Evaluación del sistema Brucellacapt ® para el diagnóstico serológico de la brucelosis humana en Cuba Evaluation of the system Brucellacapt ® for serological diagnosis of human brucellosis in Cuba

Abstract

Introducción:
En el diagnóstico microbiológico de la brucelosis, los métodos serológicos son los más utilizados. Brucellacapt® ofrece la ventaja de detectar en cualquier momento de la enfermedad anticuerpos aglutinantes y no aglutinantes contra Brucellaspp.

Objetivos:
Evaluar y aplicar el sistema serológico comercial Brucellacapt® para la detección de anticuerpos contra Brucella spp.

Métodos:
Se realizó una investigación en servicios y sistemas de tipo observacional con un estudio de caso control anidado, en el periodo de enero de 2015 a junio de 2016, en el Laboratorio Nacional de Referencia de Espiroquetas y Brucelas. Se evaluaron 50 sueros de casos y 100 de controles por Brucellacapt®. Se aplicó Brucellacapt® en 695 sueros de casos con sospecha clínica o epidemiológica de la enfermedad, los cuales fueron confirmados por ELISA.

Resultados:
Brucellacapt® mostró 100 % de sensibilidad, 83 % de especificidad, 54,6 % de reactividad y 16,4 % de positividad en las muestras estudiadas. Se confirmó por ELISA la presencia de anticuerpos IgM (21, 2 %), IgG (6,1 %) e IgM + IgG (7,6 %). Doscientas cuarenta y seis muestras y otras siete fueron reactivas y positivas respectivamente, solo por Brucellacapt®.

Conclusiones:
Brucellacapt® contribuyó a la detección de anticuerpos en los sueros de pacientes sospechosos de la enfermedad con valores aceptables de sensibilidad y especificidad diagnóstica. Este resultado sugiere su implementación en la red nacional de laboratorios cubanos para fortalecer el diagnóstico y la vigilancia de la brucelosis humana en Cuba.

Full text

Rev Cubana de Medicina Tropical Vol 71, No 1 (2019)
Artículo Original
Evaluación del sistema Brucellacapt® para el diagnóstico
serológico de la brucelosis humana en Cuba
Evaluation of the system Brucellacapt® for serological diagnosis of human
brucellosis in Cuba
Eduardo Echevarría Pérez1*
Ana Margarita Obregón Fuentes1
Yaindrys Rodríguez Olivera1
Odisney Lugo Suárez1
I Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Centro de Investigación, Diagnóstico y
Referencia. Laboratorio Nacional de Referencia de Leptospiras y Brucelas. Departamento
Bacteriología-Micología.
* Autor de la correspondencia. Correo electrónico: echevarria@ipk.sld.cu
RESUMEN
Introducción: En el diagnóstico microbiológico de la brucelosis, los métodos serológicos
son los más utilizados. Brucellacapt® ofrece la ventaja de detectar en cualquier momento de
la enfermedad anticuerpos aglutinantes y no aglutinantes contra Brucella spp.
Objetivos: Evaluar y aplicar el sistema serológico comercial Brucellacapt® para la detección
de anticuerpos contra Brucella spp.
Métodos: Se realizó una investigación en servicios y sistemas de tipo observacional con un
estudio de caso control anidado, en el periodo de enero de 2015 a junio de 2016, en el
Laboratorio Nacional de Referencia de Leptospiras y Brucelas. Se evaluaron 50 sueros de
casos y 100 de controles por Brucellacapt®. Se aplicó Brucellacapt® en 695 sueros de casos
con sospecha clínica o epidemiológica de la enfermedad, los cuales fueron confirmados por
ELISA.
Resultados: Brucellacapt® mostró 100 % de sensibilidad, 83 % de especificidad, 54,6 % de
reactividad y 16,4 % de positividad en las muestras estudiadas. Se confirmó por ELISA la
presencia de anticuerpos IgM (21,2 %), IgG (6,1 %) e IgM + IgG (7,6 %). Doscientas
cuarenta y seis muestras y otras siete fueron reactivas y positivas respectivamente, solo
por Brucellacapt®.
Conclusiones: Brucellacapt® contribuyó a la detección de anticuerpos en los sueros de
pacientes sospechosos de la enfermedad con valores aceptables de sensibilidad y
especificidad diagnóstica. Este resultado sugiere su implementación en la red nacional de
laboratorios cubanos para fortalecer el diagnóstico y la vigilancia de la brucelosis humana en
Cuba.
Palabras clave: brucelosis humana; Brucellacapt®.

ABSTRACT
Introduction: Serological methods are the most commonly used for the microbiological
diagnosis of brucellosis. Brucellacapt® has the advantage of detecting agglutinating and
non-agglutinating antibodies against Brucella spp. at any point in the evolution of the
disease.
Objective: Evaluate and apply the commercially available serological system Brucellacapt®
for detection of antibodies against Brucella spp.
Methods: A nested case-control observational study was conducted of services and
systems from January 2015 to June 2016 at the National Reference Laboratory for
Leptospira and Brucella. Evaluation was performed of 50 serum samples from cases and 100
from controls using Brucellacapt®. The system was also used in 695 serum samples from
clinically or epidemiologically suspected cases, which were confirmed by ELISA.
Results: Brucellacapt® showed 100 % sensitivity, 83% specificity, 54.6 % reactivity and
16.4% positivity in the samples studied. Presence of the following antibodies was confirmed
by ELISA: IgM (21.2 %), IgG (6.1 %) and IgM + IgG (7.6 %). Two hundred forty-six
samples and another seven were reactive and positive, respectively, only by Brucellacapt®.
Conclusions: Brucellacapt® contributed to antibody detection in serum samples from
suspected cases, with acceptable diagnostic sensitivity and specificity values. This result
suggests its implementation in the Cuban national network of laboratories to strengthen the
diagnosis and surveillance of human brucellosis in Cuba.
Keywords: human brucellosis; Brucellacapt®.
Recibido: 13/03/2018
Aceptado: 08/10/2018
INTRODUCCIÓN
El género Brucella produce una enfermedad infectocontagiosa conocida como brucelosis,
zoonosis trasmitida entre animales, incluyendo al humano. En la actualidad existen diez
especies reconocidas de brucelas. Las especies que afectan al hombre y a los animales
susceptibles son:Brucella melitensis, B. abortus, B. suis y B. canis.(1) La brucelosis tiene una
amplia distribución mundial, aparece en países mediterráneos de África y Europa, en el
Medio Oriente, Asia Central, la India, América Central y América del Sur.(2) En América
Latina, los países con mayor prevalencia son Argentina, México y Perú.(3)
La vía principal de transmisión de la enfermedad es la ingestión de productos lácteos y
cárnicos, así como de sus derivados. Los veterinarios, técnicos y obreros vinculados a la
manipulación de material biológico en salas de maternidad, ordeño y sacrificio de áreas
productivas, así como el personal de laboratorio, se consideran personal con riesgo
ocupacional. La brucelosis humana presenta manifestaciones clínicas muy polimorfas y
cursa en ocasiones de forma asintomática y crónica, lo que trae consigo las presentaciones
focalizadas (complicaciones) en los diferentes sistemas de órganos de la economía
humana.(4) Históricamente se notifican pocos casos de brucelosis humana en el mundo. En
el año 2012 se publica el primer caso de endocarditis infecciosa como complicación de la
enfermedad brucelar en Cuba.(5) Su diagnóstico se fundamenta en los hallazgos clínicos,
epidemiológicos y de laboratorio, en el que este último juega un papel primordial para su
confirmación.(6)

En 2011, se introduce el sistema serológico comercial Febrile Antigen Brucella (FAB, Diesse,
Italia)(7) para la pesquisa de anticuerpos aglutinantes contra brucelas, en la Red Nacional de
Laboratorios de Salud Pública Cubana. Esto permitió el rescate de la vigilancia de laboratorio
de la enfermedad a nivel nacional. Sin embargo, esta técnica solo es útil durante la forma
aguda de la enfermedad, pues a ella escapan casos crónicos, recidivantes y las
reinfecciones. De igual manera, se incorpora en el Laboratorio Nacional de Referencia de
Leptospiras y Brucelas (LNRLB), los sistemas ELISA IgM y ELISA IgG (Vircell Microbiologists,
España)(8) que posibilitan identificar si la muestra pertenece a un caso que cursa por el
periodo agudo (IgM) o el de cronicidad (IgG) de la enfermedad.(6)
En 2015, se recibe en el LNRLB el sistema serológico comercial Brucellacapt® (Vircell
Microbiologists, España).(8) El sistema Brucellacapt® es una técnica de inmunocaptura-
aglutinación para el diagnóstico de la brucelosis, que en un solo paso, de forma simple y
cómoda, permite detectar anticuerpos aglutinantes (IgA, IgG e IgM) y no aglutinantes (IgA
e IgG) contra Brucella spp. Este sistema fue presentado en 1997 para el diagnóstico de la
brucelosis humana, especialmente en su forma crónica. Además, para el estudio serológico
en sueros procedentes de animales, para diferenciar los anticuerpos vacunales de los que se
producen en animales enfermos.(9)
El sistema Brucellacapt® es un ensayo homólogo a la prueba de Coombs (inmunoglobulina
anti-humana). Esta técnica facilita la aglutinación de los anticuerpos aglutinantes y no
aglutinantes del suero con la suspensión antigénica de lipopolisacárido (LPS) de B. abortus.
Sin embargo, resulta muy compleja y laboriosa.(10) Por estas razones, muy pocos
laboratorios la realizan de forma habitual. Esta técnica al emplear LPS como antígeno puede
dar lugar a reacciones cruzadas en sueros de pacientes infestados con bacterias que
presentan LPS, específicamente del epítope O, como son Yersinia enterocolitica
09,Escherichia coli O:157, Salmonella O:30, Stenotrophomonas maltophilia y Vibrio
cholerae O:1, entre otras.(11)
Dada la necesidad de continuar fortaleciendo el diagnóstico serológico de la brucelosis
humana en Cuba, en la presente investigación se trazaron como objetivos evaluar y aplicar
el sistema serológico comercial Brucellacapt® para la detección de anticuerpos contra
Brucella spp.
MÉTODOS
Se realizó una investigación en servicios y sistemas de tipo observacional con un estudio de
caso control anidado en el LNRLB, en el período comprendido desde enero de 2015 a junio
de 2016.
Muestras clínicas
Grupo I (casos): 50 sueros de pacientes con brucelosis confirmada mediante elementos
clínicos, epidemiológicos y presencia de marcadores séricos determinados por ELISA IgM y
ELISA IgG (Vircell Microbiologists, España).(8)

Grupo II (controles): 55 sueros de "individuos sanos" donantes de sangre y 45 sueros de
pacientes con otras enfermedades conocidas, miembros del grupo sindrómico, de ellos cinco
con dengue, diez con Citomegalovirus (CMV), cinco con virus herpes simple (HVS), tres con
Virus Epstein Bar (EBV), seis con hepatitis: cuatro de A (VHA) y dos de E (VHE), ocho con
leptospirosis y toxoplasmosis respectivamente. Todos los sueros no tenían anticuerpos
contra Brucella spp., mediante los ELISA IgM y ELISA IgG (Vircell Microbiologists,
España).(8)
Grupo III: 695 sueros de casos sospechosos de brucelosis procedentes de zonas con alta
focalidad animal y grupos de riesgo, remitidos al LNRLB desde instituciones del Sistema
Nacional de Salud de Cuba.
Procedimientos
El sistema Brucellacapt® consta de tiras de pocillos de fondo en U que contienen
inmunoglobulinas antihumanas. Tras la adición de los sueros y su dilución se añade el
antígeno y se incuba 24 h. En la presente investigación se realizó el procedimiento de
ensayo y la lectura e interpretación de los resultados según los criterios del fabricante. Los
sueros con títulos desde 40 y hasta 160 se consideraron reactivos a brucelosis, los que
mostraron títulos iguales o superiores a 320 fueron positivos con alto valor diagnóstico.(8)
Se aplicó las técnicas de referencia ELISA IgM y ELISA IgG para la confirmación de la
infección en las muestras estudiadas.(6,8)
Análisis estadístico
Los resultados se tabularon en una base de datos de Excel, diseñada al efecto. Se calculó
las frecuencias absolutas y los porcentajes. Además, se calculó mediante Epidat 3.1, los
indicadores de desempeño: sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo,
el índice de concordancia o validez, el índice de Youden, así como la razón de verosimilitud
positiva y negativa, con un intervalo de confianza (IC) del 95 % y el valor de p≤ 0,05.
RESULTADOS
El sistema serológico comercial Brucellacapt® demostró la presencia de anticuerpos contra
Brucella spp., en el 100 % (50/50) de los sueros del grupo I, de los cuales el 58 % (29/50)
resultó reactivo y el 42 % (21/50) positivo.
El 17 % (17/100) de los sueros del grupo II resultó reactivo. De ellos seis correspondientes
a donantes de sangre supuestamente sanos, cinco a pacientes con diagnóstico de
leptospirosis, tres de toxoplasmosis y uno en cada caso de dengue, CMV y VHA. En estos
casos los títulos de anticuerpos detectados fluctuaron entre 40 y 80, los que se consideran
bajos.
El sistema Brucellacapt® presentó sensibilidad del 100 %, especificidad del 83 %, índice de
validez 88,67 %, valor predictivo positivo y negativo del 74,63 % y 100 %,
respectivamente. Por otra parte, el índice de Youden fue de 0,83 % y la razón de
verosimilitud positiva fue de 5,88 %.

En la tabla se muestran los títulos de anticuerpos detectados por el sistema serológico
comercial Brucellacapt® y su confirmación por los sistemas ELISAs de referencia en los
sueros del grupo III. El 54,6 % (380/695) presentó títulos de 40 y hasta 160, en tanto en el
16,4 % (114/695) los títulos fueron iguales o superiores a 320.
Los sistemas ELISAs confirman 35,1 % (244/695) de las muestras de suero reactivas,
positivas y tres no reactivas por el sistema comercial en evaluación. En las muestras
reactivas se identificó en el 14,8 %; 3,4 % y 1 % anticuerpos circulantes de la clase IgM,
IgG e IgM + IgG, respectivamente. Mientras que en las muestras positivas se identificó IgM
en 6 %; IgG en 2,7 % e IgM + IgG en 6,6 %. Se obtuvieron resultados dudosos en el 5,8 %
(41/695) para el ELISA IgM y en el 1% (7/695) para el ELISA IgG. Por otra parte, en el
36,4 % (253/695) de las muestras reactivas y positivas por Brucellacapt® no fue posible
identificar el isotopo de inmunoglobulina circulante en el paciente.
DISCUSIÓN
En la práctica habitual de los laboratorios de diagnóstico serológico de brucelosis se
establecen los sistemas de pesquisa de anticuerpos mediante la implementación de métodos
rápidos, sencillos y sensibles como los sistemas de aglutinación. Estos sistemas son de
mayor aceptación por mostrar mejores resultados durante la fase aguda de la enfermedad
ya que detectan el isotopo IgM, índice de infección aguda y por resultar más económicos.
Sin embargo, la detección de IgA e IgG no resulta posible debido al bajo poder aglutinante o
no aglutinante de estas moléculas, lo que constituye la limitante fundamental de su uso, al
no reconocer el estado de cronicidad, las recidivas ni las reinfecciones por Brucella spp.(12,13)
La producción de anticuerpos incompletos, de forma no constantes y durante cualquier fase
clínica de la enfermedad (aguda, subaguda y crónica), implica la necesidad de contar con
sistemas de laboratorio que posibiliten su hallazgo de forma rápida y precisa.(14) Es por eso
que además del FAB, el ELISA IgM y el ELISA IgG, disponer de Brucellacapt® representa una
oportunidad para el diagnóstico y seguimiento de los pacientes cubanos.(15)

Los indicadores de desempeño alcanzados en esta investigación son aceptables y coinciden
con trabajos publicados, los que oscilan entre el 74 y 100 % de sensibilidad y entre el 59 %
y 98 % de especificidad.(16,17)
A nivel mundial existen bajos porcentajes de reacciones cruzadas mediante el Brucellacapt®
con enfermedades tales como tuberculosis, salmonelosis, yersiniosis y la tularemia.(16) En
Cuba, no se vigilan serológicamente estas enfermedades, por lo que resulta difícil la
comparación con ellas.
Aunque actualmente no se conoce el comportamiento de la brucelosis humana y animal en
Cuba, existen notificaciones del Sistema de Información y Vigilancia Epizootiológica en el
Instituto de Medicina Veterinaria que establecen el grado de afectación por brucelosis en
entidades ganaderas, fundamentalmente en bovinos.(18)
Por tanto, la detección de títulos bajos de anticuerpos en las muestras de pacientes con
otras enfermedades pudo ser consecuencia de una sensibilización tras el contacto con el
microorganismo, además de la enfermedad actual. Por otra parte, la literatura consultada
plantea que individuos que residen en zonas con alta focalidad, endémicas o que practican
la crianza de determinadas especies de animales pueden presentar estos títulos.(16)
Los sistemas ELISAs para brucelas, pueden detectar inmunoglobulinas específicas con alta
sensibilidad y especificidad, en estrecha relación con la naturaleza del antígeno empleado.
La aplicación de ellos demuestra la posibilidad de diagnosticar la infección por Brucella spp.,
incluso en etapas muy tempranas en los que la serología convencional aún no muestra
resultados positivos e incluso nunca se hace positiva.(19,13,16)
La obtención de resultados dudosos mediante los ELISAs, puede estar ocasionada por la
incapacidad del sistema inmune del huésped de expresar su respuesta a la infección. En
tanto, otros individuos pueden haber recibido antibioticoterapia en una o más ocasiones, lo
que afecta la producción de anticuerpos. Ante esta disyuntiva se hace necesario solicitar
otra muestra al paciente y repetir el ensayo.(8) La no disponibilidad de un sistema ELISA que
determine IgA, hizo quizás que no se pudiese identificar este isótopo en las muestras
reactivas y positivas por Brucellacapt®.
Resulta difícil seleccionar una herramienta diagnóstica como prueba de oro para la
confirmación serológica en la brucelosis. Esto hace necesario la evaluación integral de los
resultados de las pruebas de laboratorio disponible (FAB, Brucellacapt®, ELISA IgM y ELISA
IgG) junto a la clínica y epidemiología del paciente a la hora de establecer un diagnóstico
certero.(17,19)
Por otra parte, las pruebas moleculares para la detección de ADN de Brucella spp., se
desarrollan desde 1990. En 2015 se evaluó e implementó en el LNRLB una PCR sensible,
específica y rápida que permite la detección de la proteína inmunogénica de membrana
externa de 31 kDa que está presente en todas las especies de Brucella (BCSP 31)
(B4B5).(20) Esta prueba molecular se emplea en el estudio de casos clínicos seronegativos
como herramienta alternativa.

El cultivo y el diagnóstico convencional de Brucella requieren de laboratorios con nivel de
contención 3. Esta limitante hace que las herramientas serológicas para la detección de
anticuerpos específicos sean indispensables para la detección oportuna de la infección y
evitar con esto tanto las complicaciones irreversibles como el deterioro de la calidad de vida
de los pacientes afectados. De otra parte, los resultados negativos de estas pruebas no
excluyen la infección por Brucella spp., lo que demanda de una evaluación clínica y
epidemiológica exhaustiva en cada caso.(16)
La generalidad de los sistemas serológicos tradicionales comerciales y caseros tienen la
limitante de estar constituidos por antígenos genéricos y específicos, presentes en las cepas
rugosas de las diferentes especies de brucelas, escapándose en este sentido B. canis (cepa
lisa). Por ello, para el diagnóstico de esta especie, en particular, existen sistemas
serológicos y moleculares.(11)
La coincidencia entre los resultados obtenidos por el Brucellacapt® y los sistemas de
referencia ELISA IgM y ELISA IgG, demuestran que el primero constituye una herramienta
útil para el diagnóstico de la brucelosis tanto aguda como crónica. Estudios internacionales
que incluyen un mayor número de sueros indican resultados aun superiores,.(15,17,19) La
incorporación de este sistema al algoritmo de diagnóstico de la brucelosis humana en Cuba,
fortalecerá la vigilancia al permitir la detección de casos que cursan por la fase de
cronicidad de la enfermedad, la recaída o la reinfección.
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Conflicto de intereses
Los autores no declaran conflicto de intereses.