmuştur. Klasik Biyoteknoloji süreçlerinin kullanıldığı
fermantasyon teknolojileri günümüzde de çeşitli bitkisel ve hayvansal
endüstriyel ürünlerin üretiminde kullanılmaktadır.
Petrokimya endüstrisinin 1920’li yıllardan sonra büyük gelişme
göstererek fermantasyonla üretilecek birçok ürünün bu endüstri kolu
tarafından daha ucuz maliyetle üretilebilmesi, ayrıca ucuz petrolün
kimya endüstrisinin gereksinimi olan hammadde ve enerjiyi düşük
fiyatlarla edinebilmesi fermantasyon teknolojisinin diğer bir deyimle,
KLASİK MİKROBİYAL BİYOTEKNOLOJİ’NİN ileri düzeylerde
gelişmesini engelleyen bir faktör olmuştur. 1973’lü yıllara

125
gelindiğinde, OPEC (Organization of Petroleum Exporting Countries:
Petrol İhraç Eden Ülkeler Birliği) ülkelerinin PETROL fiyatlarını
arttıran politikaları sonucu artan petrol fiyatları, özellikle hammadde
ve enerjice petrole bağımlı sanayileşmiş batı ülkelerinde beklenmedik
ekonomik sorun ve krizlere neden olmuştur. Bu durum, moleküler
genetik alanındaki gelişmelerin ve biyoteknoloji uygulamalarının
gerçekleşmesinde motive edici bir unsur olmuştur.
İlk kez İNSÜLİN ve BÜYÜME HORMONU gibi insan proteinlerini
şifreleyebilen sentetik genlerin Rekombinant DNA teknikleriyle
bakteri genomuna aktarılıp bakteri genomuna entegre edilmesiyle, söz
konusu proteinleri üretebilen klonlanmış mikroorganizmalar elde
edilmiştir. Bu şekilde MOLEKÜLER BİYOTEKNOLOJİ veya
REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ olarak da adlandırılan
MODERN BİYOTEKNOLOJİ’nin ilk adımları atılmıştır. Klasik
Biyoteknoji, Modern Biyoteknoloji olarak iki ayrı grupta ele
alabileceğimiz BİYOTEKNOLOJİ diğer birçok bilim dalından farklı
olarak multidisipliner bir özelliğe sahiptir. Nitekim Biyoteknolojinin
gelişmesine biyoloji, fizik, kimya, mikrobiyoloji, fizyoloji, biyokimya,
moleküler biyoloji, genetik vb. temel bilim dallarındaki gelişmelerin
önemli katkısı olmuştur. Temel bilimlerdeki gelişmelerin üzerine bina
edilen günümüz Biyoteknoloji’sinin, örneğin Çevre Biyoteknolojisi,
Gıda Biyoteknolojisi, Tarım Biyoteknolojisi, Tıbbi Biyoteknoloji,
Fermantasyon Biyoteknolojisi, Gen Biyoteknolojisi gibi değişik
uygulama alanları bulunmaktadır.

126
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
1. ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI
Endüstriyel Biyoteknoloji uygulamaları Sürdürülebilir Kalkınma ve
Biyoekonomi’nin itici gücüdür.
1.1. Sürdürülebilir Kalkınma
“Sürdürülebilir ekonomik kalkınma” 21. yüzyılın başından itibaren
uluslararası arenada kalkınmada izlenmesi gereken temel strateji
olarak kabul edilmektedir. Bu gerekliliğin temelinde yeryüzündeki
hammadde ve enerji kaynaklarındaki giderek ortaya çıkan düşüşün
yanı sıra 2050 yılında 10 milyara ulaşacağı tahmin edilen dünya
nüfusundaki artış gibi küresel ölçekteki sosyoekonomik nedenler de
bulunmaktadır. Özellikle son 200 yıldır fosil kökenli enerji ve
hammadde kaynaklarının kullanımına dayalı üretim süreçlerinin
kullanılageldiği ekonomik modellerin gerek kaynak tüketimi açısından
gerekse ekolojik açıdan yarattığı sorunlar, sürdürülebilir ekonomik
model arayışları için zorlayıcı nedenler olmuştur. Nitekim bu durum
Birleşmiş Milletler tarafından 2000 yılı eylül ayında yayınlanan
deklarasyonda “Yakın gelecekte tüm çocuk ve torunlarımızı insan
etkinlikleri sonucu onarılmaz şekilde bozulmuş ve kaynakları
tükenmiş bir gezegende yaşatmak için özel bir çaba harcamamıza
gerek kalmayacaktır” ifadesiyle özetlenmeye çalışılmıştır.
Sürdürülebilir ekonomik kalkınma modeli arayışlarını zorunlu kılan
küresel nedenler arasında özellikle petrole bağlı enerji ve hammadde
kaynaklarının üretiminde ortaya çıkan sorunlar kadar bu kaynakların
uluslararası paylaşımında gözlenen güvenlik sorunları da önemli yer
tutmaktadır. Nedenlerden bir diğeri de konvansiyonel teknolojilerin

127
yol açtığı çevre ve sağlık sorunları nedeniyle çevre-dostu yeni
teknolojiler için her gün artış gösteren kamuoyu baskısıdır.
Ekonomi ile doğal çevrenin karşılıklı bağımlılığının kalkınma
politikalarında ele alınmasının gerekliliğine ilişkin ilk kapsamlı uyarı
1972 yılında Roma Kulübü’nün “Büyümenin Sınırları” başlıklı
raporunda yapılmıştır. Ancak sürdürülebilir kalkınmanın küresel çapta
aktif bir politika haline dönüşmesi, bu raporun yayınlanmasından
sonra 20 yıllık bir gecikme ile 1992 Rio Zirvesi’nden sonra mümkün
olabilmiştir.
Sonuçta bu süreç 2000 yılından itibaren Birleşmiş Milletler tarafından
küresel kalkınma stratejisi olarak da kabul edilmiştir. Doğal
kaynakların (su ve fosil enerji kaynakları gibi) daha az kullanımı,
başta CO2 olmak üzere kirletici emisyonların azaltılarak çevrenin
küresel, bölgesel ve yerel ölçeklerde daha az kirletilmesi, bireysel ve
toplumsal yaşam kalitesinin artırılması gibi nedenler söz konusu
stratejinin temel hedeflerini oluştururken, diğer yandan bu hedeflere
ulaşmakta izlenecek stratejik süreçler ise şu şekilde belirlenmiştir:
a) Mal ve enerji üretimde hammadde olarak yenilenebilir
kaynakların kullanılması
b) Ürünlerin çevre-dostu nitelikte olması
c) Kirlilik üretmeyen ya da en az kirlilik üreten temiz üretim
teknolojilerinin kullanılması
d) Enerji kullanımında tasarruf

128
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
Bu hedefler doğrultusunda ekonomik büyümenin temel dayanağını
oluşturacak teknolojik yenileşmelerden (renovasyonlardan)
beklenenler arasında ise üretilecek mal, hizmet ve proseslerde üstün
rekabet edilebilirlik niteliğine ulaşmak, yüksek katma-değer yaratmak,
yeni istihdam alanları oluşturabilmek, toplumun etik, kültürel ve
ekonomik talepleriyle uyumlu olmak gibi özellikler yer almaktadır.
Şekil 1’de şematik olarak özetlenmeye çalışıldığı gibi toplumsal
değerlendirme, ekonomik verimlilik ve kârlılık, çevresel uyumluluk
sürdürülebilir kalkınmanın 3 paydaşını oluşturan temel öğelerdir. Bu
öğelerin aralarındaki bağlantının oluşturduğu üçgenin kenar
uzunlukları ile sürdürülebilir kalkınmanın verim ve başarısı arasında
doğru orantılı bir ilişki vardır. Yani sürdürülebilir ekonomik sürece
uygun olarak üretilecek bir mal, hizmet ya da bu amaçla kullanılacak
bir teknik süreç, toplumsal-etik değerlerle uzlaşmış olmanın yanı sıra
kısaca Eko-yeterlilik diye tanımlanan hem ekolojik ham de ekonomik
uygunluğu ortaklaşa yansıtan parametre açısından da yüksek değerde
olmak zorundadır.
Şekil 1. Sürdürülebilir Kalkınmanın Temel Dayanakları ve Eko-Yeterlilik İlişkisinin
Şematik Açıklaması

129
1.1.1. Sürdürülebilir Kalkınma İçin Eko-Yeterlilik
Analizi
Eko-yeterlilik analizi yeni mal, hizmet ve süreçlerin sürdürülebilirlik
değerini belirlemek amacıyla kullanılmaktadır. Söz konusu analitik
değerlendirmenin grafiksel boyutlandırılması ve analizi, apsise
maliyet, ordinata da 6 ayrı paremetre açısından çevresel-etki
değerlendirilmesi yerleştirilerek yapılmaktadır (Şekil 2). Çevresel etki
değerlendirmede ele alınan paremetreler aşağıda belirtilmiştir:
a) Madde kullanımı
b) Enerji kullanımı
c) Yaratılan emisyonlar
d) Yer kullanımı
e) Zarar potansiyeli
f) Toksisite
Şekil 2. Eko-Yeterlilik Analizinin Parametrik Değerlendirmesi

130
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
1.2. Biyoekonomi
1.2.1. Biyoekonomi Nedir?
Bitki, hayvan, mikroorganizma ve diğer tüm canlıların araştırma,
geliştirme, üretim, ticaret ve tüketimi ile ilgili ekonomik faaliyetlerin
tümü biyoekonomi olarak tanımlanmıştır. Bilimsel anlamda
biyoekonomi, canlılardan biyoteknoloji gibi yeni yöntemlerle artı
değerler üretilerek ekonomik kazanç sağlanmasını hedeflemektedir.
Bu kazançta amaç, sağlıkta gelişme, tarım ve endüstride verim ve
kalite artışı, çevrede sürdürülebilir iyileştirmedir. Etkinlik, tarım ve
ormana yönelikse YEŞİL, endüstriye yönelikse BEYAZ ve denizlere
yönelikse MAVİ biyoekonomi anlaşılmaktadır.
1.2.2. Biyoekonomiye Neden İhtiyaç Duylmaktadır?
Günümüz koşullarında gerçekleştirilen sürdürülebilir kalkınma
üretimde kullanılan kaynakların sınırlı ve yenilenemez olmasından
dolayı ekolojik dengeyi bozduğu sonucunu ortaya çıkarmaktadır.
Özellikle gelişmiş ülkelerde toplumların mevcut fiziksel ve enerji
tüketimleri göz önünde bulundurulduğunda dünyanın mevcut tüketim
düzeyinin sürdürülebilir olmadığı bilinmektedir. Sürdürülebilir ve
ekolojik dengeyi gözeten bir üretim modeli için biyoekonomi, gelecek
yıllar içerisinde önemini arttırarak devam edecektir. OECD (2009)
raporlarına göre, biyoekonomik gelişmelerin temelinde, gelişen
ülkelerde artan nüfus ve kişi başına düşen gelir yer almaktadır.
Dünya nüfusu gelecek 10 yıl içerisinde 10 milyara ulaşacağı ve bu
artışın %97’sinin gelişen ülkelerde meydana geleceği tahmin

131
edilmektedir. Artan bu nüfus sonuç itibariyle gıda, yem, su kaynakları,
enerji gibi kaynakların üzerinde baskı yaratacaktır. Yine rapora göre
2030 yılına kadar GSYİH miktarının OECD ülkelerinde %2.3 ve
gelişen ülkelerde %4.6 oranında artacağı öngörülmektedir.
Ayrıca biyokimyasal ürünlerin toplam kimyasal ürünler içerisindeki
payının %35’e, biyoteknoloji ile üretilen ürünlerin oranının ise
%50’ye ulaşılacağı tahmin edilmektedir. Bu nedenle biyoekonomi
alanında bir yapılanmaya ihtiyaç duyulmakta ve biyoekonomi
alanındaki ihtiyacın özel sektör girişimleri ile karşılanması
gerekmektedir.
1.2.3. Biyoekonominin Sürdürülebilir Kalkınmadaki
Yeri Ve Önemi
Biyoekonomi ya da Biyoloji-temelli Ekonomi için günümüzde değişik
tanımlar yapılmaktadır. Bunlardan biri de “Etkin Biyoproseslerin ve
yenilenebilir biyokaynakların sağlıklı ve sürdürülebilir büyüme ve
gelişme için kullanıldığı etkinlikler bütünüdür” şeklinde yapılmış olan
tanımlamadır. Sürecin tarımsal yönüne daha ağırlık veren diğer bir
tanım da “Temel yapıtaşları ve enerjisi bitki / tahıl kökenli
kaynaklardan gelen ekonomidir” şeklindedir. Biyoekonomi, Tarımsal
Biyoteknoloji, Çevre, Sağlık, Ormancılık, Enerji gibi sektörlerdeki
yeni teknoloji ve AR-GE’lerden yararlanan bir süreçtir. Bunlar dışında
Biyoekonomi, Bilişim Teknolojisi, Biyolojik Bilimler, Kimya, Fizik
ve Mühendislik alanlarındaki gelişmelerden yararlanan multidisipliner
bir özelliğe de sahiptir. Ne var ki, gelecekte de bugün olduğu gibi

132
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
kaçınılmaz olarak Biyoekonominin temel iticini gücünü
Biyoteknoloji’deki gelişmelerin oluşturacağı ilgili çevrelerce geniş
çapta kabul edilmektedir.
Endüstriyel devrim sürecine geçilmeden önce toplumların yaşamında
geçerli olan Tarım Ekonomisi çevre ile uyumluğu temelinde
sürdürülebilirlik özelliği de taşımaktaydı. Günümüz ekonomik
yaşamının temelini oluşturan ve 200 yıllık geçmişi olan endüstriyel
devrimin üzerinde yaşadığımız gezegende gerek hammadde ve enerji
kaynaklarının tüketimi, gerekse çevre ve insan sağlığı açısından
önemli olumsuzluklar yarattığı bilinen bir gerçektir. Bu nedenle
gelecekteki sürdürülebilir ekonominin temeli ancak endüstriyel alanda
teknolojik yenileşmeyle sağlanabilecektir. Yeni teknolojiler arasında
bu yönde en umut verici olanı Biyoteknoloji olarak göze
çarpmaktadır. Günümüzde Biyoteknoloji teknikleri kullanılarak
tarımsal kökenli tahıl ve bitkisel lignoselülozları enerji ve mal
üretiminde hammadde olarak değerlendirebilmek olanaklıdır. Böylesi
Biyoteknoloji süreçlerinin aynı amaçlarla fosil kaynakların tüketimine
dayanan konvansiyonel teknolojilere seçenek oluşturabileceği ilgili
otoritelerce geniş kabul gören bir gerçektir (Şekil 3). Yenilenebilir
kaynaklara dayanması ve çevre dostu üretim özellikleri bakımından
Bitkisel ve hayvansal kökenli kaynaklardan üretilen Biyoteknoloji
ürünlerin eko-yeterlilik değerlerinin yüksek oluşu bunların
sürdürülebilir katsayılarını da olumlu yönde etkilemektedir. Diğer
yandan, sürdürülebilirlik açısından bir diğer önemli konu da, petrol
gibi fosil kaynakların aksine bitkisel kaynaklardan üretilecek enerji ve

133
ürünler bunların tüketimine bağlı olarak oluşacak ve sonuçta küresel
boyutta iklimsel değişmelere neden olabilecek gaz emisyonları
yaratmayacaktır.
Şekil 3. Petrole Dayalı Konvansiyonel Ekonomi ile Biyoekonominin Şematik
Karşılaştırması
Günümüzdeki Biyoteknoloji uygulamaları, ilaç, gıda-içecek, tekstil,
deterjan, kağıt, kimya ve tarım gibi ekonominin değişik sektörlerinde
yüksek katma değer ve eko-yeterlilik gibi paremetreler açısından
olumlu sonuçlar yaratan yeniliklere neden olmuştur. Bilindiği gibi
kimya endüstrisi ürettiği mal ve hizmetlerle insan yaşamında gıdadan
giyime kadar değişik alanlarda önemli bir yer tutmaktadır. Bazı
çevrelerce “Beyaz Teknoloji” olarak da adlandırılan Endüstriyel
Biyoteknolojideki son gelişmeler, bu teknoloji dalının Kimya
Endüstrisi’ne seçenek oluşturacağını ortaya koymaktadır. Endüstriyel
Biyoteknoloji “mal ve hizmet üretiminde mikroorganizma veya
enzimlerin kullanıldığı endüstriyel üretim süreci” olarak

134
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
tanımlanmaktadır. Ancak felsefi temelde “doğanın alet çantasının
endüstriyel üretim amaçlı kullanımıdır” şeklinde de tanımlanmaktadır.
Dünya genelinde henüz emekleme döneminde olduğu söylenen
Endüstriyel Biyoteknoloji her geçen gün büyüme gösteren bir pazar
potansiyeline sahiptir. Endüstriyel Biyoteknoloji ürünlerinin
dünyadaki pazar payının önümüzdeki yıllarda 200 milyar ABD
dolarının üzerine çıkacağı tahmin edilmektedir. Son yıllarda dünya
pazarlarında satışa sunulan kimyasalların %10-20’sinin Endüstriyel
Biyoteknoloji ürünü olacağı ileri sürülürken, bu sektörde her yıl 11-22
milyar Euroluk katma değer üretileceği düşünülmektedir. Endüstriyel
Biyoteknoloji günümüzde petrokimya kökenli birçok ürünü biyokütle
ve tahıl gibi bitkisel kökenli kaynaklardan üretebilmektedir (Şekil 4).
Gelecekte Biyoekonominin temelini oluşturacak Biyoteknoloji
sürecinin kuracağı biyorafinerilerin günümüzdeki petrolrafinerilerin
yerini alması söz konusudur. Endüstriyel Biyoteknolojinin
sürdürülebilir kalkınmaya getireceği kazanımlar ise:
 Kirlilik ve atıkta azalma
 Enerji, hammadde ve su kullanımında azalma
 İyi kalitede gıda üretimi
 Atıklardan yeni malzemeler ve biyoyakıtların üretimi
 Kimyasal süreçlere alternatif oluşturmak şeklinde sıralanabilir.
Biyoteknolojinin sürdürülebilir endüstriyel üretime katkısını Vitamin
B12 örneği üzerinden yapılan değerlendirmeyle anlatmak mümkündür:
Söz konusu vitaminin Biyoteknoloji süreciyle üretimi kimyasal üretim

135
süreciyle karşılaştırıldığında; Biyoteknoloji süreciyle üretime bağlı
olarak maliyette ve tüm çevresel etkide % 40, CO2 emisyonunda %
30, kaynak kullanımında % 60 ve atık üretiminde % 95 tasarruf
sağlandığı görülmüştür.
Şekil 4. Değişik Ürünlerin Üretiminde Petrole ve Biyokütle Kullanımına Dayalı
Süreçler
1.2.4. Biyoekonominin Uluslararası Arenada Gelişimi
Dünya üzerinde 1992 yılında 8.1 milyar ABD Doları gelir getiren,
100.000 kişi istihdam eden biyoendüstri, 2001 yılında 34.8 milyar
ABD Doları gelir getiren ve 190.000 kişi istihdam eden bir sektör
haline gelmiştir.
Ancak söz konusu Biyoendüstriyel gelirlerin % 97’sinin ve istihdamın
% 96’sının ABD’de, Kanada’da ve Avrupa ülkelerinde gerçekleştiğini

136
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
söyleyebiliriz. İstatistiklerine göre resmi kaydı bulunan büyük firmalar
temelinde ABD’de 318 (yıllık cirosu 33 milyar ABD Doları),
Avrupa’da 102 (yıllık cirosu 12.8 milyar ABD Doları) firma
bulunmaktadır.
Geçtiğimiz yıllarda ABD’de Biyoteknoloji alanında AR-GE
çalışmaları için 20.5 milyar ABD Doları, Avrupa’da ise 7.6 milyar
ABD Doları bütçe ayrıldığı rapor edilmiştir. Biyoekonomiyi stratejik
hedef seçen ülkelerden ABD’nin Ulusal Araştırma Kurumu bu
yüzyılın sonunda ABD’de yakıtların % 50’sinin, organik
kimyasalların da %90’nının yenilenebilir kaynaklardan üretileceğini
öngörmektedir.
AB’ de sürdürülebilir kalkınma ile ilgili zirve kararları ilk kez 2000
yılı Lizbon Stratejisi ile ele alınmıştır. Lizbon Stratejisi ile 2010 yılı
için rekabet gücü yüksek ve bilgi teknolojilerine dayalı ekonomik
kalkınma hedefi belirlenmiştir. 2001 yılı Kopenhag Zirvesi ile de
rekabet edilebilirlikte ve sürdürülebilirlikte Biyoteknoloji
potansiyelinin kullanılması kararına varılmıştır.
Sonuçta AB tarafından 2001-2006 yılları arası 2020 yılı hedefli “Biyo
Temelli Yaşam Bilimleri ve Bilgi Temelli Biyo-Ekonomi” (KBBE:
The European Knowledge Based Bio-Economy) Stratejisi
geliştirilmiştir. AB ülkelerinin Biyoekonomi etkinlikleri arasında
eşgüdümü sağlamak amacıyla kurulan KBBE-NET ağının toplantısına
ait rapordaki saptamalara göre:

137
 ABD‘de Biyoteknoloji alanındaki AR-GE yatırımlarının
miktarı AB’dekilerin 3 katı kadardır.
 Biyoküitle kullanımı için ABD’de ayrılan bütçe AB’de bu
amaçla ayrılan bütçenin 2 katı kadardır.
 Çin 2001-2005 döneminde Biyoteknoloji yatırımlarında 1.5
milyar Euroluk harcama yapmış olup gelecek 5 yılda bunu 2 kat
artıracağı düşünülmektedir.
 Japonya’nın 2007’de Biyoteknoloji AR-GE’sine ayırdığı
desteği 2 kat, istihdamı 3 kat artıracağı tahmin edilmektedir.
 Hindistan’da gelecek 5 yıl içinde 5 milyar dolarlık gelir
getireceği tahmin edilen Biyoteknoloji sektöründe 1 milyon
istihdam sağlanacağını beklenmektedir.
1990’ladan sonra dile getirilmeye başlanan Biyoekonomi süreci hızla
gelişme kaydetmektedir. Son yıllarda, gerek AB ve gerekse ABD,
gelecek için biyoekonomi planlarını ardı ardına ilan etmişlerdir. 2012
yılının Şubatında AB “Avrupa İçin Sürdürülebilir Biyoekonomi”,
daha sonra da ABD “Ulusal Biyoekonomi” planlarını açıklamışlardır.
Bu planlarda ana hedef biyolojide AR-GE ve yeniliklere yöneliktir.
Fakat AB BEYAZ biyoekonomiye odaklanırken, ABD YEŞİL,
BEYAZ, MAVİ olmak üzere her üç dalı da birlikte ele almaktadır.
2050’lere doğru bitkisel ve hayvansal üretim artışına ilişkin hususlar
Uluslararası Gıda Politikaları Araştırma Enstitüsünün (International
Food Policy Research Institute – IFPRI) yayınladığı bir raporda ele
alınmıştır. Söz konusu rapor, şu anda tükettiğimiz gıdanın miktarının

138
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
%70 artırılması gereğine değinirken, bu artışın et için %80 ve tahıl
için %52 civarında olması öngörülmüştür. Bu da, günümüzde 260
milyon tonluk dünya et üretiminin 2050’lerde 455 milyon tona
çıkarılması gerekeceği anlamına gelmektedir.
2. Sonuç ve Genel Değerlendirme
Endüstriyel Biyoteknoloji ve Biyoekonominin kırsal kalkınma
alanında sağlayacağı yararlar oldukça fazladır. Uluslararası ve ulusal
ekonomik model olarak seçilmesi durumunda getireceği yararlar ve
kazanımlar şu şekilde özetlenebilir:
• Ekonomik Yararlar
– Sürdürülebilir yeni pazar fırsatları / iş olanakları yaratılacaktır
– Petrol ürünlerine bağımlılıkta azalma olacaktır
• Çevresel Yararlar
– Küresel ekosistemde karbon dengesi sağlanacaktır
– İnsan kaynaklı kirlenme minimize edilecektir
• Sosyal Yararlar
– İnsan ve çevre sağlığında iyileşme olacaktır
– Kırsal ekonomik kalkınmada itici güç oluşturulacaktır
Bölgesel ve havza boyutunda Iğdır ilimizi ele aldığımızda, kırsal
alanda yapılacak Endüstriyel Biyoteknoloji ve Biyoekonomi’ye ait iş
yatırımlarının toplam istihdam oranları bakımından ülkemize
getireceği önemli kazanımlar söz konusudur.

139
Kırsal alanda yapılacak Endüstriyel Biyoteknoloji temelli yatırım ve
üretimler ülkemizde toplam istihdamın yaklaşık %35’ini oluşturan
tarım sektöründeki istihdamı olumlu yönde etkileyecektir. Yine bu
yöndeki yatırımlar kırsal bölgelerden kent göç gibi sosyal sorunların
engellenmesine de neden olacaktır. Örneğin kırsal bölgelere kurulacak
biyorafineriler kırsal bölgelerde yeni istihdam olanakları
sağlayacaktır. Ayrıca, biyoekonomiye yönelik endüstriyel
uygulamaların kırsal kalkınmada yaratacağı olumlu gelişmelerin,
ülkenin içinde bulunduğu bazı bölgesel sorunlara da çözüm getirmekte
yardımcı olabileceği düşünülmektedir.
Endüstriyel Biyoteknoloji ve Biyoekonominin özellikle tarım
potansiyeli yüksek ülkelerde uygulanmasıyla gerek enerji gerekse
hammadde yönünden dışa bağımlılık azalacağından ulusal
bütçelerdeki sorunlara da çözüm getirebileceği ileri sürülmektedir.
Sonuç olarak, mikroklimatik Iğdır Havzasında bitkisel ve hayvansal
üretim potansiyeli orta ölçekte yeterli olup, gerek kırsal kalkınma,
gerek sürdürülebilir tarım açısından Bioyoekonomiye katkı sağlayacak
Endüstriyel Biyoteknoloji uygulamalarına ihtiyaç vardır.
Biyoekonomiye geçişin, girişimcilik anlayışı ile bu alandaki pazarlara
ve iş fırsatlarına erişimin kolaylaşmasına yardımcı olacak çeşitli
girişimci ilişkileri ve girişimleri incelenmeli, biyogirişimciliğin
bileşenleri kategorize edilmeli, Dünyada ve Türkiye’deki
biyogirişimciliğe ilişkin çalışmalar takip edilmelidir. Bu kapsamda

140
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
tarım sektöründeki biyoekonomi alanında yapılan faaliyetler
belirlenerek sektördeki yeni fırsatlar incelenmeli ve çalışma
kapsamında tarımsal biyoekonomi alanındaki gelişmeler ile ülkelerin
kalkınmaları arasındaki ilişkiler ortaya konularak, tarımsal
biyoekonomi girişimciliği yaygınlaştırılmalıdır.
Biyoekonomi alanında AR-GE çalışmalarının artırılması ve piyasa
talebi doğrultusunda yönlendirilmesi sağlanmalı ve araştırma projeleri
desteklenmelidir. Bu kapsamda üniversite, kamu, özel sektör
uzmanlarından oluşan çalışma gruplarıyla patente konu AR-GE
hizmetlerinin hayata geçirilmesi, milli ve yerli üretime katkı
sağlanması öncelikli konular arasında yer almalıdır.
Şekil 5. Bitkisel - Hayvansal Üretimde Kullanılan Endüstriyel Biyoteknoloji
Uygulamaları ve Biyoekonomi’nin Şematize Edilmesi (Https://Www.Google.
Com.Tr/Search?Q=Biyoekonomi&Source)

141
KAYNAKÇA
Bayramoğlu, Z, Tekin, M, Ağızan, K. (2018). Türkiye’de Biyoekonomi
Girişimciliğinin Tarımdaki Önemi. Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi
Tarım ve Doğa Dergisi, 21, 227-236. DOI: 10.18016/ksutarimdoga.vi.472161
Canadian Agriculture and the Bio-Economy – Solutions to Consumer Trends
February 9th, 2005.
EU-Russia Symposium on S&T Co-operationin Biotechnology, Moscow 14-15
March 2005.
Industrial or White Biotechnology (A Driver of Sustainable Growth in Europe).
Working Document from EuropaBio and ESAB. A Policy Agenda for
Europe 2006.
Kolankaya, N., Ünal, A., (1996). Genel Mikrobiyoloji Ders Notları I-II. Hacettepe
Üniversitesi.
Life Scieces and biotechnology, 2002. Luxemburg Office for Official Puplications
of the European Comminities,
Madigan, M. T., Martingo, J., (2009). Brock Mikroorganizmaların Biyolojisi. Palme
Yayıncılık. ISBN: 6055829629.
Meadows, H. D. (1990). Ekonomik Büyümenin Sınırları, Çev. Kemal Tosun ve
diğerleri, İşletme İktisadı Enstitüsü Yayını No.112, İstanbul.
New perspectives on the Knowledge-Based Bio-Economy Conference report EU
Commission. 2005.
OECD (2009). The bioeconomy to 2030: designing a policy agend. OECD
Publishing, 322s.
Oğuz C, Bayramoğlu, Z. (2018). Tarım Ekonomisi Kitabı, Atlas Kitapevi, 3.Baskı,
1-222.
Özçelik, S. (2019). Biyoteknoloji. Ankara: Bizimbüro Matbaacılık. ISBN:
978605895022.
Report on First Meeting of the Knowledge Based Bio-Economy KBBB-Net
Brussels,16 March, 2006.

142
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ
Stewart, C. N., (Ed.). (2008). Bitki Biyoteknolojisi ve Genetik: İlkeler, Teknikler ve
Uygulamalar. (Öktem, H. A. ve Yücel, M., 2016, Çev.) Ankara: Nobel
Akademik Yayıncılık. ISBN: 9786051331829.
The New Bioeconomy. Industrial and Environmental Biotechnology in Developing
Countries. Ad Hoc Expert Group Meeting Palais des Nations, Geneva 15–16
November 2001.
TOB (2017). http://www.tarim.gov.tr/Konular/MakroEkonomik-Gostergeler,
(Erişim tarihi: 04.09.2017).
Urry Lisa, A., Cain Michael L., Wasserman Steven, A., Minorsky Peter, V., Reece
Jane B., Campbell Neil, A. (2017). Campbell Biology, Eleventh Edition.
Ünal A., Çalışkan M., Şahin M., Bıyık E. and Kolankaya N. (2014).
“Biotechnology, Genetic Resources and Bio-Economy Related Activıties in
Turkey” Türk Bilimsel Derlemeler Dergisi 7 (1): 49-51, 2014 ISSN: 1308-
0040, E-ISSN: 2146-0132.
White Biotechnology: Gateway to a More Sustainable Future. F. Sijbesma,
Chairman EuropaBio, MB DSM Lyon, April 10, 2003.

143

144
TARIMSAL VE ENDÜSTRİYEL BİYOTEKNOLOJİ UYGULAMALARI -
BİYOEKONOMİ