Los hongos al microscopio

Abstract

El advenimiento de la microscopía óptica produjo una revolución en las ciencias naturales, con su mayor impacto en el estudio de los seres vivos. La capacidad de distinguir las mínimas unidades de la vida reveló la presencia de grupos de organismos insospechados hasta entonces y comenzó a mostrar las increíbles formas de reproducirse y dispersarse de estos. La observación de los tejidos vegetales en siglo XVII por Robert Hooke (1635­1703) mostró que estos están constituidos por unidades discretas y repetitivas a las que se llamó células (por cellula, diminutivo latino de cella, "celda"). Las primeras evidencias sobre la reproducción de las células plantearon grandes cambios de paradigmas a niveles tanto prácticos filosóficos. Comenzó a discutirse que si la vida sólo provenía de la vida o si una célula podía aparecer por generación espontánea o si se requería una célula predecesora para originarla, siendo esta última idea corroborada por científicos como Lazzaro Spallanzani (1729­1799) y Louis Pasteur (1822­1895). En el campo de las ciencias de la salud, se iniciaría una revolución que terminaría explicando muchas de las preguntas de larga data, como la causa del contagio de las enfermedades. Fueron en particular los micólogos algunos de los primeros en verificar la naturaleza "microorganísmica" de algunas patologías de las plantas, tal vez dada la coincidencia espacial y temporal del auge de estos desarrollos científicos y las grandes pestes que diezmaron las vides en Europa. Con la observación de las estructuras de dispersión de Plasmopara viticola y otros patógenos vegetales, se comenzaron a reconocer los ciclos de vida y se propusieron las formas de evitar el contagio, además del primer antifúngico, conocido como "caldo bordelés", inventado por Pierre Alexis Millardet (1838­1902) a fines del siglo XIX.

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REVISTA BOLETÍN BIOLÓGICA Nº 40 - pág. 26
El advenimiento de la microscopía óptica produjo una revolución
en las ciencias naturales, con su mayor impacto en el estudio de
los seres vivos. La capacidad de distinguir las mínimas unidades
de la vida reveló la presencia de grupos de organismos
insospechados hasta entonces y comenzó a mostrar las increíbles
formas de reproducirse y dispersarse de estos. La observación de
los tejidos vegetales en siglo XVII por Robert Hooke (1635-1703)
mostró que estos están constituidos por unidades discretas y
repetitivas a las que se llamó células (por cellula, diminutivo latino
de cella, "celda"). Las primeras evidencias sobre la reproducción
de las células plantearon grandes cambios de paradigmas a
niveles tanto prácticos filosóficos. Comenzó a discutirse que si la
vida sólo provenía de la vida o si una célula podía aparecer por
generación espontánea o si se requería una célula predecesora
para originarla, siendo esta última idea corroborada por
científicos como Lazzaro Spallanzani (1729-1799) y Louis Pasteur
(1822-1895).
En el campo de las ciencias de la salud, se iniciaría una
revolución que terminaría explicando muchas de las preguntas
de larga data, como la causa del contagio de las enfermedades.
Fueron en particular los micólogos algunos de los primeros en
verificar la naturaleza "microorganísmica" de algunas patologías
de las plantas, tal vez dada la coincidencia espacial y temporal
del auge de estos desarrollos científicos y las grandes pestes que
diezmaron las vides en Europa. Con la observación de las
estructuras de dispersión de Plasmopara viticola y otros
patógenos vegetales, se comenzaron a reconocer los ciclos de
vida y se propusieron las formas de evitar el contagio, además
del primer antifúngico, conocido como "caldo bordelés",
inventado por Pierre Alexis Millardet (1838-1902) a fines del siglo
XIX. Entre los jóvenes que se formaron en el estudio de esas
patologías de la vid, se encontraba un joven italiano al que casi
TEORÍA
por Francisco Kuhar
Alejandro Sequeira
fkuhar@gmail.com
Dr. Francisco Kuhar: es micólogo e
investigador en el IMBIV (UNC-
CONICET), curador de la colección de
hongos del Museo Botánico de
Córdoba y co-fundador de Hongos de
Argentina.
Alejandro Sequeira: es investigador
con formación biológica y un vasto
conocimiento de los hongos del
Uruguay, además de autor y editor de
varios libros y guías de campo.
Los hongos al microscopio
Figura portada: Cutícula de un Cortinarius teñida con
floxina.

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todos conocemos: Carlos Spegazzini (1858-1926),
que a la edad de 21 años ya se encontraba en el
cono sur describiendo su primer macrohongo:
Agaricus platensis (hoy situado en el género
Oudemansiella) y no pararía hasta completar su
monumental obra que incluye miles de nuevas
especies de esa zona. Vemos así como la tarea
que nos ocupa es herencia directa de los
primeros microscopistas. Por supuesto, el
conocimiento de los hongos ya existía. La
observación a "ojo desnudo" era suficiente para
distinguir qué hongos comer y cuáles no. La forma
del esporoma, la disposición del tejido fértil, los
colores y texturas, e incluso la observación
macroscópica de las esporas en masa (Figuras 1 y
2), había dado lugar a las primeras clasificaciones
formales del reino de los hongos, pero el
advenimiento de la microscopía reveló un mundo
de caracteres nuevos que dio lugar a una
revolución en el estudio e identificación de los
hongos.
¿Cuáles son los caracteres que observaremos al
microscopio? Las esporas suelen ser decisivas a la
hora de las determinaciones en conjunto con los
esporangios (basidios –Figura 3- o ascos), pero
también tenemos que poner atención a las
estructuras estériles que los acompañan en el
himenio (superficie fértil): los cistidios (Figura 4), en
el caso de los basidiomicetos, y las paráfisis en los
ascomicetos. En el caso de los hongos en polvera,
en los que no distinguimos un himenio organizado,
observaremos las hifas del capilicio, que
conforman el pseudotejido que dio origen a las
esporas (la gleba). Luego es importante observar
las hifas somáticas para ver si poseen fíbulas o no,
y el patrón de ramificación. En muchos hongos,
en especial en los políporos y corticioides existen
diversos tipos de hifas: además de las hifas
generativas, tabicadas, ramificadas y fibuladas,
existen hifas con pocos septos, paredes gruesas y
que pueden estar ramificadas o formar largos
segmentos sin ramificación. En el primer caso las
llamaremos ligadoras, y en el segundo,
esqueletales. Los basidiomas que posean un solo
tipo de hifas serán monomíticos, los que posean
dos serán dimíticos, y en caso de tener tres, serán
trimíticos. Es de especial importancia en los
hongos de sombrero, diferenciar los tipos de
"pileipellis", es decir, la estructura de la cutícula
del píleo (Figura de portada). Esta puede mostrar
hifas paralelas y reptantes (cutis), estar formada
por una capa de elementos globosos (epitelio) o
mostrar hifas más o menos perpendiculares a la
superficie (tricodermis) entre otras
configuraciones más raras.
Pero volvamos a las técnicas: a pesar de que las
preparaciones que hacemos los micólogos suelen
ser extremadamente simples en comparación
con las de la histología o patología animal, nos
son pocos los implementos ni frasquitos con
líquidos que tenemos que tener a nuestro
alcance al sentarnos frente al microscopio.
En primer lugar, trabajamos en general con
cortes. Esto se debe a que la microscopía óptica
tradicional funciona con luz transmitida, es decir,
Figura 1: Esporada de Gymnopilus junonius. El color castaño de
las esporas en masa es característico de varias familias de
hongos, entre ellas, Cortinariaceae y Strophariaceae, a la que
pertenece este género.
Figura 2: Esporada de Clorophyllum molybdites. La coloración
verde nos permite identificar a esta especie tóxica, que a
primera vista se podría confundir con algunos hongos
comestibles como Chlorophyllum (Macrolepiota) rhacodes.

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la luz que llega a nuestros ojos es la que logró
atravesar la muestra. Por el contrario, al utilizar la
"lupa" o estereoscopio, vemos la luz reflejada, y
no es necesario cortar las estructuras para dejarla
pasar. Entonces, nuestra primera herramienta es
la de cortar, y casi todos los micólogos que se
precien de serlo, prefieren la tradicional hoja de
afeitar.
Manos a la obra: dada la naturaleza elástica,
gelatinosa o cartilaginosa de la mayoría de los
hongos, la menor presión produciría una
deformación que dificultaría el corte, por lo que
es más fácil contar con material desecado.
La desecación, además de facilitar el corte, es el
método más común con el que se preservan los
hongos, ya que permite que se mantengan
durante mucho tiempo prácticamente
inalterados. Para secarlos correctamente, lo más
común es exponerlos a una fuente de aire tibio,
aunque en lugares con baja humedad, basta
con dejarlos expuestos unos días al aire.
Comenzamos haciendo un corte neto que deje
expuesta una superficie o borde recto. A
continuación, a simple vista o con el auxilio de la
lupa binocular, intentamos hacer finas secciones
del borde expuesto a fines de lograr una tan
delgada, que la claridad pueda traslucir por ella.
Las secciones van a caer sobre una superficie
limpia o van a quedar pegadas a la hoja de
afeitar. Antes de tocarlas colocamos una gota de
líquido en el portaobjetos, ya que si colocamos el
líquido sobre las secciones, corremos el riesgo de
contaminar el frasco con esporas. Podemos mojar
la punta de una aguja en ese líquido y al tocar las
secciones delgadas, las podremos recoger y
llevar al portaobjetos. Luego solo queda cubrir la
gota con el cubreobjetos, secar el líquido
excedente, y proceder a observar. Lo que nadie
ha dicho aún, es de qué líquidos se trata.
Uno de los reactivos más utilizados es el hidróxido
de potasio (KOH) o de sodio (NaOH),
generalmente al 3 o 5 %, (Tabla 1). La razón por la
que usamos esta solución, es su capacidad de
"mojar", dado que muchos hongos tienen
estructuras "hidrofóbicas" (que repelen el agua)
por estar cubiertas de ceras o lípidos semejantes.
Es tan larga la tradición de uso de hidróxido de
potasio en particular (más que el de sodio), que
siempre que indicamos las medidas o color de las
esporas en una descripción, lo haremos
observándolas en este reactivo para estar seguros
de verlas tal como las vieron Fries, Bresadola,
Spegazzini, o quien sea que las hubiera descripto.
Al proceder a observar, sabemos que nos
enfrentamos con el problema de la distancia
focal: a mayor aumento, menos distancia entre la
lente y el objeto a enfocar. Tal es así, que al
querer aumentar mil veces, la lente objetivo
Tabla 1: Medios de montaje más utilizados para la confección
y preservación de los preparados de microscopía óptica. Es
importante recordar que tanto el hidróxido de potasio como
el lactofenol son irritantes y hay que utilizarlos con cierta
precaución.
Figura 3: Los basidios son las células que producen las esporas
sexuales en los basidiomicetos. En este caso vemos un basidio
de Descolea brunnea con solo dos esterigmas (proyecciones
celulares cónicas), uno de los cuales aún lleva una
basiodiospora castaña. La barra nos sirve como referencia de
tamaño.
Figura 4: Cistidios de Tormentella sp. Observados con un
microscopio de interferencia diferencial. Este tipo de
microscopio óptico permite ver las estructuras en alto
contraste sin necesidad de teñirlas.

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terminaría por rozar el cubreobjetos. Para ello
colocamos una gota de otro líquido sobre el
preparado: el famoso aceite de inmersión. Se
trata de una sustancia que no corroe los
componentes de la óptica, y que permite
cambiar el ángulo de difracción de la luz de
manera tal que podamos alcanzar los mil
aumentos sin llegar a tocar el preparado con la
óptica, que quedan unidos por la gota de aceite.
Hay casos en los que necesitamos guardar el
preparado por unos días. Entonces recurrimos al
ácido láctico, que no se evapora, o mejor aún, al
lactofenol, que preservará durante mucho
tiempo la muestra por ser un potente fijador que
no permite el crecimiento de microorganismos.
Aquí tendremos que recordar que el KOH suele
estar contaminado con carbonatos y estos van a
reaccionar con el láctico o el lactofenol (Tabla 1),
llenando el preparado de espuma de dióxido de
carbono. Si el preparado ya contenía KOH y
queremos preservarlo, la mejor opción será
agregar una gota de glicerina sobre en el
portaobjetos en contacto con la preparación, y
por el otro lado de la misma, extraeremos el KOH
con un papel absorbente. En caso de querer
guardar el preparado por mucho tiempo,
simplemente le pintamos un reborde esmalte
para uñas que haga las veces de marco y no
olvidamos jamás rotular el preparado.
Otro grupo de sustancias a las que sin duda
recurriremos son los colorantes (Tabla 2): Entre los
más utilizados se encuentran la floxina, que
simplemente aumenta el contraste y nos permite
visualizar las estructuras más hialinas del
preparado. Otro muy común es el rojo Congo,
que tiene una gran afinidad por las paredes
celulares. Cuando una estructura se tiña más
intensamente con este compuesto que las
circundantes, la describiremos como "congófila".
Dado que este colorante no discrimina entre
paredes celulares fúngicas y vegetales, en
preparados que necesitemos distinguirlas
preferiremos el azul de algodón, del cual los
micólogos suelen decir que "solo tiñe hongo", con
las ventajas adicionales de que no requiere un
paso previo por KOH ya que es mojante por sí
mismo, y además contiene lactofenol, sirviendo
como medio preservante por mucho tiempo. Si
una estructura absorbe este colorante con mayor
avidez que el resto del material fúngico, la
llamaremos "cianófila".
Las reacciones metacromáticas (Tabla 3) son de
gran ayuda para distinguir grupos de hongos: se
trata de preparados en los que se forma un color
nuevo al entrar en contacto un reactivo con el
material fúngico: el KOH puede hacer virar a
tonos azulados a las esporas de algunas
Thelephoraceae permitiéndonos distinguir entre
especies. Cuando torna dorados a los cistidios, se
les dirá "crisocistidios", y si termina por disolverlos,
les diremos "liocistidios". Pero el reactivo
metacromático que nunca puede faltar a ningún
micólogo es el famoso Melzer. Este se compone
de una base que es mojante y preservante, pero
su principio activo es el iodo: al igual que lo hace
con el almidón el iodo le da una coloración
violácea intensa a muchas estructuras fúngicas a
las que llamaremos "amiloides" (parecidas al
almidón).
Veremos que las esporas de muchas Mycena
reaccionan de manera muy suave y pareja al
Melzer, y mucho más intensamente en algunas
Amanita, mientras que en los Russulales o en las
Melanoleuca será la ornamentación quien
tomará la metacromasia, y de manera mucho
más intensa. También azulearán los ascos de las
Pezizales, y el aparato apical de muchos
ascomycetes, pero frente a otras estructuras, en
lugar de dar una coloración violáceo-azulada,
obtendremos una rojiza, en la que se conoce
como reacción "dextrinoide". Se trata de una de
las reacciones de rutina que se aplican al
contenido estomacal de alguien de quien se
sospecha ha consumido la mortal Amanita
phalloides, ya que su gran amiloidía las hará
Tabla 2: Colorantes de uso común en el laboratorio de
micología. Al igual que la mayoría de los colorantes, exhiben
cierto grado de toxicidad y pueden ser cancerígenos a largo
plazo, por lo que hay que evitar ingerirlos o aspirarlos.
Tabla 3: Reacciones de modificación de estructura y cambio
de color (metacromáticas) que nos ayudan a identificar a los
hongos. El reactivo de Melzer contiene hidrato de cloral, que
es irritante y narcótico y por esto tiene que ser manejado con
cuidado, al igual que los demás medios.

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Bibliografía recomendada:
Alexopoulos, C. J. (1979). Introducción a la Micología. Buenos
Aires: EUDEBA.
Kuhar, F., Castiglia, V. y Papinutti, L. (2013). Reino Fungi:
morfologías y estructuras de los hongos. Revista Boletín
Biológica, 28, 11-18.
Kuhar, J. F., Castiglia, V. C. y Papinutti, V. L. (2012). Los hongos
en el laboratorio: de la naturaleza al cultivo axénico. Revista
Boletín Biológica, 27, 5-8.
evidentes aunque estén mezcladas con todo el
bolo alimentario. Solo una precaución es
necesaria: no aplicar el reactivo de Melzer al
material que ya se trató con KOH, ya que esto
alteraría los resultados de la reacción.
Además de sus esporas con ornamentaciones
amiloides, muchas Russulales presentan hifas
gloeopleuras o sulfocistidios. Para verlas, una
reacción más compleja es necesaria: la llamada
"sulfovainillina". Aquí agregaremos ácido sulfúrico
a vainillina en cristal o un fenol semejante, las
mezclaremos con una aguja, y de inmediato
pondremos el tejido bajo aumento, para
constatar el contraste aumentado de estas
estructuras. Allí es donde hay que tomar el dato
con rapidez, ya que todo el preparado terminará
por sucumbir ante el ataque del ácido sulfúrico.
Muchas otras técnicas se aplican en la
microscopía óptica y el tema no queda agotado
en esta breve introducción. Algunas
consideraciones finales conciernen a la
preservación de los ejemplares originales o
"vouchers". Cuando hacemos preparaciones y
descripciones basadas en las mismas, es muy
importante que el preparado quede rotulado y
las imágenes archivadas con un nombre que nos
permita referirlas al material original. Hasta el día
de hoy no se consideran válidas las descripciones
de especies para las cuales no se ha depositado
ese espécimen llamado "Tipo" sobre el cual
trabajarán futuros científicos que quieran
continuar con nuestro trabajo. Ese material será
secado a temperaturas menores a 50 grados a
fines de preservar su ADN y quedará archivado
en instituciones que sean capaces de ponerlas al
alcance de científicos de todo el mundo. De esta
manera nos aseguramos que el tiempo invertido
en las preparaciones y observación microscópica
no sean en vano y que puedan llegar a
convertirse en un aporte para la ciencia y el
fantástico reino de los hongos.
Glosario
Basidiomas: Estructuras reproductivas sexuales de los
hongos basidiomicetos, comúnmente conocidas como
sus "cuerpos fructíferos".
Capilicio: conjunto de hifas (filamentos) que
conforman la masa reproductiva sexual de los hongos
en polvera.
Cistidios: elementos estériles (no reproductivos)
microscópicos presentes en las superficies
reproductivas sexuales de los hongos basidiomicetos.
Corticioides: Hongos cuya superficie reproductiva
sexual es lisa. Suelen producir sus esporas debajo de
madera en descomposición.
Esporada: depósito de esporas que se logra
depositando el basidioma fresco sobre una superficie
lisa para observar el color de las esporas en masa.
Fíbula: puente que comunica dos células adyacentes
de los hongos basidiomicetos y permite la correcta
distribución de los núcleos provenientes de los
progenitores.
Gloeopleuras: Hifas con pocos septos y contenido
oleoso y recorrido serpenteante.
Himenio: superficie organizada donde se producen las
esporas sexuales de muchos hongos.
Paráfisis: elementos estériles (no reproductivos)
microscópicos presentes en las superficies
reproductivas sexuales de los hongos ascomicetos.
Pezizales: orden de hongos pertenecientes a la clase
de los ascomycetos y cuyas fructificaciones (ascomas)
se asemejan a platos, colmenillas o trufas.
Políporos: hongos pertenecientes a la clase de los
basidiomicetos cuya superficie reproductiva se
organiza en poros. Muchos de los hongos en repisa
pertenecen a este grupo.
Sulfocistidios: cistidios que se tiñen con una técnica
especial llamada sulfovainillina.
La Fundación Hongos de Argentina es un
proyecto de difusión del conocimiento del reino
de los hongos, y la divulgación de los estudios
micológicos para todos los interesados.
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