Content uploaded by Olga Leonidovna Nosareva
Author content
All content in this area was uploaded by Olga Leonidovna Nosareva on May 01, 2019
Content may be subject to copyright.
РОССИЙСКИЙ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ им. И.М. СЕЧЕНОВА 2019, том 105,
№ 3, с. 327–338
РОЛЬ РЕДОКС-СТАТУСА И ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ
БЕЛКОВ В РЕАЛИЗАЦИИ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ
ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ
© 2019 г. О. Л. Носарева1, *, Е. А. Степовая1, Е. В. Шахристова1, О. Н. Алексеева1,
Д. И. Кузьменко1, А. А. Садыкова1, В. В. Новицкий1
1Сибирский государственный медицинский университет, Томск, Россия
*Е-mail: olnosareva@yandex.ru
Поступила в редакцию 12.09.2018 г.
После доработки 29.12.2018 г.
Принята к публикации 29.12.2018 г.
В статье представлены данные, характеризующие уровень активных форм кисло-
рода, необратимой и обратимой окислительной модификации белков, состояние
компонентов системы глутатиона и активность каталазы, реализацию апоптоза в
интактных лимфоцитах крови. Методом моделирования окислительного стресса
in vitro исследовано влияние пероксида водорода в конечной концентрации 0.5 мМ
на реализацию апоптоза; проведена оценка вклада компонентов системы глута-
тиона, необратимой и обратимой окислительной модификации белков в молеку-
лярные механизмы клеточной гибели лимфоцитов крови. Показано, что апопто-
тический тип гибели лимфоцитов крови при экспериментальном окислительном
стрессе характеризовался активированием глутатионилирования и карбонили-
рования протеинов. Представленные данные доказывают, что молекулы белков
являются потенциальными редокс-зависимыми мишенями для регуляции кле-
точного метаболизма лимфоцитов крови.
Ключевые слова: лимфоциты крови, редокс-статус клетки, окислительный стресс,
антиоксидантная система, окислительная модификация белков, апоптоз
DOI: 10.1134/S0869813919030063
В норме метаболизм клеток во многом зависит от редокс-баланса, который в свою
очередь определяется соотношением и активностью компонентов про- и антиокси-
дантной систем.
Неотъемлемой частью патогенеза многих заболеваний, таких как нейродегене-
ративные, онкологические, воспалительные, аутоиммунные, сердечно-сосудистые
и др., являются процессы свободно-радикального окисления. Они лежат в основе
внутриклеточного метаболизма и оказывают влияние на функцию клеток организма, в
том числе лимфоцитов крови [1, 2]. Лимфоциты, являясь компонентами иммун-
ной системы, участвуют в регуляции обмена веществ целостного организма. От ме-
таболического состояния этих клеток зависит специфическая иммунореактив-
ность, естественная резистентность и координированное взаимодействие клеточ-
ных элементов сложноорганизованной иерархической системы организма.
Лимфоциты крови находятся в постоянном контакте с другими клетками и тканями,
занимают ведущую позицию в защите организма от различных агрессивных факторов и
одними из первых взаимодействуют с чужеродными агентами, в результате чего
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
328 НОСАРЕВА и др.
может происходить активация свободно-радикальных процессов. Однако продук-
ция активных форм кислорода стимулируется не только в ответ на внешнее воз-
действие, но и является частью механизма внутриклеточной сигнализации [3, 4].
Необходимо учитывать, что активные кислородные метаболиты с одной стороны
обладают высокой цитотоксичностью, с другой – могут выступать регуляторами
активности биомолекул в клетках [5–7]. Наиболее чувствительными к усилению
процессов свободно-радикального окисления и основными акцепторами актив-
ных форм кислорода являются белки [8]. В результате взаимодействия активных
форм кислорода с протеинами возникает как обратимая, так и необратимая окис-
лительная модификация этих молекул [9–11]. Конформационные изменения белков
являются основополагающими в функционировании рецепторов, мембранных
транспортных систем, изменении скорости биохимических реакций, регуляции фаз
клеточного цикла, транскрипции, репликации, гибели клеток и других процессах.
В поддержании уровня активных форм кислорода в клетке и снижении их де-
структивного действия на макромолекулы участвует антиоксидантная система, со-
стоящая из неферментативного и ферментативного звена [5, 12]. Поэтому актуальным
является установление роли компонентов антиоксидантной системы и редокс-чув-
ствительных белков в регуляции пролиферации и апоптоза при развитии свобод-
но-радикальных патологических процессов с участием иммунокомпетентных клеток.
Цель работы – установить роль окислительной модификации белков и измене-
ния редокс-статуса в реализации апоптоза лимфоцитов крови человека в норме и
при экспериментальном окислительном стрессе.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования явились лимфоциты, выделенные из фракции моно-
нуклеарных лейкоцитов у здоровых лиц (21 мужчины и 19 женщин в возрасте от 20
до 45 лет, протокол заседания этического комитета ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава
России № 4267 от 21.09.2015 г.) – интактные клетки, которые получали из венозной
крови при катетеризации локтевой вены утром натощак с использованием ваку-
тейнеров “Becton Dickinson Vacutainer™” (США), содержащих антикоагулянт – ге-
парин натрия (25 Ед/мл).
Выделение мононуклеарных лейкоцитов из венозной крови проводили в сте-
рильных условиях методом градиентного центрифугирования с помощью Ficoll-
Paque (“Sigma-Aldrich”, США) (ρ = 1.077 г/см3) [13], а затем лимфоцитов – на гра-
диенте Перколла (“Sigma-Aldrich”, США) (ρ = 1.130 г/см3) [14]. Жизнеспособность
лимфоцитов крови оценивали микроскопически с помощью 0.4%-ного раствора
трипанового синего (“Serva”, США). Для постановки эксперимента была исполь-
зована культура клеток, содержащая более 95% живых клеток.
Для моделирования окислительного стресса, выделенные лимфоциты крови
(клеточная суспензия в концентрации до 4 × 106 клеток на 1 мл) инкубировали в
питательной среде, состоящей из 90% RPMI-1640 (“Вектор-Бест”, Россия), 10%
эмбриональной телячьей сыворотки (“Invitrogen”, США), подвергнутой инактива-
ции в течение 30 мин при температуре 56°С, 2 мМ Hepes (“Flow”, Великобритания),
гентамицина (100 мкг/мл) (“KRKA”, Словения), L-глутамина (0.3 мг/мл) (“Век-
тор-Бест”, Россия) и пероксида водорода в конечной концентрации 0.5 мМ, в по-
луоткрытой системе при температуре 37°С и 5% СО2 в течение 18 ч, соблюдая сте-
рильные условия.
После инкубации лимфоциты крови трижды отмывали 0.01 М натрий-фосфатным
буфером (рН = 7.4) (“Amresco”, США) и использовали для определения содержа-
ния активных форм кислорода, в том числе и гидроксильного радикала, числа ан-
нексин V-положительных клеток, либо ресуспендировали в буфере с добавлением
329
РОЛЬ РЕДОКС-СТАТУСА И ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ...
1% тритона X-100 (“Panreac”, Испания) при 0°С и готовили лизат с сохранением
стандартной концентрации клеток для определения уровня общего белка, SH-групп
протеинов, карбонильных производных белков и активности каспазы-3, глутати-
онредуктазы, каталазы, глутатионпероксидазы. Для определения содержания вос-
становленного, окисленного и связанного с белками глутатиона лизат лимфоцитов
крови депротеинизировали с помощью 5%-ного раствора сульфосалициловой кислоты.
Концентрацию внутриклеточных активных форм кислорода определяли мето-
дом проточной цитометрии по уровню свечения 2,7-дихлорфлюоресцеина на клетку,
который образовался после взаимодействия полярного производного 2,7-дихлор-
флюоресцеин-диацетата (“Sigma-Aldrich”, США) с липидными пероксидами и
Н2О2 [15]. Результаты представляли в усл. ед.
Содержание гидроксильного радикала внутри клетки определяли спектрофото-
метрически по способности этого радикала (после предварительной опсонизации
клеток зимозаном (“Sigma-Aldrich”, США)) разрушать модельный субстрат – 2-дезок-
си-D-рибозу (“Sigma-Aldrich”, США) с образованием продукта реакции, имеюще-
го максимум поглощения при 532 нм [16]. Результаты выражали в нмоль/мг белка в
пробе.
Количество апоптозных клеток оценивали методом проточной цитометрии с ис-
пользованием FITC-меченного аннексина V, специфически взаимодействующего с
фосфатидилсерином, и с применением пропидия йодида (РI), способного интерка-
лировать с молекулой ДНК, согласно протоколу фирмы производителя (“ANNEXIN
V FITC Kit” “TREVIGEN”, США). Количество FITC-положительных/PI-отрицатель-
ных- и FITC-положительных/PI-положительных-меченных клеток оценивали к обще-
му числу изучаемых клеток и выражали в процентах.
Активность каспазы-3 (КФ 3.4.22.56) определяли спектрофлуориметрическим
методом путем гидролиза N-ацетил-(Асп-Глу-Вал-Асп)-7-амино-4-метилкумари-
на (“Sigma-Aldrich”, США) с образованием флуоресцирующего продукта – амино-
4-метилкумарина, обладающего флюоресценцией при 430–460 нм (максимум воз-
буждения флуоресценции = 380 нм). Активность фермента выражали в пмоль/мин мг
белка в пробе [17, 18].
Внутриклеточную концентрацию восстановленного и окисленного глутатиона
определяли спектрофотометрически – методом каталитической рециркуляции и
блокирования SH-групп трипептида 2-винилпиридином (“Wako”, Япония) с даль-
нейшим взаимодействием глутатиона с 5,5'-дитио-бис(2-нитробензойной) кисло-
той (“Sigma-Aldrich”, США) и образованием продукта реакции с характерным мак-
симумом поглощения при 412 нм [19]. Полученные результаты выражали в
нмоль/мг белка, дополнительно вычисляя показатель редокс-статуса клетки – ве-
личину соотношения восстановленного к окисленному глутатиону.
Спектрофотометрическим методом, описанным выше, оценивали внутрикле-
точное содержание уровня связанного с белками глутатиона, предварительно вы-
свобождая его из связи с белками с помощью 1%-ного раствора боргидрида натрия
(“Sigma-Aldrich”, США) [20]. Концентрацию SH-групп протеинов определяли по
способности реагирования тиоловых соединений с 5,5'-дитио-бис(2-нитробензой-
ной) кислотой спектрофотометрическим методом, описанным ранее [20]. Резуль-
таты представляли в нмоль/мг белка в пробе.
Активность глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2) определяли спектрофотометриче-
ским методом, описанным ранее, по НАДФН-зависимому восстановлению окис-
ленной формы глутатиона (“Sigma-Aldrich”, США) и последующем ее взаимодей-
ствии с 5,5'-дитио-бис(2-нитробензойной) кислотой [21]. Полученные результаты
активности энзима выражали в нмоль/мин мг белка в пробе.
Активность глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9) оценивали спектрофотометри-
ческим методом по способности катализа реакции восстановленного глутатиона
330 НОСАРЕВА и др.
(“Sigma-Aldrich”, США) с гидроперекисью трет-бутила (“Sigma-Aldrich”, США)
[22]. Активность фермента представляли в мкмоль/мин мг белка в пробе.
Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли спектрофотометрическим мето-
дом по способности, не разрушенной в ходе реакции Н2О2, образовывать с молиб-
датом аммония стойкий окрашенный комплекс, имеющий максимум поглощения
при 410 нм [23]. Активность фермента выражали в нкат/мг белка в пробе.
Содержание карбонильных производных белков оценивали по реакции взаимо-
действия с 2,4-динитрофенилгидразином методом иммуноферментного анализа, с
использованием набора “Carbonyl Proteine ELISA Kit” (“Immundiagnostik AG”,
Германия) согласно инструкции фирмы-производителя. Результаты представляли
в нмоль/мг белка в пробе.
Внутриклеточную концентрацию белка оценивали спектрофотометрически с
помощью метода, основанного на взаимодействии аминокислотных остатков ли-
зина и аргинина с красителем – бриллиантовым голубым G-250 (“Sigma-Aldrich”,
США) (максимум поглощения при 595 нм) [24].
Полученные результаты подвергали статистической обработке с помощью про-
граммы Statistica 6.0. Используя критерий Шапиро–Уилки, проверяли нормаль-
ность распределения количественных показателей. Для оценки достоверности раз-
личий независимых выборок использовали непараметрический критерий Манна–Уит-
ни. Полученные данные выражали в виде медианы (Ме), верхнего и нижнего
квартилей (Q1–Q3). Методом корреляционного анализа определяли наличие связи
между количественными показателями, исчисляя коэффициент ранговой корре-
ляции Спирмена. Статистически значимыми считались различия при р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Анализ полученных данных в интактных лимфоцитах крови позволил устано-
вить участие окислительной модификации белков и изменения редокс-статуса в
реализации апоптоза.
При анализе и сопоставлении полученных данных в интактных лимфоцитах
крови нами были установлены корреляции между содержанием активных форм
кислорода и восстановленным глутатионом (r = –0.57; р < 0.05), концентрацией
карбонильных производных протеинов и числом аннексин V-положительных кле-
ток (r = +0.61; р < 0.05).
При инкубации лимфоцитов крови с добавлением пероксида водорода в конеч-
ной концентрации 0.5 мМ было получено статистически значимое увеличение
концентрации активных форм кислорода, определяемых с помощью 2,7-дихлор-
флуоресцеина, в 6.8 раза (р < 0.05), а гидроксильного радикала в 2.8 раза (р < 0.05)
по сравнению с интактными клетками (рис. 1).
При оценке показателей, характеризующих степень выраженности и завершен-
ности апоптоза, нами было установлено увеличение числа аннексин V-положи-
тельных лимфоцитов крови в 2.9 раза (р <0.05) и активности каспазы-3 в 2.1 раза (р < 0.05)
по сравнению с аналогичными результатами в интактных клетках (рис. 2).
Величина соотношения восстановленного к окисленному глутатиону, характе-
ризующая редокс-статус лимфоцитов крови в условиях моделирования окисли-
тельного стресса in vitro, была выше в 1.7 раза (р < 0.05) по сравнению с интактны-
ми клетками. Возрастание этого показателя было обусловлено увеличением содер-
жания восстановленной формы тиола в 2.8 раза (р < 0.05), а окисленной формы
всего в 1.5 раза (р < 0.05) по сравнению с изучаемыми показателями в интактных
клетках (табл. 1).
Наряду с этим отмечено увеличение активности глутатионпероксидазы на фоне
сопоставимой активности глутатионредуктазы в лимфоцитах крови при моделиро-
331
РОЛЬ РЕДОКС-СТАТУСА И ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ...
вании окислительного стресса. Так, при внесении Н2О2 в конечной концентрации
0.5 мМ в среду инкубации лимфоцитов крови возрастание активности глутатион-
пероксидазы составило в 1.6 раза (р < 0.05) относительно значений активности
фермента в интактных лимфоцитах крови (табл. 1). При изучении каталазной ак-
тивности было установлено, что индукция окислительного стресса in vitro в лимфо-
цитах крови характеризовалась увеличением активности фермента в 4.8 раза (р < 0.05) по
сравнению с показателем в интактных лимфоцитах крови (табл. 2).
Рис. 1. Содержание активных форм кислорода (n = 6) методом проточной цитометрии и гидроксильного
радикала (n = 10) в интактных лимфоцитах крови (контроль) и при окислительном стрессе in vitro (0.5 мМ
Н2О2), Mе (Q1–Q3).
р – уровень значимости различий по сравнению с интактными лимфоцитами крови.
0
0.5
1.0
2.0
1.5
0
50
100
200
150
Контроль 0.5 мМ H2O2
p < 0.05
p < 0.05
АФК, усл. ед. ( )
Гидроксильный радикал,
нмоль/мг белка ( )
Рис. 2. Активность каспазы-3 (n = 6) и количество аннексин V-положительных (n = 6) интактных лим-
фоцитов крови (контроль) и при окислительном стрессе in vitro (0.5 мМ Н2О2), Mе (Q1–Q3).
р – уровень значимости различий по сравнению с интактными лимфоцитами крови.
0
50
100
250
200
150
0
2
4
8
6
Контроль 0.5 мМ H2O2
p < 0.05
p < 0.05
Каспаза-3,
пмоль мин/мг белка ( )
Аннексин V-положительные
клетки, %( )
332 НОСАРЕВА и др.
Формирование окислительного стресса в лимфоцитах крови сопровождалось
снижением концентрации SH-групп протеинов в 8.6 раза (р < 0.05) по сравнению с
результатом в интактных клетках (табл. 2).
Влияние пероксида водорода в конечной концентрации 0.5 мМ в лимфоцитах
крови характеризовалось возрастанием содержания обратимо и необратимо моди-
фицированных производных протеинов. Так, в лимфоцитах крови при моделиро-
вании окислительного стресса in vitro концентрация связанного с белками глутати-
она была увеличена в 2.8 раза (р < 0.05), а содержание карбонильных производных
белков в 2.4 раза (р < 0.05) было выше относительно показателей, полученных в ин-
тактных лимфоцитах крови (табл. 2).
Таблица 1. Содержание восстановленного, окисленного глутатиона, величина их соотношения,
активность глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы в интактных лимфоцитах крови и в
условиях окислительного стресса in vitro, Mе (Q1–Q3)
Примечание. р – уровень значимости различий по сравнению с интактными лимфоцитами крови.
Группы
Показатель
восстановленный
глутатион, нмоль/мг
белка
окисленный
глутатион,
нмоль/мг белка
восстановленный
глутатион/окисленный
глутатион
глутатионредуктаза,
нмоль/мин мг белка
глутатионпероксидаза,
мкмоль/мин мг белка
Лимфоциты n = 6 n = 6 n = 6 n = 10 n = 10
0.75 0.11 7.17 312.80 5.68
(0.74–0.88) (0.10–0.11) (6.52–8.00) (287.08–321.70) (5.06–7.00)
Лимфоциты + 0.5 мМ
Н2О2
n = 6 n = 6 n = 6 n = 10 n = 10
2.08 0.17 12.42 277.56 9.28
(1.52–2.16) (0.15–0.17) (10.71–12.78) (213.36–353.95) (7.95–10.22)
р < 0.05 р < 0.05 р < 0.05 р > 0.05 р < 0.05
Таблица 2. Содержание SH-групп, карбонильных производных протеинов, связанного с
белками глутатиона и активность каталазы в интактных лимфоцитах крови и в условиях
окислительного стресса in vitro, Mе (Q1–Q3)
Примечание. р – уровень значимости различий по сравнению с интактными лимфоцитами крови.
Группы
Показатель
белок-SH,
нмоль/мг белка
связанный
с белками
глутатион,
нмоль/мг белка
карбонильные
производные
белков,
нмоль/мг белка
каталаза,
нкат/мг белка
Лимфоциты n = 6 n = 6 n = 6 n = 10
2.84 (1.79–2.94) 0.05 (0.04–0.06) 0.149 (0.142–0.151) 6.76 (6.44–9.90)
Лимфоциты +
+0.5 мМ Н
2О2
n = 6 n = 6 n = 6 n = 10
0.33 (0.28–0.38) 0.14 (0.13–0.15) 0.359 (0.354–0.362) 32.55 (22.10–35.02)
р < 0.05 р < 0.05 р < 0.05 р < 0.05
333
РОЛЬ РЕДОКС-СТАТУСА И ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ...
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Свободно-радикальные реакции являются активными участниками физиологи-
ческих процессов во всех клетках организма. C позиции протекания этих процес-
сов особый интерес представляют эффекторные клетки крови, а именно лимфоци-
ты. От редокс-статуса лимфоцитов крови зависит не только их функциональная
активность, участие в межклеточных взаимодействиях, регулирующих гомеостаз
организма, но и протекание внутриклеточных процессов, определяющих реализа-
цию и регуляцию клеточной гибели. Поэтому выяснение молекулярных механиз-
мов участия активных форм кислорода и окислительно-модифицированных моле-
кул в нарушении регуляции апоптоза лимфоцитов крови является актуальным с
позиции уточнения патогенеза опухолевого роста, аутоиммунных реакций, воспа-
лительных процессов и т.д., протекающих с участием этих клеток.
Добавление Н2О2 в конечной концентрации 0.5 мМ в среду инкубации лимфо-
цитов крови вызывает окислительный стресс, сопровождающийся преимуще-
ственно апоптотическим типом гибели клеток, что позволило использовать эту мо-
дель для достижения цели исследования. Проводимые исследования на клеточных
моделях, имеют неоспоримую ценность, так как позволяют установить взаимосвязи
между теорией и практикой в медицинской науке, способствуют выявлению моле-
кулярных механизмов участия внутриклеточных систем в формировании различных
патологий и исключить многие неспецифические факторы, сопровождающие ре-
докс-модуляцию in vivo. Апоптотический тип гибели является физиологическим ме-
ханизмом элиминации клеток, имеющих нарушенную функцию и дефектные ре-
цепторы. Однако при срыве регуляторных механизмов наблюдается патологиче-
ское стимулирование или ингибирование этого процесса.
Активация окислительных процессов в лимфоцитах крови с помощью добавле-
ния 0.5 мМ пероксида водорода сопровождалась изменением редокс-статуса, мо-
дификацией и повреждением белков, участвующих в регуляции метаболизма этих
клеток, на фоне запуска апоптотической гибели, выражающейся в увеличении
числа аннексин V-положительных клеток и активности каспазы-3.
Одной из самых мощных систем, поддерживающих редокс-статус клетки явля-
ется система глутатиона. Восстановленный глутатион является участником внут-
риклеточной сигнальной трансдукции, редокс-регулятором активности транскрип-
ционных факторов и экспрессии генов, а также сильным акцептором синглетного
кислорода и гидроксильного радикала, тем самым, снижая цитотоксическое и по-
вреждающее действие активных форм кислорода [25–28]. Участие глутатиона в ре-
докс-регулировании опосредовано через образование дисульфидных связей между
окисленной формой трипептида и SH-групп белков [29].
При инкубации с 0.5 мМ пероксидом водорода отмечено изменение редокс-ста-
туса лимфоцитов крови за счет увеличения восстановленной фракции глутатиона.
В указанных условиях инкубации, вероятнее всего, это связано с увеличением ско-
рости цитозольного синтеза тиола de novo с участием γ-глутамилцистеинсинтетазы.
Глутатион является низкомолекулярным тиолом и представляет собой важный
компонент неферментативной, легко мобилизуемой системы удаления активных
форм кислорода в качестве донора протонов, в результате чего образуется окислен-
ный глутатион. Окисленный глутатион, как известно, для клетки является токсич-
ным, высокореакционным соединением и активно конвертируется обратно в восста-
новленную форму ферментом глутатионредуктазой. Для обеспечения внутриклеточ-
ного окислительно-восстановительного баланса и восстановления дисульфидных
связей в протеинах необходима постоянная редукция окисленных компонентов системы
глутатиона [30]. В лимфоцитах крови действие Н2О2 в конечной концентрации 0.5 мМ ха-
рактеризовалось повышением содержания окисленной формы трипептида, что,
334 НОСАРЕВА и др.
вероятнее всего, есть следствие не только воздействия агрессивного для клетки
агента, но и активации глутатионпероксидазы, использующей восстановленный
глутатион в качестве субстрата реакции. Активность глутатионредуктазы, превра-
щающей окисленный глутатион в восстановленный, не различалась достоверно
при сравнении результатов, полученных в лимфоцитах крови при индукции перок-
сидом водорода окислительного стресса и в интактных клетках. Кроме этого, при
моделировании окислительного стресса нами была отмечена тенденция к сниже-
нию активности фермента. Можно предположить повышенную чувствительность
глутатионредуктазы по сравнению с глутатионпероксидазой к повреждающему
действию пероксида водорода. Также необходимо учитывать, что для реализации
катализа глутатионредуктазной реакции требуется достаточное количество
НАДФН [31], который поставляется в основном за счет реакций пентозофосфат-
ного пути окисления глюкозо-6-фосфата.
Зафиксированное нами снижение концентрации SH-групп протеинов на фоне
высокого содержания активных форм кислорода при индукции окислительного
стресса в лимфоцитах крови свидетельствует об участии белковых молекул в каче-
стве акцепторов пероксида водорода и гидроксильного радикала. Подвергаясь
окислительному воздействию, SH-группы цистеиновых радикалов белковых моле-
кул способны обратимо переходить в дисульфидное состояние и активно вступать
во взаимодействие с окисленным глутатионом. Это подтверждалось увеличением
содержания связанного с белками глутатиона на фоне возрастания концентрации
окисленного глутатиона при индукции окислительного стресса в изучаемых клетках.
Известно, что гидроксильный радикал обладает высокой реакционной способно-
стью и вызывает повреждение не только белковых молекул, но и липидов и нукле-
иновых кислот, вызывая при этом образование органических радикалов [1]. Внут-
риклеточная продукция ОН• происходит с участием ионов переменной валентно-
сти (Fe2+, Cu+) в реакциях Фентона. Гидроксильный радикал имеет малое время
жизни и радиус диффузии, поэтому в биологических системах не существуют спе-
циализированных протективных систем, защищающих клетки от ОН•. Ведущая
роль в его инактивации принадлежит соединениям, содержащим SH-группы [32].
Добавление Н2О2 в конечной концентрации 0.5 мМ в среду инкубирования лим-
фоцитов крови способствовало не только обратимой окислительной модификации
белков, но и накоплению их карбонильных производных. Эти производные проте-
инов образуются путем ковалентной модификации аминокислотных радикалов
треонина, аргинина, пролина, гистидина, цистеина, лизина и являются стабиль-
ными продуктами [33].
Проведенный нами корреляционный анализ полученных результатов в лимфо-
цитах крови в условиях окислительного стресса позволил установить положительные
взаимосвязи между количеством аннексин V-положительных клеток и концентра-
цией гидроксильного радикала (r = +0.71; р < 0.05), содержанием карбонильных
производных белков и активностью каспазы-3 (r = +0.65; р < 0.05). Это указывает
на участие активных форм кислорода и окислительно-модифицированных белков
в реализации апоптотического типа гибели лимфоцитов крови в условиях экспери-
ментального окислительного стресса.
В настоящее время известно, что продукты неполного восстановления молеку-
лярного кислорода помимо повреждающего действия выполняют регуляторные
функции. По физико-химическим свойствам в качестве вторичного посредника
для активации лимфоцитов выступает молекула Н2О2. В сравнении с гидроксиль-
ным радикалом, H2O2 менее агрессивна, но при этом способна окислять цистеин в
составе белков и пептидов, превращая его цистеинтиолат-анион (–СН2–S¯).
В случае снижения редокс-статуса клетки при формировании окислительного
335
РОЛЬ РЕДОКС-СТАТУСА И ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ...
стресса цистеин способен легко окисляться пероксидом водорода до сульфеновой
кислоты, с последующим образованием дисульфидных или сульфенамидных свя-
зей. Наличие остатков цистеина в регуляторных белках, таких как факторы тран-
скрипции, рецепторы, протеинкиназы, циклин-зависимые киназы, позволяет счи-
тать их редокс-зависимыми протеинам, а молекулы активных форм кислорода – мо-
дуляторами функционального статуса лимфоцитов крови, меняющих активность
этих клеток в иммуногенезе [32, 34].
В связи с этим чрезмерная активация или угнетение гибели эффекторных кле-
ток крови может обуславливать нарушение регуляции межклеточной кооперации,
являющуюся причиной возникновения патологических процессов. Поэтому ис-
следование участия активных форм кислорода в молекулярных механизмах, со-
ставляющих основу внутриклеточного функционирования лимфоцитов крови, как
в норме, так и при патологии является актуальным и перспективным с позиции
разработки технологий для профилактики и коррекции патологических состоя-
ний, характеризующихся развитием окислительного стресса.
Формирование иммунного ответа влечет за собой активацию всех участников
иммунной защиты. Компоненты иммунной системы, в том числе лимфоциты кро-
ви, способны очень быстро и активно взаимодействовать между собой. С помощью
лимфоцитов происходит формирование специфического иммунитета, реализация
и координация иммунного ответа путем синтеза воспалительных цитокинов и ан-
тиген-специфических связывающих рецепторов, обеспечивающих постоянство
внутренней среды организма и защиту от чужеродных агентов [4]. Процесс образо-
вания активных форм кислорода при функционировании клеток лимфоидной
природы неизбежен. Но редокс-статус этих клеток должен находиться под строгим
контролем. Важно отметить, что усиление свободно-радикальных процессов и на-
рушение физиологического баланса между про- и антиоксидантными системами с
привлечением в качестве эффекторной клетки лимфоцита крови может быть при-
чиной аутоиммунных и аллергических патологий, опухолевого роста различной
локализации, неинфекционного и инфекционного воспаления и др. [2, 12].
Таким образом, сочетание антиоксидантных и свободно-радикальных процес-
сов влияет на окислительную модификацию протеинов и является основой ре-
докс-зависимых путей реализации и активации апоптотической гибели в интакт-
ных лимфоцитах крови. Исследование, проведенное нами на модели окислительно-
го стресса в лимфоцитах крови, позволило установить молекулярные механизмы
влияния пероксида водорода в конечной концентрации 0.5 мМ на процесс окисли-
тельной модификации белков и состояние компонентов системы глутатиона в
лимфоцитах крови. При изменении соотношения в содержании про- и антиокси-
дантов в лимфоцитах крови в условиях моделирования окислительного стресса на-
ми было выявлено, что потенциальными редокс-зависимыми молекулярными ми-
шенями для коррекции нарушений метаболизма и ключевыми молекулами в регу-
ляции клеточного ответа на окислительный стресс являются белки. Управление
редокс-зависимыми процессами карбонилирования и глутатионилирования про-
теинов является перспективным с позиции модуляции функциональных свойств
лимфоцитов крови.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З., Бондарь И.А., Труфакин В.А. Окислительный
стресс. Патологические состояния и заболевания. Новосибирск. Сибирск. универ. изд-во.
2017. [Men’shhikova E.B., Zenkov N.K., Lankin V.Z., Bondar’ I.A., Trufakin V.A. Okislitel’nyj
stress. Patologicheskie sostoyaniya i zabolevaniya [Oxidative stress: Pathological states and dis-
eases]. Novosibirsk. Sibirskoe Universitetskoe Izdatelstvo. 2017.].
336 НОСАРЕВА и др.
2. Belikov A.V., Schraven B., Simeoni L. T cells and reactive oxygen species. J. Biomed. Sci. 22: 85–92.
2015.
3. Gostner J.M., Becker K., Fuchs D., Sucher R. Redox regulation of the immune response. Redox.
Rep. 18(3): 88–94. 2013.
4. Kesarwani P., Murali A.K., Al-Khami A.A., Mehrotra S. Redox regulation of T-cell function:
From molecular mechanisms to significance in human health and disease. Antioxid. Redox.
Signal. 18(12): 1497–1534. 2013.
5. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А.
Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М. Фирма “Слово”. 2006.
[Men’shhikova E.B., Lankin V.Z., Zenkov N.K., Bondar’ I.A., Kruguvyh N.F., Trufakin V.A. Ok-
islitel’nyj stress. Prooksidanty i antioksidanty [Oxidative stress: Prooxidant and antioxidant].
Moscow. Firma “Word”. 2006.].
6. Thannickal V.J., Fanburg B.L. Reactive oxygen species in cell signaling. J. Physiol. 279(6):
L1005–L1028. 2000.
7. Ullrich V., Kissner R. Redox signaling: Bioinorganic chemistry at its best. J. Inorg. Biochem.
100(12): 2079–2086. 2006.
8. Dubinina E.E., Dadali V.A. Role of 4-hydroxy-trans-2-nonenal in cell functions. Biochemistry
(Mosc). 75(9): 1069–1087. 2010.
9. Степовая Е.А., Рязанцева Н.В., Носарева О.Л., Закирова Е.В., Наумова А.И., Веснина О.Н.,
Орлов Д.С., Шахристова Е.В., Иванов В.В., Новицкий В.В. Роль окислительной модифи-
кации белков в редокс-зависимой регуляции апоптоза опухолевых клеток. Молекуляр-
ная медицина. (4): 60–64. 2015. [Stepovaya E.A., Ryazantseva N.V., Nosareva O.L., Zakirova E.V.,
N a u m ov a A. I . , Ve s n i na O. N ., Or lo v D .S ., Sh ak hr is to v a E . V. , I va n o v V.V. , N ov i t sk y V. V. The role
of oxidative protein modification in redox-dependent regulation of tumor cell apoptosis. Mo-
lecular medicine. (4): 60–64. 2015. (in Russ.)].
10. Chondrogianni N., Petropoulos I., Grimm S., Georgila K., Catalgol B., Friguet B., Grune T., Gonos E.S.
Protein damage, repair and proteolysis. Mol. Aspects Med. 35: 1–71. 2014.
11. Popov D. Protein S-glutathionylation: From current basics to targeted modifications. Arch.
Physiol. Biochem. 120(4): 123–130. 2014.
12. Nosareva O.L., Stepovaya E.A., Ryazantseva N.V., Shakhristova E.V., Egorova M.Y., Novitsky V.V.
The role of the glutathione system in oxidative modification of proteins and dysregulation of
apoptosis in Jurkat tumor cells. Bull. Exp. Biol. Med. 164(2): 199–202. 2017.
13. Bignold L.P., Ferrante A. Mechanism of separation of polymorphonuclear leukocytes from
whole blood by the one-step Hypaque-Ficoll method. J. Immunol. Methods. 96(1): 29–33.
1987.
14. Ulmer A.J., Flad H.D. Discontinuous density gradient separation in human mononuclear leu-
cocytes using percoll as gradient medium. J. Immun. Methods. 30(1): 1–10. 1979.
15. Halliwell B., Whiteman M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell
culture: How should you do it and what do the results mean? Br. J. Pharmacol. 142(2): 231–
255. 2004.
16. Thom S.R., Elbuken M.E. Oxygen-dependent antagonism of lipid peroxidation. Free Radic. Biol.
Med. 10(6): 413–426. 1991.
17. Cohen G.M. Caspases: The executioners of apoptosis. Biochem. J. 326: 1–16. 1997.
18. Nicholson D.W. Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell
death. Cell Death and Differentiation. 6: 1028–1042. 1999.
19. Kojima S., Nakayama K., Ishida H. Low dose gamma-rays activate immune functions via induc-
tion of glutathione and delay tumor growth. J. Radiat. Res. 45(1): 33–39. 2004.
20. Burchill B.R., Oliver J.M., Pearson C.B., Leinbach E.D., Berlin R.D. Microtubule dynamics and
glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes. J. Cell Biol.
76(2): 439–447. 1978.
21. Worthington D.J., Rosemeyer M.A. Glutathione reductase from human erythrocytes. Catalytic
properties and aggregation. Eur. J. Biochem. 67(1): 231–238. 1976.
22. Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии. CПб. Интермедика. 1998.
[Karpishchenko A.I. Medicinskie laboratornye tekhnologii [Medical laboratory techniques].
Saint Petersburg. Intermedika. 1998.].
337
РОЛЬ РЕДОКС-СТАТУСА И ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ...
23. Королюк М.А., Иванова Л.Н., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активно-
сти каталазы. Лаб. дело. 1: 16–19. 1988. [Korolyuk M.A., Ivanova L.N., Majorova I.G., To-
karev V.E. Method for determination of catalase activity. Laboratornoe delo. 1: 16–19. 1988. (in
Russ.)].
24. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248–254. 1976.
25. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Глутатион ядра клетки и его функции. Биомедицин-
ская химия. 56(6): 657–662. 2010. [Kulinskiĩ V.I., Kolesnichenko L.S. Nuclear glutathione and
its functions. Russ. Biomeditsinskaya Khimiya. 56(6): 657–662. 2010. (in Russ.)]
26. Dannenmann B., Lehle S., Hildebrand D.G., Kübler A., Grondona P., Schmid V., Holzer K.,
Fröschl M., Essmann F., Rothfuss O., Schulze-Osthoff K. High glutathione and glutathione per-
oxidase-2 levels mediate cell-type-specific DNA damage protection in human induced plurip-
otent stem cells. Stem Cell Reports. 4(5): 886–898. 2015.
27. Harris I.S., Treloar A.E., Inoue S., Sasaki M., Gorrini C., Lee K.C., Yung K.Y., Brenner D., Knob-
be-Thomsen C.B., Cox M.A., Elia A., Berger T., Cescon D.W., Adeoye A., Brüstle A., Molyneux S.D.,
Mason J.M., Li W.Y., Yamamoto K., Wakeham A., Berman H.K., Khokha R., Done S.J., Kavana-
gh T.J., Lam C.W., Mak T.W. Glutathione and thioredoxin antioxidant pathways synergize to
drive cancer initiation and progression. Cancer Cell. 27(2): 211–222. 2015.
28. Pastore A., Piemonte F. S-glutathionylation signaling in cell biology: Progress and prospects.
Eur. J. Pharm. Sci. 46(5): 279–292. 2012.
29. Hill B.G., Bhatnagar A. Protein S-glutathiolation: Redox-sensitive regulation of protein func-
tion. J. Mol. Cell Cardiol. 52(3): 559–567. 2012.
30. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Система глутатиона. I. Синтез, транспорт, глутати-
онтрансферазы, глутатионпероксидазы. Биомедицинская химия. 55(3): 255–277. 2009.
[Kulinskiĩ V.I., Kolesnichenko L.S. Glutathione system. I. Synthesis, transport, glutathione
transferases, glutathione peroxidases. Russ. Biomeditsinskaya Khimiya. 55(3): 255–277. 2009.
(in Russ.)].
31. Son A., Yodoi J., Nakamura H. Thioredoxin. Nippon Rinsho. 62(11): 537–540. 2004.
32. Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., Ткачев В.О. Некоторые принципы и механизмы редокс-
регуляции. Кислород и антиоксиданты. 1: 3–64. 2009. [Zenkov N.K., Men’shhikova E.B.,
Tkachev V.O. Some principles and mechanisms of redox-regulation. Oxygen and antioxidants.
1: 3–64. 2009. (in Russ.)].
33. Grimsrud P.A., Xie H., Griffin T.J., Bernlohr D.A. Oxidative stress and covalent modification of
protein with bioactive aldehydes. J. Biol. Chem. 283(32): 21837–21841. 2008.
34. Kalinina E.V., Chernov N.N., Novichkova M.D. Role of glutathione, glutathione transferase, and
glutaredoxin in regulation of redox-dependent processes. Biochemistry. (Mosc). 79(13): 1562–1583.
2014.
The Role of Redox Status and Oxidative Modification of Proteins in Implementing
Apoptosis in Human Blood Lymphocytes in Norm and Under Experimental Oxidative Stress
O. L. Nosarevaa, *, E. A. Stepovayaa, E. V. Shakhristovaa, O. N. Alekseevaa,
D. I. Kuzmenkoa, A. A. Sadykovaa, V. V. Novitskya
aSiberian State Medical University, Tomsk, Russia
*e-mail: olnosareva@yandex.ru
Abstract—The article presents the data on the level of reactive oxygen species, irrevers-
ible and reversible oxidative modification of proteins, the state of glutathione system
components, activity of catalase, and implementation of apoptosis in intact blood lym-
phocytes. By modulating oxidative stress in vitro, we studied the role of hydrogen perox-
ide in the final concentration of 0.5 mM in apoptosis implementation. We also evaluated
the contribution of the glutathione system components and irreversible and reversible
oxidative modification of proteins to molecular mechanisms of apoptosis in blood lym-
phocytes. We showed that apoptotic death in blood lymphocytes under experimental ox-
idative stress was characterized by activation of protein glutathionylation and carbonyla-
338 НОСАРЕВА и др.
tion. The obtained findings prove that protein molecules are potential redox-dependent
targets for regulating cell metabolism in blood lymphocytes.
Keywords: blood lymphocytes, cell redox-status, oxidative stress, antioxidant system, ox-
idative protein modification, apoptosis
ЦИТИРОВАТЬ:
Носарева О.Л., Степовая Е.А., Шахристова Е.В., Алексеева О.Н., Кузьменко Д.И.,
Садыкова А.А., Новицкий В.В. Роль редокс-статуса и окислительной модификации
белков в реализации апоптоза лимфоцитов крови человека в норме и при экспери-
ментальном окислительном стрессе. Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 105(3):
327—338.
DOI: 10.1134/S0869813919030063
TO CITE THIS ARTICLE:
Nosareva O.L., Stepovaya E.A., Shakhristova E.V., Alekseeva O.N., Kuzmenko D.I.,
Sadykova A.A., Novitsky V.V. The Role of Redox Status and Oxidative Modification of
Proteins in Implementing Apoptosis in Human Blood Lymphocytes in Norm and Under
Experimental Oxidative Stress. Russian Journal of Physiology. 105(3): 327—338.
DOI: 10.1134/S0869813919030063