Aspectos estructurales y mecanísticos de la enzima ureasa y sus proteínas accesorias

Abstract

Las infecciones secundarias derivadas de los procedimientos médicos son un problema central en el ámbito de la salud, con un gran impacto económico y social y constituye un reto de la comunidad científica y del personal médico. El índice de mortalidad por estas infecciones, llamadas infecciones nosocomiales, es alto. Actualmente es aceptado que los principales microorganismos responsables de estas infecciones son: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae y Candida albicans, entre otros menos comunes. Adicionalmente al combate de estas infecciones se incluye el problema de la multirresistencia a antibióticos, que estas bacterias tienden a adquirir de forma horizontal con relativa facilidad. Las bacterias utilizan factores de virulencia que sirven para producir las condiciones preferentes para el establecimiento y colonización de los tejidos de sus hospederos. Algunos de estos factores de virulencia incluyen a enzimas, cuya actividad catalítica les provee un ambiente idóneo para la infección. El desarrollo de fármacos que neutralicen e inactiven a los factores de virulencia constituye un punto potencial de control antimicrobiano. Otra estrategia que se ha empleado para el desarrollo de nuevos tratamientos para combatir infecciones, es el uso de inhibidores específicos contra enzimas, cuya actividad es fundamental para el crecimiento de las bacterias. La actividad de la ureasa es esencial para la sobrevivencia de bacterias patógenas en los distintos ambientes presentes en los diferentes tejidos de hospedadores. La ureasa es una metaloenzima que requiere dos modificaciones postraduccionales importantes, dependientes de la hidrólisis de GTP y consisten en una carbamoilación en un residuo de lisina y la inserción de dos iones de níquel en el sitio activo. Esta maduración es dirigida por la GTPasa UreG y otras proteínas accesorias. La importancia de estas proteínas accesorias se ha descrito previamente en K. aerogenes y en Helicobacter pylori. Las infecciones producidas por cepas patogénicas de E. coli han mostrado no solo un incremento, sino una recurrencia en pacientes con infecciones urogénicas y gastrointestinales. La ureasa y sus proteínas accesorias, como UreG son un blanco potencial para su control antimicrobiano. Sin embargo, el desarrollo de antibióticos requiere primero un entendimiento de su funcionamiento a detalles moleculares. En este trabajo de investigación mostramos algunos detalles del funcionamiento y de la estructura de la ureasa y sus proteínas accesorias derivados de estudios estructurales combinados con experimentos de cinética enzimática.

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ISSN 2007-042X
Derechos reservados © 2016 UACJ
CienCia en la frontera: revista de CienCia y teCnología de la UaCJ, volUmen espeCial, 2016.
19
Ciencia en la frontera: revista de ciencia y tecnología de la UACJ.
Volumen Especial, pp. 19-36, 2016 / Impresa en México
Aspectos estructurales
y mecanísticos de la enzima ureasa
y sus proteínas accesorias
Luis Aguirre Reyes1
Miguel Armando Ramos Soto1
J. Aline Orozpe Olvera1
Ernesto Lucero Orozco1
Naun Lobo Galo1
Luis Fernando Plenge Tellechea1
Josá Valero Galván1
Emilio Álvarez Parrilla1
Alejandro Martínez Martínez1
Ángel Gabriel Díaz Sánchez1*
RESUMEN
Las infecciones secundarias derivadas de los procedimientos médicos son un problema central en el
ámbito de la salud, con un gran impacto económico y social y constituye un reto de la comunidad científica
y del personal médico. El índice de mortalidad por estas infecciones, llamadas infecciones nosocomiales, es
alto. Actualmente es aceptado que los principales microorganismos responsables de estas infecciones son:
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae y Candida albicans,
entre otros menos comunes. Adicionalmente al combate de estas infecciones se incluye el problema de la
multirresistencia a antibióticos, que estas bacterias tienden a adquirir de forma horizontal con relativa faci-
lidad. Las bacterias utilizan factores de virulencia que sir ven para producir las condiciones preferentes para
el establecimiento y colonización de los tejidos de sus hospederos. Algunos de estos factores de virulencia
incluyen a enzimas, cuya actividad catalítica les provee un ambiente idóneo para la infección. El desarrollo
de fármacos que neutralicen e inactiven a los factores de virulencia constituye un punto potencial de con-
trol antimicrobiano. Otra estrategia que se ha empleado para el desarrollo de nuevos tratamientos para
combatir infecciones, es el uso de inhibidores específicos contra enzimas, cuya actividad es fundamental
para el crecimiento de las bacterias. La actividad de la ureasa es esencial para la sobrevivencia de bacterias
patógenas en los distintos ambientes presentes en los diferentes tejidos de hospedadores. La ureasa es una
metaloenzima que requiere dos modificaciones postraduccionales importantes, dependientes de la hidróli-
sis de GTP y consisten en una carbamoilación en un residuo de lisina y la inserción de dos iones de níquel
en el sitio activo. Esta maduración es dirigida por la GTPasa UreG y otras proteínas accesorias. La impor-
tancia de estas proteínas accesorias se ha descrito previamente en K. aerogenes y en Helicobacter pylori. Las
infecciones producidas por cepas patogénicas de E. coli han mostrado no solo un incremento, sino una re-
1 Laboratorio de Bioquímica y Neuroquímica, Departamento de Ciencias Químico-Biológicas, Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad
Autónoma de Ciudad Juárez, Chihuahua., CP 03290, México.
* Autor de correspondencia: Laboratorio de Bioquímica y Neuroquímica, Departamento de Ciencias Químico-Biológicas, Instituto de Ciencias
Biomédicas, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Chihuahua., CP 03290, México.e-mail: angel.diaz@uacj.mx )

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currencia en pacientes con infecciones urogénicas
y gastrointestinales. La ureasa y sus proteínas acce-
sorias, como UreG son un blanco potencial para su
control antimicrobiano. Sin embargo, el desarrollo
de antibióticos requiere primero un entendimiento
de su funcionamiento a detalles moleculares. En
este trabajo de investigación mostramos algunos
detalles del funcionamiento y de la estructura de la
ureasa y sus proteínas accesorias derivados de es-
tudios estructurales combinados con experimentos
de cinética enzimática.
INTRODUCCIÓN
Las enzimas son catalizadores biológicos que au-
mentan la velocidad de las reacciones metabólicas
a tasas sorprendentemente altas, en comparación
con las mismas reacciones llevadas a cabo en au-
sencia de una enzima específica. Algunas de las
enzimas de origen proteico tienen funciones no en-
zimáticas igualmente importantes que sus propie-
dades catalíticas desde el punto de vista biológico.
Por ejemplo, algunos receptores celulares con
dominios de tirosina cinasas; o la acetilcolinestera-
sa, que aparte de modular las señales sinápticas,
funciona como molécula de anclaje extracelular y
como marcador inmunológico; y proteínas regula-
doras de señalización, como algunas aldolasas. Hoy
se sabe que algunas enfermedades están relaciona-
das con los cambios en la actividad biológica o en
los niveles de expresión de una o varias enzimas,
por ejemplo, en muchas enfermedades autoinmu-
nes como la diabetes tipo I, artritis reumatoide y
lupus eritematoso sistémico. Los microorganismos
patógenos usan algunas de sus enzimas como fac-
tores de virulencia, con la finalidad de establecer y
mantener una infección de forma eficiente.
Otros organismos secretan inhibidores espe-
cíficos contra algún tipo de enzima; así estos ob-
tienen una ventaja sobre otros en la competencia
por los nutrientes o en la contención de agresiones
químicas por parte de otros organismos. El enten-
dimiento del funcionamiento de las enzimas es un
problema central y complejo de las ciencias quími-
cas y biológicas. El campo de la enzimología se ha
expandido rápidamente durante los últimos años,
de un enfoque inicial en el estudio de aspectos de
los mecanismos químico y catalítico de enzimas in-
dividuales a esfuerzos recientes en entender la ac-
ción enzimática en el contexto de la dinámica mo-
lecular, y estudios de biología funcional. Algunos
estudios enzimológicos han contribuido en enten-
der la relación entre las estructuras moleculares de
las enzimas y su función y han resultado en una me-
jor comprensión de su evolución y comportamien-
to en el contexto de la complejidad de los sistemas
biológicos [1].
De los esfuerzos derivados de la comprensión
de la acción enzimática surgen aplicaciones biotec-
nológicas y médicas importantes cuando se logra
conocer un panorama extenso acerca de los aspec-
tos estructurales y mecanísticos del funcionamien-
to de estas macromoléculas. Por ejemplo, en el
caso de que se estudie una enzima que es un factor
de virulencia de un microorganismo patógeno, el
desarrollo de un inhibidor específico es crítico para
su control antimicrobiano cuando los antibióticos
existentes han fracasado o atacan una variedad de
blancos incluidas a algunas enzimas del hospede-
ro, haciendo complicado su tratamiento. El éxito
de esto requiere de un conocimiento extenso de
las propiedades bioquímicas y estructurales de la
enzima. La ureasa (EC 3.5.1.5) es una enzima que
cataliza la hidrolisis de urea a amonio y carbamato,
este último se hidroliza espontáneamente y genera
bicarbonato y un segundo ion amonio.
Esta actividad se ha involucrado con el estable-
cimiento de infecciones graves en humanos produ-
cidas por Helicobacter pylory en el tracto gástrico
[2] y de especies de Proteus en el tracto urinario
[3]. La actividad de la ureasa permite que las bacte-
rias sobrevivan a ambientes ácidos, condición que
impera en los tejidos preferentemente colonizados
por estas bacterias, de allí que la ureasa juega un
papel importante en la patogénesis de estas bacte-
rias[4,5].
Durante la colonización del tracto urinario, el
amonio producido por la actividad ureasa causa
daño celular e inflamación, condición que favorece
el establecimiento de la infección [6]. En el caso
de especies de Proteus (Proteus mirabilis), se lle-
ga incluso a formar cristales o cálculos, debido a
la presencia de amonio y bicarbonato producidos
por la acción de la ureasa, por otro lado, el amonio
liberado puede dañar la capa de glicosaminoglica-
no, la cual protege la superficie del tracto urina-
rio de infecciones bacterianas [7]. La enzima de
Yersina enterocolitica ha sido implicada como un
factor artrogénico en el desarrollo de artritis re-
activa, inducida por patógenos [4]. La actividad de
la ureasa se encuentra ampliamente distribuida en
gran parte del dominio bacteria, y los genes que
de esta enzima y los que son requeridos para su

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maduración se pueden transferir horizontalmente
con relativa facilidad. Estos genes se han clonado
y caracterizado y los mecanismos genéticos a par-
tir de numerosas especies bacterianas se han pro-
puesto. En especial se han estudiado los genes de
cinco especies: Bacillus sp (TB-90), Klebsiella aero-
genes, P. mirabilis, H. pilory y Y. enterocolitica [8].
La expresión de la ureasa puede ser regulada por
el nitrógeno, se induce por la presencia de urea,
o bien puede ser constitutivamente expresada [8].
Aunque se conocen detalles bioquímicos y clínicos
de estas enzimas aún falta información para lograr
entender el funcionamiento detallado de estas en-
zimas.
El incremento en la prevalencia de cepas de Es-
cherichia coli uro-patogénicas (UPEC) resistentes a
múltiples antibióticos ha complicado el tratamiento
de infecciones urinarias [9,10]. Las cepas UPEC son
responsables de la mayoría de las infecciones tracto
urinarias [10–13] se han encontrado en un 70 a 90%
de un total de siete millones de casos a cistitis aguda
y en 250 000 casos de polineuritis, según reportes
anuales en los Estados Unidos de América [11]. La
incidencia es mayor en las mujeres, en donde en un
50% de mujeres de 20 años de edad han presentado
una infección tractourinaria [11]. Las UPEC son un
problema de salud y son responsables de gastos de
fondos públicos y sociales [14][15].
Mediante un análisis de aislados de infecciones
tractourolíticas se han logrado establecer patotipos
de E. coli [10], aunque en estos casos la información
de la participación de la ureasa en la infección y de
estudios bioquímicos es escasa. En México recien-
temente se realizó un estudio de la prevalencia de
cepas de UPEC, de aislados clínicos de pacientes
diagnosticados con infecciones del tracto urinario,
se estudió la resistencia a diferentes antibióticos,
los distintos serotipos, y los grupos filogenéticos
[16]. El serotipo predominante es la cepa denomi-
nada O25:ST131, la cual presenta resistencia a am-
picilina, piperacilina, a fluoroquinolinas y a trimetro-
prina/sulfametazol (TMP/SMX). Esta cepa no solo
se ha aislado en México, sino que se ha encontrado
diseminada a nivel mundial [17]. La cepa O25:ST131
es ureasa positiva y hasta la fecha no se ha descrito
de forma clara el papel de su ureasa en la virulencia
y tampoco se conocen detalles de sus parámetros
cinéticos, ni de la estabilidad estructural, ni de su
mecanismo catalítico, y mucho menos si es blanco
de algún antibiótico actualmente conocido. El cono-
cimiento de estos detalles es importante, ya que el
entendimiento de las correlaciones entre la estruc-
tura y la función de esta proteína permitirá desarro-
llar inhibidores específicos que puedan ser usados
para el tratamiento de la infección producida por las
cepas UPEC.
En la literatura se ha reportado el uso de algu-
nos inhibidores con posibles aplicaciones en medi-
cina. Estos incluyen a diferentes compuestos como
fosforoamidatos, derivados de la urea, quinonas, hi-
droxilamatos y algunos heterociclos, principalmen-
te en base a nitrocompuestos. El ácido acetohidroxi-
mico ha sido el compuesto más utilizado en terapias
clínicas, a pesar de sus indeseables efectos secun-
darios, junto con algunas alternativas en base de
extractos herbales. A pesar de que la ureasa es una
enzima ampliamente estudiada, por ejemplo, fue la
primera enzima en cristalizarse, aun no se entiende
completamente su mecanismo de acción catalítica,
ni se conocen detalles de las relaciones entre sus
propiedades catalíticas y su estructura.
Para extender el conocimiento del funciona-
miento de las ureasas y poder tener pistas de su
papel en la colonización y establecimiento bacteria-
no durante infecciones, son necesarios estudios es-
tructurales combinados con experimentos de modi-
ficación química, análisis biofísicos y estructurales
y mutagénesis sitio-dirigida. En nuestras investiga-
ciones estamos estudiando las ureasas de algunas
bacterias patógenas y de algunas de plantas. La
estrategia que seguimos es realizar una caracteriza-
ción funcional y estructural, también estamos iden-
tificando nuevos inhibidores de la enzima con el fin
de utilizarlos en la eliminación de infecciones noso-
comiales; dichos inhibidores los buscamos a partir
de dos fuentes: en la base de datos Zinc (más de
600,000 farmacos) y partir de extractos vegetales.
Hemos logrado identificar siete compuestos con
potencial aplicación médica (resultados no mostra-
dos). La máxima actividad ureolítica de ureasa se
alcanza en presencia de bicarbonato y las proteínas
accesorias (UreD-UreE-UreF/H-UreG), de las que
destaca UreG quien transfiere ion níquel y facilita la
incorporación de bicarbonato a las cavidades catalí-
ticas de ureasa.
LA UREASA
Es una enzima que ha despertado el interés en el
campo de la biotecnología y en el campo de la medi-
cina. En ambos casos el objetivo es lograr su inhibi-
ción [5,18–23]. Con el fin de encontrar inhibidores
potentes, el conocimiento de detalles atómicos de

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su estructura tridimensional, así como de su meca-
nismo catalítico son indispensables. Desde el punto
de vista enzimológico, también es interesante es-
tudiarla, ya que la ureasa aumenta la velocidad de
hidrólisis de la urea 1015-veces comparada con su
hidrolisis espontánea [24], uno de los aumentos en
la velocidad de reacción más altos que puede produ-
cir una enzima hasta ahora descritos, y porque su
sitio activo requiere de iones de níquel, una caracte-
rística única entre las hidrolasas; además de que su
completa maduración —unión de metales y carba-
moilación— requiere la participación de proteínas
accesorias [4,24,25].
La actividad de la ureasa se encuentra amplia-
mente distribuida en todo el dominio bacteria, y los
genes de esta enzima se han clonado y caracteriza-
do a partir de numerosas especies bacterianas. En
especial se han estudiado los genes de cinco espe-
cies: Bacillus sp (TB-90), Klebsiella aerogenes, P. mi-
rabilis, Y. enterocolitica y H. pilory. A pesar de que la
ureasa fue la primer enzima que se logró cristalizar
en 1926 [26], no se conoció su estructura tridimen-
sional, sino hasta 60 años después [27]. Actualmen-
te se cuenta con la estructura tridimensional de la
enzima de K. aerogenes [28] y de otras especies: la
de H. pylori [29], Sporosarcina pasteurii [19], Ca-
navalia ensiformis [27], H. mustelae [30], Brucella
melitensis (PDB: 4FUR) y Cajanus cajan [31]. En
cuanto a su arquitectura las enzimas bacterianas ge-
neralmente están formadas por tres distintas subu-
nidades, dos de aproximadamente 11 y otra de 60.3
kDa [29]. La enzima funcional consta de tres copias
de cada subunidad (αβg)3, ensambladas en un trí-
mero de trímeros (Figura 1), haciendo un total de
tres sitios activos por molécula, en donde cada sitio
activo presenta dos iones de Ni+2 [24] en complejo
con un residuo de Lys carbamoilado.
En la ureasa de Bacillus pasteuri se observa un
asa flexible tapando la entrada del canal del sitio ac-
tivo [25]. Con base en las estructuras de la ureasa,
se han propuesto dos mecanismos catalíticos deta-
llados para la enzima de K. aerogenes y para la de B.
pasteuri, con diferencias menores ambos consisten
en lo siguiente: (1) el oxígeno carbonílico de la urea
desplaza a una molécula de agua que se encuentra
coordinada con el Ni-1, y este es polarizado por una
His; (2) una molécula de agua se coordina con el
Ni-2 y tras ser activada ataca a la urea para formar
un intermediario tetraédrico; (3) una histidina loca-
lizada en la tapa le cede un protón al grupo amido
del intermediario y (4) finalmente el intermediario
protonado se descompone a carbamato y amonio. El
modelo involucra un mecanismo de protonación in-
verso en el cual el ácido tiene un pKa menor que el
nucleófilo, dando como resultado a una fracción de
la enzima inactiva a su pH óptimo. Aunque existen
evidencias experimentales que apoyan este meca-
nismo [20, 24, 32, 33] actualmente no se ha logra-
Figura 1. Estructura de la ureasa. (A) Ureasas bacterianas con tres subunidades. (B) Ureasa de plantas y hongos con una sola
subunidad. La gura se obtuvo usando las coordenadas cristalogracas de la estructura de K. aerogenes (código PDB:2KAU)
y de Jack bean (código PDB:3LA4). Imágenes generadas con USCF-Chimera.

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do generalizar y tampoco es clara la identidad del
nucleofilo, es decir, si el Ni-2 se encuentra unido,
o si coordina a un ion hidróxido; ni la identidad, ni
el estado de protonación inicial del ácido general y
otros aspectos que relacionan la estructura con la
función de las ureasas.
La aclaración y un conocimiento más general
del mecanismo catalítico de la ureasa requieren de
datos bioquímicos y estructurales de más homó-
logos. La catálisis de la reacción facilitada por las
enzimas ureasas es en parte favorecida por la flexi-
bilidad conformacional que presenta un asa locali-
zada en la entrada del sitio activo (Figura 2). Se ha
encontrado que la interacción de compuestos quí-
micos con esta asa produce una inhibición [34–36].
Uno de los fármacos que identificamos en nuestros
estudios, potencialmente interacciona con este asa
y actualmente estamos investigando su mecanismo
de inhibición desde el punto de vista cinético y es-
tructural.
El uso de este compuesto y otros compuestos
que interaccionan con esta asa proporcionan una
Figura 2. Conformaciones del asa exible en la ureasa. (A) alineamiento estructural de las ureasas observadas en B a I. (B) urea-
sa de Jack bean, JBU (código PDB:3LA4), (C) ureasa de pigeon pea, PPU (código PDB:4G7E),(D) ureasa de Sporosarcina pas-
teurii, SPU (código PDB:4CEU), (E) ureasa de Enterobacter aerogenes, EAU (código PDB:4EP8), (F) ureasa de Bacillus pasteurii,
BPU (código PDB:2UBP), (G) ureasa de Bacillus pasteurii, BPU (código PDB:3UBP), (H) ureasa de Klebsiella aerogenes, KAU
(código PDB:2KAU) e (I) ureasa de Helicobacter Pylori, HPU (código PDB:1E9Z). Imágenes generadas con USCF-Chimera.

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excelente oportunidad para inhibir esta importan-
te enzima usada para el establecimiento, manteni-
miento y recurrencia de infecciones.
La ureasa (EC 3.5.1.5) es una metaloenzima de-
pendiente de níquel citoplasmática [4]que hidroliza
urea formando amoniaco y ácido carbámico [26]. El
ácido carbámico en una reacción espontánea poste-
riormente es convertido en amoniaco y bicarbona-
to, como se muestra en la siguiente ecuación:
H2N-C(O)-NH2 + H2O à NH3 + H2N-COOH
y H2N-COOH + H2O à NH3 + H2CO3
La alta eficiencia de la catálisis enzimática es de-
bido a la presencia de dos iones níquel en el sitio
activo [24,37]. La hidrolisis de urea trae consigo un
incremento del pH y permite tener una fuente de
nitrógeno fácilmente asimilable [38]. Esta actividad
ureolítica se ha involucrado con el establecimiento
de infecciones graves en humanos producidas por
bacterias como Helicobacter pylori en el tracto gás-
trico [39]y de Proteus mirabilis en el tracto urinario
[40] por mencionar algunas, de allí que la ureasa
juega un papel importante en la patogénesis de es-
tas bacterias. Estudios recientes demuestran que
la ureasa además de su actividad ureolítica puede
inducir la agregación plaquetaria y la activación de
lipooxigenasa [41], lo cual indica al menos dos do-
minios funcionales distintos presentes en la enzima.
La ureasa madura difiere en el número de subu-
nidades entre especies, sin embargo presentan un
60% de similitud en la secuencia, siendo reflejado en
su estructura terciaria [42]. En plantas y hongos la
ureasa presenta un solo tipo de subunidad de 849
residuos de aminoácidos polipeptídicos forman-
do dímeros [(α3)]2 [42][43], en Helicobacter pylori
está compuesta de una subunidad gamma (UreA)
de 238 residuos y una subunidad betha (UreB) de
569 residuos, organizados en un complejo [(γβ)3]4,
mientras que en especies de Klebsiella, Citrobacter,
Enterobacter y ciertas cepas de Escherichia coli po-
see tres subunidades (UreA, UreB y UreC) organi-
zados en un complejo (γβα)3, de las cuales el peso
molecular calculado es para UreA (11.1 kDa), UreB
(11.7 kDa) y UreC (60.3 kDa) [44]. La maduración
postraduccional de la ureasa en todas las especies
estudiadas hasta la fecha requiere: (1) De residuo
de lisina carbamilado por dióxido de carbono y (2)
de la inserción de dos iones Ni2+ en cada uno de los
sitios activos de la subunidad α, siendo el proceso
dependiente de GTP [45].
Los iones de Ni en el sitio activo forman un com-
plejo con el grupo carbamilado de la lisina. El Ni-1
presenta enlaces de coordinación con dos residuos
de histidina y una molécula de agua mientras que
Ni-2 con dos residuos de histidina, un ácido aspárti-
co y una molécula de agua [43,46].
Estudios in vitro en K. aerogenes demostraron
que incubando apoproteína ureasa con NiCl2 100
µM y bicarbonato 100 mM, confiere el 15% de fun-
cionalidad, al carbamilar residuos de Lys [43]. Sin
embargo, la actividad máxima ureolítica se alcanza
con la participación de cuatro proteínas accesorias
(homólogos UreD/H, UreF, UreG y UreE) codifi-
cadas por cuatro genes que están presentes en el
operón junto con ureasa (ureA, ureB y ureC) [4].
Siendo las proteínas UreD y UreF insolubles, mien-
tras que UreG es soluble. Por tal motivo, esta última
se ha podido caracterizar a partir de varias especies
[43]. Debido a la insolubilidad de UreD al sobre-
Figura 3. Modelo de unión de las proteínas accesorias UreD, UreF, UreG a la estructura de UreABC, mostrando actividad me-
talochaperona de UreE [43].

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expresarla, no se ha podido cristalizar, por lo que
investigadores emplean la expresión de fusión de
ureD con la unión a maltosa para hacerla soluble
[47].
PROTEÍNAS ACCESORIAS INVOLUCRADAS
EN MADURACIÓN DE LA UREASA
La maduración de la ureasa en H. pylori requiere de
las proteínas accesorias: UreH, UreF, UreG las cua-
les forman un dímero de heterotrímeros (UreG/
UreF/UreH)2 de peso molecular de 156.7±0.5 kDa
[48] y de la proteína UreE que actúa como meta-
lochaperona. La proteína UreH induce cambios
conformacionales en UreF, produciendo cambios
en asas flexibles de UreF [44,49], este comple-
jo UreF/UreH formado tiene escencialmente la
misma conformación antes y después de unirse
a la proteína UreG, formando el complejo UreG/
UreF/UreH [48]. Ésta unión de proteína-proteína
facilita la dimerización de UreG, pudiéndose for-
mar un sitio de unión de Ni por intercambio de
dominios de cadenas de Cys66-Pro67-His68, de los
cuales Cys66 e His68 se proponen como ligandos
de unión a iones níquel y zinc. Esta unión entre
UreG al complejo UreF/UreH solo se da por me-
dio de la interacción con la proteína UreF, siendo
los residuos involucrados en la unión de la proteí-
na UreG de H. pylori (Glu-62, Gly-64, Asp-74, Ser-
76, Asn-109, Glu-111, Arg-130, Lys-131 y Arg-138),
los cuales mantiene contacto con las regiones asa
de la proteína UreF [48].
En K. aerogenes se ha observado que la proteí-
na UreD se une tanto a UreB y UreC, confiriendo
por si sola a la apoproteína ureasa 30% de su fun-
cionalidad [43,50] mientras que UreF solo se une a
UreB ([47]). Debido a que el complejo UreDFG es
una especie poco soluble, no se ha podido caracte-
rizar completamente.
El modelo de unión de las proteínas acceso-
rias a la estructura de UreABC mostrado en la
Figura 3, propone dos rutas, ya sea que las proteí-
nas UreD, UreF y UreG se unan secuencialmente
o que se ligue el complejo UreDFG a los vértices
de la UreABC [43]. Siendo necesario para activar
la ureasa en especies formadoras de complejos
(UreABC)3 la adición de dos iones Ni+2 a sus tres
sitios activos de la enzima “por cada subunidad
UreC” [47]. El proceso requiere de la hidrolisis
de GTP, la incorporación de CO2 para carbamilar
residuo de Lys y de la metalochaperona UreE
para entregar níquel [44]. Sin embargo, a pesar
de los estudios realizados a la fecha, también es
desconocido cómo las proteínas accesorias son li-
beradas, si lo realizan como una unidad UreDFG
o como proteínas individuales.
Proteína Accesoria UreF
El complejo (UreF/UreH)2 de peso molecular de
123.10.9 kDa es necesario para dimerizar la proteí-
na UreG, cumpliendo esta su función. Siendo com-
probado por estudios de mutagénesis realizados
por Fong en los residuos R179A y Y183D sobre la
proteína UreF, causante de una homodimerización
deficiente del complejo UreF/UreH. Esta deficien-
cia para reclutar UreG impidió tener actividad ure-
olítica por parte de la ureasa [48]. A la vez, se de-
mostró que UreG tiende a disociarse del complejo
UreF/UreH, en adición de GTP aumentando esta
disociación en presencia de níquel.
Proteína Accesoria UreE
En cepas de K. aerogenes se ha observado que la
actividad máxima catalítica de la ureasa se alcanza
en presencia de UreE (17.6 kDa) [44], debido a su
actividad como metalochaperona que transporta el
ión metálico al complejo UreABCDFG [43]. Esta
proteína presenta en K. aerogenes 10 residuos de
Histidina en el C-terminal, siendo la proteína HypA
un análogo de UreE [51].
En un estudio con cobre en UreE se asumió que
residuos de His-110 e His-112 pueden actuar como
depósitos de Ni para poder así facilitar el aporte de
níquel a la ureasa [51]. Estudios estructurales y de
mutagénesis indican que para unir el ión metálico
se requiere de un dímero, en el cual un dominio de
la intercara se encarga de unir el ión, mientras que
el segundo dominio es probable que participe en el
reconocimiento del complejo ureABCDFG ya que
presenta una estructura semejante al dominio de la
chaperona Hsp40 [49]
Proteína Acceoria UreD
El locus ure se puede encontrar en orden ureABCE-
FGD o ureDABCEFG. En cepas de E. coli entero-
hemorrágicas (EHEC) la secuencia de los genes es
similar a la secuencia de especies como: Klebsiella,
Enterobacter y Citrobacter donde se agrupan en el
orden ureDABCEFG, siendo el gen ureD el más
variable [50]. La secuencia de los genes ure de K.
aerogenes son los más similares a la secuencia de

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EHEC, teniendo entre un 76–96% de similitudes con
las siete proteínas ureasa. Esta proteína presenta un
peso molecular de 29.8 kDa.
Las cepas de EHEC son patógenos colonizado-
res del intestino grueso en humanos causantes de
manifestaciones clínicas como colitis hemorrágica
y síndrome urémico hemolítico. En los Estados
Unidos la cepa EHEC O157:H7 es responsable de la
mayoría de los brotes, sin embargo en otros países
predominan serogrupos O26, O111 y O145 [47].
La actividad de la ureasa como factor de virulen-
cia se ha propuesto en especies como: Proteus mi-
rabilis, H. pylori y Yersenia enterocolítica por men-
cionar algunas; sin embargo en cepas de EHEC su
papel en la patogénesis no está definido. La falta de
información sobre el papel de la ureasa en EHEC
puede deberse a que muy pocas cepas de EHEC
in vitro demuestran un fenotipo de ureasa positivo,
siendo debido hasta la fecha por: (1) La sustitución
del nucleótido C742T en la cadena C-terminal de
ureD dando como resultado un cambio de glutami-
na en posición 248 por codón ámbar (UAG) de trun-
camiento prematuro y (2) la sustitución del nucleó-
tido C113T cambiando leucina (L) por prolina (P)
en posición 38. Encontrándose la sustitución C742T
altamente conservada en cepas EHEC ureasa nega-
tivas [47].
Estudios a partir de polimorfismos de ureD en
EHEC han identificado sustitución de prolina por
leucina en posición 205 sin embargo, la P205L es
menos conservada (solo 30% de las especies la pre-
sentan) y se ha determinado que la sustitución de
leucina por prolina (L205P) no confiere un incre-
mento de la actividad ureolítica, a diferencia de la
posición 38, donde la sustitución por prolina (L38P)
confiere un incremento de la actividad catalítica.
Estos estudios indican que por tal motivo, in vitro,
una ureasa negativa no son indicadores solo de una
mutación ámbar en UreD [47].
UreG y la superfamilia GTPASAS
Las GTPasas son una superfamilia de proteínas
presentes en procariotas como en eucariotas, ca-
paces de unir e hidrolizar el GTP. Éstas desempe-
ñan una gran variedad de funciones tales como: La
proliferación celular, la transducción de señales y
control del ciclo celular, la traducción y síntesis de
proteínas, el transporte vesicular y la translocación
de proteínas a través de la membrana por mencio-
nar algunas. Las GTPasas se caracterizan principal-
mente por tener un dominio G con un plegamien-
to y una estructural muy similar. A este dominio
conservado se le pueden adicionar otros dominios
amino o carboxiterminales los cuales pueden te-
ner funciones independientes o relacionadas con
la actividad GTPasa. El dominio G de las GTPasas
mantiene conservado cuatro secuencias (motivo
G1, G2, G3 y G4) responsables de la interacción
con el nucleótido y los efectores con excepción de
algunas pocas GTPasas como la adenilsuccinato
sintetasa. Además en ciertas GTPasas se presenta
un motivo G5 conservado[52].
Los motivos G1, G3, G4 y G5 son los responsa-
bles del reconocimiento, unión e hidrolisis del GTP
y de la interacción con el cofactor Mg2+. Mientras
que el motivo G2 permite la interacción con el posi-
ble efector y con la correspondiente GAP (proteínas
activadoras de GTPasas). Ésta superfamilia se cla-
sifica en 20 familias y 57 subfamilias, incluyéndose
algunas ATPasas, ya que presentan un motivo es-
tructural P-loop (bucle de unión al fosfato) presente
en el motivo G1. Algunas proteínas con actividad
ATPasa mantienen esta característica a pesar de ca-
recer de actividad GTPasa
Superfamilia Proteínas RAS
(GTPASAS pequeñas)
De las familias de GTPasas eucarióticas destaca la
superfamilia de proteínas tipo Ras[52], dividiéndose
las GTPasas pequeñas de acuerdo con su función
en al menos cinco familias principales: (1) Ras (Sar-
coma de Ras) involucradas en la regulación de la
expresión génica, apoptosis, proliferación, diferen-
ciación y morfología celular; (2) Rho (Homólogos
de Ras) participan en la reorganización de los fila-
mentos de actina, regulación del ciclo celular y la
expresión génica; (3) Rab (Ras igual a las proteínas
en el cerebro) controlan el transporte vesicular y el
tráfico de proteínas entre distintos orgánulos; (4)
Arf (Factor de ADP-ribosilación) regulan tráfico
vesicular y (5) Ran (Ras igual a nuclear) implica-
das en el transporte núcleo-citoplasmático de RNA
y proteínas. Esta superfamilia de GTPasas peque-
ñas, son las más estudiadas hasta la fecha, sirviendo
como modelo para el estudio del resto de las GTPa-
sas tanto en eucariotas como procariotas. El ciclo de
las GTPasas clásicas (ejemplo: proteínas Ras), se
encuentran en dos estados conformacionales: unido
al GTP (estado activo) y unido al GDP (estado inac-
tivo) [52]. Debido a su baja actividad GTPasa intrín-
seca, suele implicarse la unión del factor GAP para
catalizar el paso de hidrólisis del fosfato gamma del

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nucleótido unido a la proteína GTPasa. Igualmente
debido a la alta afinidad de las GTPasas por los nu-
cleótidos de guanina se requiere de la proteína GEF
(factor de intercambio de guanina), la cual permite
que las GTPasas vuelvan a su estado libre y pueda
la GTPasa reiniciar su nuevo ciclo. Tanto la proteí-
na GAP y GEF son específicos para cada una de las
GTPasas.
La topología de las proteínas tipo Ras mostrada
en la Figura 4, consiste en seis láminas β siendo
solo una antiparalela y cinco hélices α localizadas
en los extremos de las hojas. La clasificación de
proteínas con esta topología se conoce como de
clase TRAFAC [53].
Proteína Accesoria UREG
La proteína UreG es miembro de la clase SIMIBI de
GTPasa, las cuales frecuentemente requieren estar
en su forma dimérica para llevar a cabo sus funcio-
nes [51], en H. pylori mediante difracción de rayos X
se observó que la GTPasa presenta estructuralmen-
te motivo G1, G2, G3, G4 y G5 [48]. Esta proteína
por medio de la hidrólisis de GTP transfiere el Ni2+
al sitio catalítico de la ureasa, siendo este paso cru-
cial para la activación de la ureasa, ya que la sustitu-
ción de su sustrato por un análogo no hidrolizable
ocasiona una ureasa inactiva [54].
La proteína UreG presenta un peso molecular de
24.4 kDa, mientras que su dímero en presencia de
Ni y dos ligandos (GTP) tiene un peso molecular de
49.7. La dimerización de la proteína depende de la
adición de níquel, GDP y GTP; presentando una ten-
dencia a dimerizar UreG 40µM en presencia de Ni2+
0.5 mM con GDP 1mM y Ni con GTP 1mM, lo cual
es demostrado con el peso molecular calculado por
dispersión de luz estática, teniendo en presencia de
Ni con GDP un peso molecular de 44.5 kDa, mien-
tras que en presencia de Ni2+ con GTP de 46.8 kDa;
conteniendo en ambos casos una estequiometria de
1.2 de níquel por dímero de UreG [48]. Sin embargo,
la dimerización de UreG se ve estrechamente rela-
cionada con la presencia de nucleótidos de guanina,
sugiriendo que la dinámica molecular de UreG es re-
gulada por la hidrolisis de GTP, ya que esta actividad
Figura 4. A) Topología de las proteínas Ras y B) Topología de la proteína HypB-UreG (Gasper et al., 2006)

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desfavorece la dimerización de la proteína liberando
iones níquel en el proceso; siendo aumentada la ac-
tividad hidrolítica específicamente en presencia de
bicarbonato, ya que se mantiene la actividad al añadir
otra sal como: acetato, formato o sulfato.
De las cuatro proteínas accesorias de ureasa,
la proteína UreG es la más conservada en las es-
pecies estudiadas hasta la fecha. Teniendo conser-
vado el motivo de unión a metal Cys-Pro-His [55].
Este motivo es responsable de la unión de níquel
como de la dimerización de UreG, siendo demos-
trado en UreG de H. pylori mediante mutagénesis
de residuo C66A y H68A [48].
La proteína UreG en K. aerogenes es un monó-
mero que puede unir níquel o zinc (Kd ~ 5 µM), en
H. pylori UreG dimeriza uniendo ión zinc (Kd 0.33
µM) o se mantiene en forma monomérica uniendo
dos iones níquel con menor afinidad (Kd 10 µM),
mientras que en Mycobacterium tuberculosis y So-
porosarcina pasteurii poseen proteína UreG dimé-
rica que puede unir dos iones Zinc (Kd ~ 40 µM)
y más débilmente níquel[43,44], teniendo para M.
tuberculosis una kcat de 0.01 min-1 [56] mientras que
UreG de S. pasteurii tiene una kcat de 0.04 min-1
[55], lo cual demuestra que por si solas mantienen
una baja actividad GTPasa.
Hasta la fecha no se cuenta con una estructura
de UreG libre, siendo el único modelo obtenido de
ella el PDB 4HI0 donde se muestra en unión con
otras proteínas accesorias. Sin embargo, esta pro-
teína accesoria de la ureasa es la única en presentar
homología de secuencia con otras proteínas. Tal es
el caso que el gen ureG en K. aerogenes presenta
25% de similitud a la secuencia de Escherichia coli
hypB, lo cual se ha aprovechado para crear mode-
los de UreG [55].
Estudios en Helicobacter pylori han demos-
trado que proteínas HypA y HypB son necesarias
para activar tanto la hidrogenasa como para tener
una completa actividad de ureasa, descartando
la posibilidad de que la ureasa requiere de hi-
drogenasa para su activación [57]. Se ha podido
cristalizar la proteína HypB, siendo resuelto por
difracción de rayos X, observando que esta pro-
teína es capaz de unir ión níquel. Mientras que
HypA presenta la capacidad como dímero de unir
dos iones Ni. En su estructura HypA contiene cin-
co residuos de histidina distribuidos dentro de la
proteína (His2, His17, His24, His79 e His95) sien-
do el residuo de Histidina-2 esencial para la unión
de níquel a la proteína [57].
Tanto la proteína UreG como HypB son GTPa-
sas, las cuales presentan un dominio de unión a
Figura 5. Topología del modelo construido de UreG de E. coli O157:H7. Los triángulos representan hebras β, círculos represen-
tan hélices α y las líneas representan giros β y asas.

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nucleótidos conservados [GXXXXGK(S/T)][53].
Sin embargo, a diferencia de la superfamilia de las
proteínas Ras, la topología de HypB mostrada en
la Figura 5, consiste en 7 láminas ß paralelas y 11
hélices α, lo cual las clasifica como proteínas clase
SIMIBI, que presentan topología distinta a TRA-
FAC [53].
La proteína HypB para llevar a cabo su función
forma dímeros [53]. Estudios en esta proteína de-
muestran residuo Lys59 esencial para su actividad
GTPasa [54], mientras que UreG en H. pylori modi-
ficación residuo Lys14 y en K. aerogenes expresada
en E. coli modificación Lys20 y Thr21 por alanina en
el motivo P-loop [52]provoca que carezca de activi-
dad lítica la ureasa. Sugiriendo estos análisis la im-
portancia de los residuos lisina y treonina, de unión
a GTP motivo P-loop tanto para K. aerogenes como
H. pylori, en la maduración de la ureasa [43]. Se ha
observado que la carencia de actividad ureolítica a
modificar en UreG residuo Lys14, es consistente
aun al añadir níquel [54], mientras modificaciones
en HypB residuo Lys59 restaura su actividad ureolí-
tica al añadir níquel [57].
Estudios recientes indican que en ciertas
especies, la activación de ureasa no requiere de
la proteína UreG, ya que en Helicobacter muste-
lae un patógeno gástrico en hurones, presenta
dos grupos de genes de ureasa: ureABIEFGH y
ureA2B2. Tanto estudios en H. mustelae como en
E. coli con expresión de genes ureA2B2 (UreA
es 57% idéntica a UreA2 y UreB es 70% idéntica a
UreB2 se observa actividad enzimática sin GTPa-
sa [43]. Esta ureA2B2 es una enzima que contiene
hierro lábil a oxígeno, lo cual puede indicar que
las bacterias han evolucionado [43]. La habilidad
de cepas de E. coli para formar ureasa de hierro
activa utilizando solo ureA2B2 implica que no se
requiere de las proteínas accesorias para carba-
milar el residuo de Lys.
Sin embargo, en la gran mayoría de estudios
sobre actividad ureolítica se ha observado un
máximo de actividad en presencia de UreG. Esto
convierte a UreG en un potencial blanco de con-
trol antimicrobiano, ya que interrumpiría la madu-
ración postraduccional de la ureasa, afectando la
colonización e invasión de tejidos, de especie con
actividad ureolítica. Siendo objeto de estudio de
esta tesis el conocer y extender el conocimiento
bioquímico y estructural de UreG bacteriana; el
establecer relaciones entre la estructura tridimen-
sional y el funcionamiento de UreG; lo que permi-
tirá identificar residuos esenciales para su buen
funcionamiento pudiendo así desarrollar o mejorar
inhibidores dirigidos contra especies productoras
de ureasa complejo (UreABC)3 y posiblemente for-
madoras de otros complejos.
MODELO ESTRUCTURAL
DE UREG DE E. COLI
La familia GTPasa-UreG generalmente presenta
cinco hélices largas y siete hebras cortas, encon-
trándose en algunas secuencias dos hélices adicio-
nales (H4 y H5) y una hebra (S4) [55]. Con base
en el modelo construido del monómero de EcUreG
O157:H7, mostrado en la Figura 5, se identifica la
presencia de siete hebras β y once hélices α conec-
tadas por medio de asas; estando involucrado el
20.48% de los residuos de la proteína en la formación
de hebras β, mientras que 42.92% de los residuos
forman hélices alfa, siendo el 36.59% restante com-
prendido por giros β y asas. La topología en el mo-
delo de EcUreG muestra que la mayor cantidad de
residuos hidrofóbicos están presentes en las hebras
β, constituyendo el núcleo hidrofóbico de la proteí-
na, mientras que en las hélices α se encuentra gran
cantidad de residuos anfipáticos, lo cual concuerda
con los resultados reportados previamente respecto
a la proteína UreG de Bacillus pasteuri [55].
La topología de esta proteína muestra la pre-
sencia de dos hojas β, como se aprecia en la Figura
6, siendo una formada por las hebras S1, S2, S3 y
S4 mostrada de color azul y la otra por S5, S6 y S7
mostrada en color amarillo. Las hebras se pliegan
en medio barril, teniendo topología tipo Rossmann
que hasta la fecha no ha sido descrito en UreG.
Esta proteína presenta en su estructura dos Cisteí-
nas (Cys28 y Cys72) apreciándose en el modelado
que únicamente Cys72 está disponible, la cual está
involucrada en la unión al ion metálico. A la vez,
presenta en su secuencia primaria dos Triptófanos
(Trp35 y Trp179) estando ambos disponibles, lo
cual permite calcular la unión de sustratos e inhibi-
dores mediante estudios de fluorescencia intrínse-
ca de la proteína.

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Figura 7. Muestra la conservación de los motivos G1, G2, G3, G4 y G5 en las proteínas UreG bacterianas gracados
usando WebLogo.
Figura 8. Posibles residuos implicados en la unión de magnesio. El ion metálico se modelo usando como templado la posición
de ion en el cristal de la enzima de H. Pilory: PDB 4LPS mientras que el GDP del PDB 4HI0 Mg2+

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Figura 6. Topología de las hojas β presentes en la estructura
tridimensional de UreG. Se muestra la supercie de van der
Walls y en cartoon las hebras.
Los análisis estructurales realizados por
Zambelli [56], determinaron que las secuencias
conservadas de las proteínas UreG predominan
en las asas más que en las hebras y hélices, su-
giriendo que estas últimas regiones solo son ne-
cesarias para conferir la estructura general de la
proteína. A partir del alineamiento múltiple de
las secuencias de proteínas UreG bacterianas, se
logró determinar la diversificación de importan-
tes motivos conservados presentes en las asas,
posiblemente involucrados en la unión de GTP
y Ni2+ así como en la catálisis y especificidad por
el nucleótido; siendo la conservación de los mo-
tivos: (1) G1 (P-loop) con secuencia GPVG[S/R]
GKT localizado en la región N-terminal, (2) G2
(Swiss I) con secuencia TNDIYT[K/Q/R]E, (3)
G3 (Swiss II) con secuencia ESGGDN, (4) G4 con
secuencia NK[T/I/S/V]D y (5) G5 con la secuen-
cia más variable [N/D/S/A][L/M/V][K/R/H/S]
entre estos motivos (Figura 7).
El motivo P-loop está localizado entre la hebra
S1 y hélice H1, situado a un lado de un búcle entre
la hebra S4 y S5. Observándose Switch I entre la
hebra S2 y hélice H2 mientas que Switch II entre
la hebra S4 y S5. Se refiere que los motivos G1, G3,
G4 y G5 en la superfamilia de las GTPasas peque-
ñas son los responsables de reconocimiento, unión
e hidrólisis junto con la interacción con el cofactor
Mg2+, concordando con el modelo propuesto, deter-
minando que los residuos en EcUreG con alta pro-
babilidad de participar en la unión de Mg2+ sean: (1)
Lys20, (2) Thr21 presentes en el motivo P-loop, (3)
Asp43 en motivo G2 y (4) Glu104 en el motivo G3,
mostrados en la Figura 8, donde a la vez se apre-
cia una posible interacción del residuo Asp43 con
Lys137 de la otra subunidad y del residuo Glu104
Figura 9. Identicación de motivos G en el dímero de UreG E. coli: G1 (residuo 14-21), G2 (residuo 41-48), G3 (residuo 104-
109), G4 (residuo 151-154) y G5 (residuo 183-185); señalando posibles residuos implicados en la unión con UreF, identicados
mediante alineamiento con el PDB 4HI0.

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con Thr41 presente en el motivo G2 (involucrado en
la unión a la proteína activadora de GTPasa).
Con base en la importancia del motivo G2, se
realizó un alineamiento de los residuos implicados
en la unión de UreG con UreF identificados por
Fong y colaboradores (2013), apreciando en nues-
tro modelo que el motivo G2 no participa directa-
mente en la unión con la proteína accesoria UreF
como se muestra en la Figura 9, señalando los po-
sibles residuos implicados en esta unión por parte
de EcUreG (Glu68, Gly70, Asp80, Ser82, Ser115,
Glu117, Arg136, Lys137 y Lys144). A pesar de ello
se observó que el motivo G2 está estrechamen-
te ligado con el residuo ácido glutámico 68 (color
rojo) y el residuo lisina 137 (color amarillo), donde
el residuo Glu68, presente entre la hebra S3 y héli-
ce H4, y el residuo lisina 137 de la otra subunidad
(ubicado en la hélice α 7) siendo posiblemente que
interacciones con UreF modifiquen indirectamente
el motivo G2 de su conformación original. Lo cual
sugiere que la interacción de UreG con UreF, a par-
tir del previo complejo UreD[H]/UreF dado que
esta unión modifica asas flexibles en UreF [44,48],
confiriendo un incremento en la actividad GTPasa
intrínseca a UreG.
El modelo de UreG permitió identificar dos do-
minios independientes separados por la hebra S5,
siendo uno identificado como dominio de unión a
Figura 10. Dominios de unión al ligando GDP-Mg2+ y Ni2+ los cuales se obtuvieron de su proteína homóloga 4HI0 y 4LPS,
respectivamente.
Figura 11. Residuos implicados en la interacción con el nucleótido y níquel, resaltando residuo Lys137 y Val159 como impor-
tantes en catálisis e unión respectivamente, así como residuos Arg78 e Asn109 implicados en unión de níquel. El ligando GDP
se obtuvo del PDB 4HI0 mientras que Ni y agua del PDB 4LPS.

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nucleótido y el otro como dominio catalítico, los
cuales se muestran en la Figura 10, junto con los
ligando GDP, Mg2+ y níquel. La estequiometría de
UreG es de dos sitios activos y un sitio de Ni, por lo
cual es un dímero obligado para su función biológi-
ca como transportador de ión níquel, estando estas
cavidades comunicadas de alguna forma.
Los residuos identificados mediante el modelo
cuya interacción resulta más probable con el ligan-
do GDP y Ni se muestran en la Figura 11, resaltan-
do Lys137 y Val159 como residuos importantes en
la unión del nucleótido así como posiblemente im-
plicado Lys137 en la actividad catalítica. A la vez,
en la cavidad de unión a Ni se aprecia que Arg78
e Asn109 son quizá residuos importantes tanto en
la unión como en la dimerización de UreG, ya que
mantienen estable (posiblemente en dos conforma-
ciones siendo una abierta y otra cerrada) la cavidad
de unión a níquel.
El análisis de los residuos implicados en la co-
municación entre la cavidad unión a nucleótido y
cavidad unión a metal, permitieron identificar una
cavidad extra que hasta la fecha no ha sido repor-
tada. Posiblemente esta cavidad esté involucrada
en un aumento de la actividad enzimática por parte
de UreG del complejo metalochaperonina (UreG/
F/D[H]), permitiendo la entrada de sustratos como
bicarbonato, el cual ha sido reportado por Fong y
colaboradores (2013) que incrementa la actividad
hidrolítica hasta 10 veces. En el modelo propues-
to se logró identificar como posibles residuos im-
plicados en la comunicación de las cavidades en la
subunidad A: Tyr45, Cys72 e His74 mientras que
en la subunidad B: Cys72, His74, Asn109, Ser111 y
Lys137 siendo todos, a excepción de Lys137 mos-
trados en la Figura 12. Estudios de mutagénesis
sitio dirigido in sílico, no mostrados, sugieren que
debe presentarse un cambio conformacional gran-
de que permita la comunicación de los dos sitios,
dado que cambios conformacionales individuales
de los residuos, no permiten la comunicación de las
cavidades.
Figura 13. Potencial electrostático molecular supercial UreG de E. coli, el monómero representado en la parte superior y el
dímero en la parte inferior., A) Se resalta de color morado residuos con pKa calculados mediante Propka fuera del rango de lo
normal siendo para el monómero pKa calculados (Glu-60 3.66*; Glu-62 5.88*; Asp-127 3.94*; Glu-130 7.66*; Glu-198 6.12* y
Glu-199 3.96*), mientras que el dímero subunidad A (Asp-43 2.9*; Glu-104 7.03*; Asp-127 4* y Glu 130 9.61*) siendo estos muy
semejantes a los pKa cálculos en la subunidad dos; a la vez se muestra de color rojo (hélices), en amarillo (hebras) y en verde
(loop). B) Muestra la cavidad de unión a GTP. C) Muestra la cavidad de unión a níquel.

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Figura 12. Muestra cavidades apreciables en el modelo de
UreG, con posibles residuos implicados en la comunicación
las cavidades.
Para obtener mayor información estructural del
modelo EcUreG, se calculó el potencial electros-
tático tanto del monómero como del dímero, por
medio del servidor APBS (http://apbs.org/) los
cuales se muestran en la Figura 13 junto con su
respectivo modelado en representación cartoon,
resaltando los residuos con pKa calculados fuera
del rango normal, sugiriendo que son posibles
residuos importantes de la proteína, resaltando
la presencia del residuo Asp43 previamente iden-
tificado como residuo implicado en la hidrólisis
de GTP, mostrando un pKa de 2.9, el cual normal-
mente tiene un pKa de 3.8 para su cadena radical.
El modelo se caracteriza por presentar gran parte
de su superficie con carga parcialmente negativa.
Como era de esperarse debido a la polaridad nega-
tiva del GTP, la cavidad de unión a este presenta
carga parcial positiva, mientras que la cavidad de
unión a níquel sorprende al tener carga parcial po-
sitiva ya que la polaridad del níquel es positiva.
Esto puede ser es consecuencia de emplear
como templado a UreG de H. pilory (PDH 4HI0),
el cual es un análogo del complejo E-Q y no del
complejo central E-PQ, es decir, que es un análogo
en donde se ha disociado el Ni+2 donde la carga
positiva del sitio de unión al metal es consistente
con la fuerza que permite la liberación de este.
DISCUSIÓN
Las ureasa y sus proteínas acceseorias son blan-
cos para el control antimicrobiano potenciales.
Los inhibidores de la ureasa pueden cloquear la
actividad, pero los inhibidores de las proteínas ac-
ceseorias, en especial de UreG, no solo abatirían
la actividad de la enzima, sino que evitan que se
active la ureasa. La selección de estos compues-
tos con propiedades de inhibidores, requiere una
comprensión detallada a nivel molecular del fun-
cionamiento de las proteínas. El análisis de la infor-
mación estrucutural disponible a la luz de estudios
comparativos mediante el uso de estrategias bioin-
formáticas permite no solo clasificar los datos, sino
generar criterios de búsqueda y selección de estos
compuestos.
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