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Zeitschrift für Feldherpetologie 23: 141–158 Oktober 2016
DNA-Barcoding der Amphibien und Reptilien Deutschlands
Oliver Hawlitschek
1,2
, Michael Franzen
2
& Frank Glaw
2
1
Institut de Biologia Evolutiva (CSIC-UPF), Passeig Marítim de la Barceloneta 37, ES-08003 Barcelona,
oliver.hawlitschek@gmx.de
2
Zoologische Staatssammlung München (ZSM-SNSB), Münchhausenstr. 21, D-81247 München,
michael.franzen@zsm.mwn.de, frank.glaw@zsm.mwn.de
DNA barcoding of the amphibians and reptiles of Germany
DNA barcoding is a method for species identification in all organisms using a short,
standardized DNA fragment, the so-called barcode. In science, barcoding is particu-
larly useful for identifying eggs or larvae whose identification is otherwise difficult,
and for detecting cryptic species. Other applications include the rapid detection of
newly introduced species of pests and parasites. However, the successful use of bar-
coding requires a genetic database based on reliably identified reference sequences.
Hawlitschek et al. (2016) present such a database for the herpetofauna of Germany.
All species except the hybridogenic green frog complex could be safely identified us-
ing barcodes. Subspecies could also be identified in fire salamanders and grass sna-
kes. Furthermore, distinct genetic lineages without any current taxonomic status
were identified in grass snakes, adders, and wall lizards. These lineages were tenta-
tively assigned to clades with geographic references detected in previous works.
Concludingly, DNA barcoding will likely extend its influence on many fields of ap-
plication also in herpetology.
Key words: COI Barcoding, identification, amphibians, reptiles, Germany, Bavaria.
Zusammenfassung
DNA
-
Barcoding ist eine Methode zur Artbestimmung aller Organismen an Hand ei-
nes kurzen, standardisierten Fragments ihrer DNA, dem sogenannten Barcode. Bar-
coding ist im wissenschaftlichen Bereich besonders nützlich bei der Bestimmung
schwer determinierbarer Eier- und Larvenstadien und der Entdeckung kryptischer
Arten (Abb. 1, 2). Die Methode kann z. B. ohne Spezialwissen zur raschen Erfassung
neu eingeschleppter Arten von Schädlingen und Parasiten genutzt werden. Zum er-
folgreichen Einsatz des Barcoding ist aber eine genetische Datenbank sicher be-
stimmter Referenzsequenzen nötig. In der Arbeit von Hawlitschek et al. (2016) wird
eine solche Datensammlung für die deutsche Herpetofauna vorgestellt. Mit Aus-
nahme des Hybridkomplexes der Wasserfrösche konnten alle Arten eindeutig durch
Barcodes bestimmt werden. Auch die Bestimmung von Unterarten bei Feuersala-
mander und Ringelnatter war möglich. Über die bestehende Taxonomie hinaus
konnten genetische Linien z. B. bei Ringelnatter, Kreuzotter und Mauereidechse i-
dentifiziert werden, die in Anlehnung an bereits bestehende Arbeiten versuchsweise
in einen geographischen Bezug gesetzt wurden. DNA Barcoding ist eine zukunfts-
trächtige Methode, die voraussichtlich weiteren Eingang in viele Anwendungsberei-
che auch in der Herpetologie finden wird.
Schlüsselbegriffe: COI-Barcoding, Bestimmung, Amphibien, Reptilien, Deutschland,
Bayern.
© Laurenti-Verlag, Bielefeld, www.laurenti.de
142 Hawlitschek, Franzen & Glaw
Einleitung
Der kürzlich erschienene Artikel „Comprehensive DNA barcoding of the herpetofau-
na of Germany“ (Hawlitschek et al. 2016) beschreibt die Ergebnisse einer vorwiegend
an der Zoologischen Staatssammlung München (ZSM) durchgeführten genetischen
Studie über die Herpetofauna Deutschlands mit einem Schwerpunkt auf Bayern. Ziele
des hier vorliegenden Artikels sind, die zuvor genannte Arbeit in deutscher Sprache
zusammenzufassen, Hintergründe und Anwendungsmöglichkeiten des DNA Barco-
ding zu erklären und für die bayerische Herpetofauna relevante Ergebnisse spezifisch
zu beleuchten.
Abb. 1: Die Bestimmung von Amphibienlarven nach äußeren Merkmalen ist bei älteren Stadien oft
gut möglich. Im Bild von oben nach unten: Gelbbauchunke, Knoblauchkröte, Moorfrosch, Grasfrosch.
The identification of larval amphibians using external characters is often easy in older developmental
stages. From top to bottom: yellow-bellied toad, common spadefoot, moor frog, common frog.
DNA-Barcoding der Amphibien und Reptilien Deutschlands 143
Abb. 2: Bei jungen Larven und Eiern stößt die Bestimmung nach äußeren Merkmalen häufig an ihre
Grenzen (links oben nach rechts unten: Teichmolch, Moorfrosch, Knoblauchkröte, Wechselkröte).
DNA-Barcoding bietet in solchen Fällen eine verlässliche Alternative.
The morphological identification of young larval stages or even eggs of amphibians can be rather
challenging (top left to bottom right: common newt, moor frog, common spadefoot, green toad).
DNA barcoding provides a reliable alternative for such cases.
Was ist DNA-Barcoding?
Die korrekte Zuordnung von Individuen zu formell beschriebenen Arten ist eine der
wesentlichen Grundlagen der Biologie. Bei derzeit mindestens ca. 1,5 Millionen be-
schriebenen Arten von Organismen weltweit (Costello et al. 2013) ist dies jedoch keine
leichte Aufgabe. Mit Ausnahme eines verschwindend geringen Anteils können viele
Arten nur von Experten bestimmt werden, von denen es aber nur wenige gibt. Die
Betrachtung praktisch jeder zoologischen Sammlung zeigt zudem schnell auf, dass
auch Experten gelegentlich Fehler bei der Artbestimmung unterlaufen, deren Konse-
quenzen dann über Jahrzehnte in der Literatur sichtbar sind und die auch die Ergeb-
nisse von Folgestudien z. B. in den Bereichen der Ökologie und des Naturschutzes
verfälschen (Bortolus 2008). Solange also eine Artbestimmung nur auf dem bisher
üblichen morphologischen Weg durch Experten möglich ist, ist ein Großteil der ei-
gentlich vorliegenden taxonomischen Kenntnis in der Praxis kaum zugänglich.
144 Hawlitschek, Franzen & Glaw
Seit ab den 1990er Jahren molekulargenetische Methoden in der systematischen Biolo-
gie weitere Verbreitung fanden, suchten Wissenschaftler auch nach Möglichkeiten,
diese Methoden zur Artbestimmung einzusetzen. Prinzipiell ist dies möglich, da sich
ja bereits Individuen sexuell reproduzierender Arten in ihrem Erbmaterial (ihrer
DNA) unterscheiden und somit umso größere Unterschiede zwischen Arten vorlie-
gen. Vollständige Genome, also komplette Sätze der DNA eines Individuums, enthal-
ten jedoch sehr viele Informationen: das menschliche Genom besteht beispielsweise
aus über drei Milliarden Basenpaaren („Buchstaben“). Ihre Auswertung ist daher sehr
teuer und aufwändig und somit zur einfachen Artbestimmung nicht praktikabel.
Folglich galt es, einen kurzen Abschnitt des Genoms zu finden, der bei allen Tierarten
lokalisiert werden kann und dennoch im zwischenartlichen Bereich ausreichend Un-
terschiede aufweist. Da dieser Abschnitt bei jedem Tier wie der Strichcode (engl. „Bar-
code“) einer Ware im Supermarkt „ausgelesen“ werden könnte, wurde der Begriff des
DNA-Barcoding geprägt.
Hebert et al. (2003) schlugen als Standard für das DNA-Barcoding bei Tieren das Cy-
tochrom C Oxidase I Gen (COI) vor. Dieses Gen erfüllt die eben beschriebenen Krite-
rien, und der beim Barcoding betrachtete Abschnitt ist nur 644 Basenpaare lang. Als
Gen aus der mitochondrialen DNA wird es ausschließlich über die Weibchen vererbt,
was bei populationsgenetischen Studien berücksichtigt werden muss, auf Artebene
aber i. d. R. keine Rolle spielt. COI wurde bereits lange zuvor bei phylogenetischen
Untersuchungen verwendet, um Verwandtschaftsverhältnisse nahe verwandter Arten
aufzuklären (z. B. Boulter et al. 1972, Brown et al. 1994). Seit 2003 wurden Beispiele für
zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten des Barcoding veröffentlicht. Im wissenschaft-
lichen Bereich wird die Methode, neben der reinen Bestimmung bereits bekannter
Arten, auch zur Ersterfassung taxonomisch schlecht bearbeiteter Artengemeinschaften
eingesetzt. Dies ist insbesondere bei Wirbellosen der Tropen sinnvoll, wo Taxonomen
häufig mit Hunderten unbeschriebener Arten konfrontiert werden (Smith et al. 2005,
Hajibabaei et al. 2007, Nagy et al. 2013). Barcoding kann so eine Vorsortierung der
Belegexemplare zur späteren eigentlichen taxonomischen Bearbeitung liefern. Auch
innerhalb bereits beschriebener Arten wurden durch Barcoding schon zahlreiche
kryptische Arten aufgedeckt, die in der Folge zumeist durch morphologische und/
oder ökologische Daten bestätigt wurden (Hebert et al. 2004).
Auch im anwendungsorientierten Bereich sind die Möglichkeiten des Barcoding viel-
fältig. Seltene oder exotische Parasiten oder Schädlinge, zu deren herkömmlicher De-
terminierung fähige Experten möglicherweise erst aufwändig gesucht werden müss-
ten, können durch Barcoding schnell und zuverlässig bestimmt werden. So konnte
z. B. an der ZSM eine Yak-Dasselfliege (Hypoderma sinense) an einer Nepal-Touristin
sowie die Obstschädlinge Kirschessigfliege (Drosophila suzukii) und Sanddornfrucht-
fliege (Rhagoletis batava) nachgewiesen und auch im Ei- oder Larvenstadium bestimmt
werden. In der Lebensmittelsicherheit können auch verarbeitete Produkte aus Fleisch,
Fisch und Pflanzen artgenau bestimmt werden, um z. B. Etikettenschwindel aufzude-
cken (siehe Website http://www.barcoding-zsm.de/pressemitteilungen).
Wie jede Methode hat jedoch auch das Barcoding seine Grenzen. Die Sequenzierung
von COI gelingt nicht bei allen Artengruppen mit gleich hoher Erfolgsquote, was aber
ein technisches Problem darstellt und durch die Fortentwicklung der Labormethoden
DNA-Barcoding der Amphibien und Reptilien Deutschlands 145
zunehmend an Bedeutung verliert. Als problematischer ist jedoch die Auswertung der
Daten anzusehen. Nicht alle Arten können eindeutig an Hand ihrer Barcodes deter-
miniert werden, etwa weil es zu Hybridisierung mit anderen Arten kommt oder weil
sie evolutionsgeschichtlich so jung sind, dass sich im COI-Gen noch keine klaren Un-
terschiede zu nahe verwandten Arten herausgebildet haben. Dies ist beispielsweise
bei fast 10 % der in Deutschland heimischen Wildbienenarten der Fall (Schmidt et al.
2015). Auf der anderen Seite spiegelt COI zwar auf der Artebene meist sehr gut die
Verwandtschaftsverhältnisse wider, ist auf höheren taxonomischen Ebenen jedoch oft
ungenau (Hebert & Gregory 2005). Die Ergebnisse von Barcoding-Studien werden
meist in der Form eines Stammbaums abgebildet, was viele Betrachter dazu anregt,
Aussagen zur Phylogenie daraus abzuleiten. Diesen Anspruch kann das Barcoding -
anders als umfangreichere, auf einem Satz verschiedener genetischer Marker beru-
hender Analysen - jedoch nicht erfüllen.
Zusammengefasst stellt das DNA-Barcoding also eine Methode dar, die die Arbeit
taxonomischer Experten erleichtert und dadurch effizienter macht. Sie kann und wird
taxonomische Expertise aber nicht ersetzen.
DNA-Barcoding in Deutschland
Weltweit gehört das Projekt DNA-Barcoding Fauna Bavarica (BFB, http://www. fau-
nabavarica.de/) zu den Vorreitern unter allen Barcoding-Projekten. Es wurde 2009 von
Wissenschaftlern der ZSM ins Leben gerufen und wird vom Bayerischen Staatsminis-
terium für Bildung und Kultus, Wissenschaft und Kunst finanziell gefördert. Das Ziel
besteht darin, möglichst alle der ca. 35 000 bekannten bayerischen Tierarten in der
Barcoding-Datenbank zu erfassen. Beim derzeitigen Projektstand (2016) liegen Barco-
des von ca. 15000 Arten vor. Seit 2012 existiert auch das Projekt German Barcode of
Life (GBOL, https://www.bolgermany.de/), das auf das Barcoding aller Tier-, Pflan-
zen- und Pilzarten Deutschlands abzielt. Zwischen den beiden Projekten besteht eine
enge Zusammenarbeit.
Der Schwerpunkt der meisten Barcoding-Projekte, so auch der deutschen, liegt im
Bereich der Entomologie. Dies liegt zum einen darin begründet, dass Insekten die mit
Abstand artenreichste Tiergruppe sind und ein Großteil dieser Arten mit den üblichen
morphologischen Methoden nur von einem sehr kleinen Kreis ausgewiesener Exper-
ten bestimmt werden kann. Insofern besteht in der Entomologie ein besonders großer
Bedarf an alternativen Bestimmungsmethoden. Zum anderen sind entomologische
Sammlungen, in denen Belegexemplare überwiegend getrocknet aufbewahrt werden,
eine besonders gute Quelle zum Aufbau einer Barcode-Datenbank, denn Trockenma-
terial ist zumeist auch nach Jahrzehnten noch gut für molekulargenetische Untersu-
chungen verwendbar. Amphibien, Reptilien und Tiere aus zahlreichen weiteren
Gruppen hingegen werden zumeist in 75 %igem Alkohol oder in Formalin konser-
viert, was in den meisten Fällen die DNA schon nach wenigen Wochen oder Monaten
so weit schädigt, dass die Belegexemplare nicht mehr für molekulargenetische Unter-
suchungen geeignet sind. Im modernen Sammlungsbetrieb wird heute daher i. d. R.
eine gesonderte Gewebeprobe in 96 %igem unvergällten Alkohol gelagert, in der die
DNA besser konserviert wird. Hinzu kam, dass die Sequenzierung von COI, die im
146 Hawlitschek, Franzen & Glaw
Barcoding ursprünglich für Wirbellose optimiert war, erst auf die Erfordernisse von
Reptilien und Amphibien angepasst werden musste.
In der Folge gelangten Amphibien und Reptilien erst vergleichsweise spät ins Au-
genmerk der Barcoding-Projekte, zumindest derer, die im Rahmen von BOLD operier-
ten. Auf Grund der oben beschriebenen Schwierigkeiten mit COI wurde auch die
Nutzung anderer Genomabschnitte, z. B. des 16S rRNA Gens (Vences et al. 2005), vor-
geschlagen. Erst später erschienen die ersten auf COI-Barcoding beruhenden Artikel
über Reptilien (Nagy et al. 2012, Hawlitschek et al. 2013) und Amphibien (Che et al.
2012, Xia et al. 2012, Huang et al. 2013, Perl et al. 2014). Seit 2013 werden Barcodes zu
herpetologischen Themen auch in der in China angesiedelten „Cold Code“-Initiative
gesammelt, dessen Name in Anspielung auf die „kaltblütige“ Zielgruppe gewählt
wurde (Murphy et al. 2013).
In der Herpetologie sind viele der oben beschriebenen Hauptanwendungsgebiete des
Barcoding von geringerer Relevanz. Taxonomische Expertise ist hier vergleichsweise
deutlich weniger limitiert als in der Entomologie, und es besteht auch keine besondere
Relevanz im Lebensmittelbereich. Die Bestimmung von Laich und Larven oder von
Straßenverkehrsopfern könnte jedoch deutlich erleichtert werden. Insbesondere das
Vorliegen einer globalen Referenzdatenbank kann auch in Mitteleuropa viele Vorteile
bieten. Sie würde erlauben, exotische Arten auch ohne Kenntnisse über deren Her-
kunft schnell und sicher zu bestimmen. Moderne Sequenzierungsmethoden bieten
darüber hinaus noch weitere Möglichkeiten. Amphibien und Reptilien könnten aus
Mageninhalten oder Ausscheidungen von Beutegreifern identifiziert werden, da auch
daraus die DNA der Beutetiere extrahiert werden kann (Valentini et al. 2009). Wie
Studien gezeigt haben, können sogar aus der in einer Wasserprobe enthaltenen DNA
die Sequenzen der in dem jeweiligen Gewässer vorkommenden Tierarten ausgelesen
und durch Barcoding identifiziert werden (Hajibabaei et al. 2011, Thomsen et al. 2012).
Diese fortschrittlichen Methoden, im Englischen als „environmental DNA Barcoding“
bezeichnet, befinden sich teilweise noch in der Entwicklung, versprechen jedoch Zu-
gang zu umfangreichen neuen Forschungsfeldern. Auf diese Weise wird zum Beispiel
gerade versucht, genetische Spuren des Alpenkammmolches (Triturus carnifex) im
Berchtesgadener Land nachzuweisen. Aus der Region liegen bisher ältere Funde von
morphologisch intermediären Kammmolchen vor (Schmidtler 1976), die allerdings
nach neueren genetischen Untersuchungen bisher nicht bestätigt werden konnten
(Maletzky et al. 2008). Mithilfe des „environmental DNA Barcoding“ könnte es im
besten Fall also gelingen, eine weitere Amphibienart oder deren genetische Spuren in
Deutschland nachzuweisen.
Barcoding-Datenbanken und die Erzeugung von Daten
Die Wirksamkeit des DNA-Barcoding beruht auf der Möglichkeit, ein Individuum
mittels seines Barcodes schnell und zuverlässig einer Tierart zuzuordnen. Dies ge-
schieht durch den Abgleich des neu ausgelesenen Barcodes mit einer Referenzdaten-
bank, die bereits zuverlässig bestimmte Barcodes der entsprechenden Art beinhaltet.
Der Aufbau und die Ausweitung dieser Datenbank sind das primäre Ziel der meisten
Barcoding-Projekte weltweit. Um maximale Synergieeffekte zu nutzen, stellen seit 2007
DNA-Barcoding der Amphibien und Reptilien Deutschlands 147
Abb. 3: DNA-Barcode-Eintrag auf der Internetseite der BOLD-Datenbank (http://www.boldsystems.
org/). Jeder Barcode ist verknüpft mit Daten zu Fundort und -zeitpunkt, Sammler und Identifizierer,
Beleg und einem Belegfoto. Die Daten sind frei zugänglich.
DNA barcode entry on the website of the BOLD database (http://www.boldsystems.org/). Every bar-
code is is linked to information on locality, collection time, collector, identifier, voucher and a photo-
graph. The data is publicly accessible.
fast alle dieser Projekte, so auch die deutschen, ihre Daten einer globalen Datenbank
mit dem Namen BOLD (Barcode of Life Database: Ratnasingham & Hebert 2007) mit
Sitz an der Universität von Guelph, Kanada, zur Verfügung. Heute (August 2016)
enthält die Datenbank fast 4,7 Millionen Barcode-Sequenzen von über 172000 be-
schriebenen Tierarten (Abb. 3).
148 Hawlitschek, Franzen & Glaw
Um die Qualität der Daten auf BOLD zu sichern, werden nur solche Daten final ak-
zeptiert, die strengen Standards gerecht werden. Jede Barcode-Sequenz benötigt voll-
ständige Metadaten zu Fundort, Zeitpunkt, Sammler und Bestimmer. Ein Belegex-
emplar muss in einer öffentlichen Sammlung hinterlegt und der Datenbankeintrag mit
einem Foto dieses Exemplars verknüpft sein. Sind diese Kriterien erfüllt, werden die
Daten öffentlich zugänglich gemacht und können so von jedem Nutzer per Internet
abgefragt werden.
Um einen Barcode zu erzeugen, wird aus dem fraglichen Tier, zumeist aus einer Ge-
webeprobe, dessen DNA extrahiert. Diese wird mittels Polymerasekettenreaktion ver-
vielfältigt und auf einem Sequenzierer ausgelesen. Der gesamte Vorgang kann in je-
dem regulär ausgestatteten molekulargenetischen Labor durchgeführt werden und
nimmt, wenn in andere Arbeitsabläufe integriert, zwei bis drei Tage in Anspruch. In
prioritären Fällen kann die Arbeitszeit auf wenige Stunden verkürzt werden. Aus
Gründen der Effizienz werden jedoch meist mehrere Proben auf einmal bearbeitet.
Üblich ist hier die Einheit von 95 Proben.
Im vorliegenden Projekt wurde DNA aus zumeist frisch gewonnenen Proben extra-
hiert. Dabei handelte es sich entweder um Gewebeproben von gesammelten Tieren
und Totfunden oder um Schleimhautabstriche aus dem Maul oder von der Kloake.
Belegexemplare wurden in der ZSM hinterlegt. Eine Reihe von Proben wurde auch
vom Zoologischen Forschungsmuseum Alexander Koenig, Bonn (ZFMK), beigesteuert.
Die Bestimmung von Wasserfröschen erfolgte nach den in Mayer et al. (2013) be-
schriebenen Methoden. Die Nomenklatur der Amphibien folgte der Datenbank
„Amphibian Species of the World“ (Frost 2016) mit Ausnahme der Bufoniden. In un-
serer Arbeit wurde der Gattungsname Bufo beibehalten (anstelle von Epidalea für B.
calamita und von Bufotes für B. viridis). Weiterhin wurden vorläufig alle Wechselkröten
in Deutschland als eine Art betrachtet, also der von Stöck et al. (2006) vorläufig vorge-
schlagene Namen B. variabilis für eine divergente, genetische Linie von B. viridis nicht
verwendet.
Ergebnisse
In Hawlitschek et al. (2016) wurden insgesamt 248 DNA Barcodes aus 307 Proben ge-
wonnen, was einem Sequenzierungserfolg von 80,8 % entspricht. Die Barcodes verteil-
ten sich auf insgesamt 36 Arten, darunter die 13 in Deutschland heimischen oder ein-
geführten und etablierten Arten von Reptilien und 21 von Amphibien. Bei den
verbleibenden Arten handelt es sich um Emys trinacris, die zum Vergleich mit der Eu-
ropäischen Sumpfschildkröte E. orbicularis hinzugezogen wurde, und um ein Exemp-
lar des exotischen Antillen-Pfeiffrosches (Eleutherodactylus aff. coqui) aus den Ge-
wächshäusern des Botanischen Gartens München.
Abbildung 4 zeigt den berechneten Barcoding-Baum. Wie bereits zuvor beschrieben,
ist dieser nur sehr eingeschränkt zur Ableitung von Verwandtschaftsverhältnissen
höherer taxonomischer Ebenen geeignet. Zwar werden alle Gattungen und Familien
korrekt zugeordnet; auf höherer Ebene werden jedoch manche Reptilien näher an
Amphibien als an anderen Reptilien abgebildet. Dies liegt daran, dass das COI-Gen im
DNA-Barcoding der Amphibien und Reptilien Deutschlands 149
Vergleich zwischen phylogenetisch weit voneinander entfernten Arten mit Mutatio-
nen saturiert und damit nicht mehr informativ ist, so dass die Zuordnungen auf die-
sen Ebenen tendenziell zufällig geschehen.
Auf Artniveau wiederum sind die Ergebnisse zuverlässig: Jeder Barcode wird deut-
lich näher an artgleichen Barcodes abgebildet als an artfremden. Die Barcodes bilden
sogenannte Cluster, also Gruppen sehr ähnlicher Sequenzen, die sich untereinander
deutlich weniger unterscheiden als von Barcodes anderer Cluster. Jede Art entspricht
einem Cluster oder einer kleinen Gruppe von Clustern. Die einzige Ausnahme bilden
die Wasserfrösche der Gattung Pelophylax. Diese bilden zwei Cluster, eines für die
genetische Linie von P. lessonae und eines für die von P. ridibundus. Da das COI-Gen
nur über die Weibchen vererbt wird, findet darin keine Vermischung statt, sodass
Hybriden (P. esculentus) nicht erkannt werden. Darüber hinaus finden sich einige P.
lessonae zugeordneten Barcodes im Cluster von P. ridibundus und umgekehrt, was dar-
auf hinweist, dass morphologisch einer Art zuzuordnende Tiere auch die Mitochond-
rien der jeweils anderen Art, wohl über die Hybridstufe vermittelt, tragen können.
Abb. 4: Barcoding-Baum, erstellt in BOLD und dargestellt mit FigTree 1.4.2. Alle Arten werden als
separate Cluster abgebildet; so sind die Barcodes verschiedener Arten unterscheidbar. Auf höherer
taxonomischer Ebene weicht die Darstellung von den tatsächlichen Verwandtschaftsverhältnissen ab;
DNA Barcoding ist also nicht zur Rekonstruktion tieferer Phylogenien geeignet.
Barcoding-tree created in BOLD and displayed using FigTree 1.4.2. All species are retrieved in sepa-
rate clusters, allowing species identification using the barcodes. The tree is not in accordance with the
accepted phylogeny at higher taxonomic levels; therefore, DNA barcoding is not an acceptable me-
thod for the reconstruction of deeper phylogenies.
150 Hawlitschek, Franzen & Glaw
Abb. 5: Barcoding-Ergebnisse für einige Reptilienarten: (A) Ringelnatter: Die Unterscheidung zwi-
schen Barrenringelnatter und Nominatform ist möglich. Innerhalb der Nominatform werden zwei
genetische Linien sichtbar, die möglicherweise den Linien 3 und 4 aus Kindler et al. (2013) entspe-
chen. (B) Kreuzotter: Die Probe aus der Steiermark entspricht wahrscheinlich dem „alpine clade“ von
Kalyabina-Hauf et al. (2004). Alle bayerischen Proben dürften dagegen zum „Northern clade“ gehö-
ren. (C) Sumpfschildkröte: Eine klare geographische Strukturierung der europäischen Proben ist
nicht zu erkennen. Die Unterscheidung zu Emys trinacris ist jedoch möglich. (D) Knoblauchkröte:
Zwei genetisch klar getrennte Linien sind erkenntlich, die jedoch nicht in geographische Referenz zu
setzen sind. (E) Teichmolch: Die bayerischen Proben verteilen sich auf zwei deutlich unterscheidbare
genetische Linien nördlich bzw. südlich der Donau. (F) Feuersalamander: Die Unterscheidung zwi-
schen Salamandra salamandra terrestris und der Nominatform gelingt, die Differenzierung ist jedoch
gering. Innerhalb der Nominatform ist keine klare geographische Struktur zu erkennen.
Barcoding results for some reptile species: (A) Grass snake: Natrix natrix helvetica and N. n. natrix form
clearly distinct clusters. Two distinct lineages are visible in the nominate form, possible congruent
with the lineages 3 and 4 of Kindler et al. (2013). (B) Adder: The sample from Austria most probably
belongs to the 'alpine clade' detected in Kalyabina-Hauf et al. (2004). By contrast, all Bavarian samples
appear to belong to the 'North clade'. (C) European pond turtle: There is no clear geographic structu-
re within the European samples. However, Emys orbicularis is clearly distinct from E. trinacris. (D)
Two distinct genetic lineages are visible but cannot bet put into any geographic context. (E) Smooth
newt: The Bavarian samples form two distinct lineages North respectively South of the Danube River.
(F) Fire salamander: Salamandra salamandra terrestris is slightly distinct from the nominate form. No
geographic structure is visible within the nominate form.
DNA-Barcoding der Amphibien und Reptilien Deutschlands 151
Bei allen anderen Arten gelingt nicht nur ausnahmslos die Zuordnung sämtlicher In-
dividuen, in vielen Fällen kann zusätzlich eine populationsgenetische Struktur inner-
halb der Arten festgestellt werden (Abb. 5). Relativ schwache Strukturierungen treten
bei Blindschleiche (Anguis fragilis), Kreuzkröte (Bufo calamita) und Knoblauchkröte
(Pelobates fuscus) auf. Bei diesen Arten gelang es aber nicht, die genetische Diversität
mit einer geographischen Dimension in Bezug zu setzen. So treten die beiden vorge-
fundenen genetischen Linien der Knoblauchkröte mitunter am selben Fundort auf.
Weiterhin besteht bei diesen Arten die Schwierigkeit, dass zwar Studien zur Struktu-
rierung europäischer Populationen vorliegen (Beebee & Rowe 2000, Borkin et al. 2001,
Rowe et al. 2006, Crottini et al. 2007, Gvoždík et al. 2010, 2013, Litvinchuk et al. 2013).
Mitteleuropäische Populationen fanden jedoch in keiner dieser Arbeiten spezifische
Beachtung, sodass eine sichere Zuordnung der Daten von Hawlitschek et al. (2016) in
diesem Kontext nicht möglich ist. Gleiches gilt für den Teichmolch (Lissotriton vulga-
ris), bei dem in den vorliegenden Barcoding-Daten allerdings zwei genetische Linien
feststellbar sind, die Fundorten nördlich bzw. südlich der Donau entsprechen (vgl.
Weisrock et al. 2006).
Einige Arten zeigen eine stärkere interne genetische Differenzierung. Dies ist zum
Beispiel beim Feuersalamander (Salamandra salamandra) der Fall. Die beiden Unterar-
ten S. s. salamandra und S. s. terrestris können in unserem Fall durch Barcoding unter-
schieden werden, der Unterschied ist jedoch nicht deutlich größer als die Diversität
innerhalb von S. s. salamandra. Ob sich dieser Befund verallgemeinern lässt, müsste
aber durch eine umfangreichere Studie verifiziert werden. In der phylogeographi-
schen Studie zum Feuersalamander von Steinfartz et al. (2000) wurden keine Unter-
schiede in der mitochondrialen DNA zwischen S. s. salamandra und S. s. terrestris ge-
funden. Dies liegt jedoch vermutlich darin begründet, dass in dieser Studie ein ande-
res Gen, der D-Loop, untersucht wurde, das auf Populationsebene weniger informativ
ist als COI. Auch bei Steinfartz et al. (2000) liegt keine ausreichend dichte Beprobung
Mitteleuropas vor, um unsere Barcoding-Daten zuzuordnen.
Im Fall der Ringelnatter (Natrix natrix) wurden drei klar differenzierte Linien gefun-
den. Eine davon wird durch eine einzelne Probe der Barren-Ringelnatter (N. n. helveti-
ca) aus der Wahner Heide bei Köln (NRW) repräsentiert. Proben dieser Unterart aus
Bayern lagen nicht vor. Acht weitere Proben, alle aus Bayern, sind damit zur Nominat-
form N. n. natrix zu rechnen und bilden zwei Cluster, zum einen mit je einer Probe aus
Haunstetten südlich Augsburg und einer aus der Pupplinger Au südlich von Mün-
chen und zum anderen mit Proben vorwiegend aus dem Raum München, aber auch
aus Rosenheim und Jochenstein. Auch Kindler et al. (2013) fanden eine hohe Diversi-
tät mitochondrialer Linien im gesamteuropäischen Verbreitungsgebiet der Ringelnat-
ter, ohne jedoch COI-Daten zu verwenden, weswegen ein direkter Vergleich der DNA-
Sequenzen nicht möglich ist. In Deutschland kommen demnach neben der Barren-
Ringelnatter noch zwei genetische Linien der Nominatform vor, die als Linien 3 und 4
bezeichnet werden. Aus Bayern liegen dabei jedoch nur zwei Proben mit den Fundorten
„Mammendorf“ und „Passau“ vor, die beide zur Linie 4 gehören. In keiner der beiden
Studien lässt sich also eine klare geographische Trennlinie zwischen den beiden geneti-
schen Linien ziehen, weswegen eine sichere Zuordnung der Cluster von Kindler et al.
(2013) zu den Linien von Hawlitschek et al. (2016) nicht getroffen werden kann.
152 Hawlitschek, Franzen & Glaw
Abb. 6: Kreuzotter als Beispiel für eine Art mit bisher noch unzureichend bekannter genetischer Vari-
ation in Deutschland (Individuum des „northern clade“ aus dem Murnauer Moos).
Common Adder as an example for a species with an insufficiently understood genetic variation
within Germany (specimen of the „northern clade” from the Murnauer Moos, Bavaria).
Bei den Kreuzottern (Vipera berus) liegen Hawlitschek et al. (2016) fünf Proben vor. Die
am stärksten differenzierte Sequenz stammt aus der Steiermark, gefolgt von einer aus
dem Landkreis Garmisch-Partenkirchen. Drei weitere Sequenzen stammen aus den
Landkreisen Regen und Rhön-Grabfeld und sind nicht klar unterscheidbar. Diese
Struktur erinnert an die Arbeit von Kalyabina-Hauf et al. (2004) und darauf aufbau-
ende Studien, z. B. von Ursenbacher et al. (2006). Dort wurde eine genetisch deutlich
differenzierte alpine Linie („alpine clade“) der Kreuzotter vorgeschlagen, welche von
dem „Northern clade“ zu unterscheiden ist, der möglicherweise in Mitteleuropa do-
miniert (Abb. 6). In Bayern wurde die alpine Linie mittlerweile im Alpenraum östlich
des Inns nachgewiesen, Stichproben westlich davon (auch aus hochmontan-alpinen
Bereichen, z. B. Karwendelgebirge) waren jedoch nördlichen Populationsgruppen
zuzuordnen (Völkl 2010). Diese Daten legen nahe, dass einzig die Sequenz aus der
Steiermark von Hawlitschek et al. (2016) dem „alpine clade“ zuzurechnen ist, wäh-
rend alle weiteren Proben den nördlicheren Linien angehören. Aber auch hier stellt
sich das Problem, dass die genannten Vergleichsstudien nicht COI, sondern andere
genetische Marker verwendeten und die Daten nicht direkt vergleichbar sind. Vertie-
fende Untersuchungen zur Verbreitung der Linien in Bayern laufen jedoch derzeit.
Bei der Europäischen Sumpfschildkröte (Emys orbicularis) fanden Hawlitschek et al.
(2016) zahlreiche tiefe genetische Linien. Dies ist vermutlich darin begründet, dass bei
dieser Art Proben aus ganz Europa einbezogen wurden, auch mit dem Hintergrund,
die einzige verwendete deutsche Probe einzuordnen. Es zeigt sich, dass diese Einord-
nung nicht einfach ist: eine geographische Strukturierung der sonst aus Polen, Frank-
reich, Ungarn, Spanien und Italien stammenden Sequenzen ist nicht zu erkennen. Wie
von Velo-Antón et al. (2011) dargestellt, ist die heutige populationsgenetische Situati-
on der Sumpfschildkröte nur zu verstehen, wenn die umfangreichen historischen
Verbringungen dieser Tiere durch den Menschen berücksichtigt werden. Mit geogra-
DNA-Barcoding der Amphibien und Reptilien Deutschlands 153
phisch und genetisch umfangreicheren Datensätzen ist zwar eine Unterscheidung
verschiedener genetischer Linien der Sumpfschildkröte möglich (Fritz et al. 2007), der
Versuch der Zuordnung von Individuen zu diesen Linien nur an Hand von Barcodes
sollte jedoch nicht unternommen werden. Eine Unterscheidung z. B. von Emys trinac-
ris ist hingegen möglich (Fritz et al. 2005), weswegen die Artzuordnung nach DNA-
Barcodes auch bei der Sumpfschildkröte als zuverlässig einzustufen ist.
Besonders umfangreiche und komplexe Daten liegen von Mauereidechsen des Podar-
cis-muralis-Komplexes vor. In Bayern ist nur eine autochthone Population im Bereich
Oberaudorf-Kiefersfelden bekannt (Schmidtler & Schmidtler 1996, Schulte 2008), die
zugleich das bundesweit einzige natürliche Vorkommen der Südalpen-Linie P. m.
maculiventris-West der Art ist. Hingegen werden in Bayern viele größere Bahnhöfe
und angrenzende geeignete Habitate von teils großen, eingeführten oder verschlepp-
ten Mauereidechsen-Populationen besiedelt. Eine besondere „genetische“ Gefährdung
für die heimischen Vorkommen stellt sicherlich eine Hybridisierung mit ortsfremden
genetischen Linien dar, die bereits am Oberrheingraben durch eine dominante
Introgression eingeschleppter italienischer Linien weitläufig stattgefunden hat (Schul-
te et al. 2012, 2015). Zusätzlich besteht der Verdacht, dass Verdrängungseffekte durch
allochthone Mauereidechsen lokal sogar die Zauneidechse beeinträchtigen können
(Heym et al. 2013). Im Sinne eines wissenschaftlich fundierten Arten- und Populati-
onsschutzes ist daher die Frage nach der Bodenständigkeit oder der genetischen Iden-
tität einer Population von hoher Bedeutung (Abb. 7; vgl. z. B. Bräu & Sacher 2009). Im
Feld stellt sich dieses Unterfangen aber aufgrund der großen morphologischen Varia-
bilität der Art als schwierig, wenn nicht unmöglich dar (Schulte et al. 2011).
In wesentlicher Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Schulte et al. (2011) sind
im Barcoding-Baum von Hawlitschek et al. (2016) drei übergeordnete Linien erkenn-
bar (Abb. 8): 1. Eine Mischung von Intergrades der Venetien-Linie (entspricht P. m.
maculiventris-Ost) und der Toskana-Linie (entspricht P. m. nigriventris), die durch Pro-
ben von allochthonen Populationen aus dem Raum Passau, Aschaffenburg und Mün-
chen repräsentiert wird. 2. Die Ostfranzösische Linie (entspricht P. m. brongniardii) mit
Proben aus Tittling und von einer autochthonen Population aus Wachenheim bei
Abb. 7: Einheimisch oder eingeführt? Die zuverlässige Bestimmung von Mauereidechsen unterhalb
der Artebene ist selbst für geübte Personen oft nicht möglich (Weibchen der Venetien-Linie P. m.
maculiventris Ost aus der eingeführten Population in Aschaffenburg).
Native of introduced? The reliable identification of wall lizards below the species level is often im-
possible even for specialists (female of the Venetian clade P. m. maculiventris East from an introduced
population in Aschaffenburg).
154 Hawlitschek, Franzen & Glaw
Mannheim. 3. Die Südalpen-Linie (P. m. maculiventris-West), zu der außer der auto-
chthonen Population aus dem bayerischen Inntal bei Oberaudorf auch allochthone
Populationen aus Rosenheim, München und Altötting zu rechnen sind. Eine Unter-
scheidung der allochthonen Sequenzen von autochthonen durch Barcoding war in
diesem Fall nicht möglich.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass zumindest manche allochthonen bayerischen Popu-
lationen auf mehrfache Verschleppungsereignisse zurückzuführen sind: So konnten
aus der Population am Münchner Südbahnhof Individuen der Venetien- und der
Südalpen-Linie nachgewiesen werden. Schulte et al. (2011) berichten zudem vom
Abb. 8: Barcoding des Podarcis muralis-Komplexes. Im wesentlichen werden die in Schulte et al. (2011)
vorgeschlagenen genetischen Linien auch hier detektiert. Eine Unterscheidung zwischen autochtho-
nen und allochthonen Haplotypen innerhalb dieser Linien ist jedoch nicht möglich. Kreise in der
Abbildung bezeichnen Fundorte in Bayern, die Farben stellen die genetischen Linien dar. Kleine
Kreise weisen auf Funde von Linien aus Schulte et al. (2011) hin, die in der Barcoding-Studie nicht
bestätigt werden konnten. In Passau konnten nur Barcodes der Venetien-Linie nachgewiesen werden,
obwohl die dortige Population als hybrid aus Venetien- und Toskana-Linie gilt.
Barcoding of the Podarcis muralis-complex. The lineages proposed in Schulte et al. (2011) are largely
retrieved. However, no distinction is possible between native and introduced haplotypes within these
lineages. Depicted circles represent localities in Bavaria, colors represent lineages. Small circles indi-
cate lineages detected in Schulte et al. (2011) but not in the barcoding study. Only barcodes of the
Venetian lineage were detected in Passau, although this population is considered hybrid between the
Venetian and Tuscany lineages.
DNA-Barcoding der Amphibien und Reptilien Deutschlands 155
Vorkommen der mittelitalienischen Marche-Linie an diesem Fundort. Darüber hinaus
stellten diese Autoren Vertreter der Ostfranzösischen Linie in Rosenheim fest, wäh-
rend die in Hawlitschek et al. (2016) verwendeten, dorther stammenden Sequenzen
zur Südalpen-Linie zählen.
Fazit und Ausblick
Obwohl das DNA-Barcoding Methoden verwendet, die denen der molekularen Phy-
logenetik oder Populationsgenetik ähneln, kann es weder die zuverlässige Rekon-
struktion von Stammbäumen noch von Populationsstrukturen gewährleisten. Dies ist
jedoch auch nicht das Ziel des Barcoding; dieses besteht vielmehr darin, durch den
Aufbau einer genetischen Datenbank die schnelle und standardisierte Bestimmung
von Arten durch den genetischen Barcode zu ermöglichen. Die oben mehrfach disku-
tierte Problematik, dass verschiedene Studien unterschiedliche und nicht direkt ver-
gleichbare genetische Marker verwenden, ist genau diejenige, die durch die Einfüh-
rung von COI als Standard für alle Tiergruppen beseitigt werden soll.
Wie einleitend erwähnt, besteht für das DNA-Barcoding eine Vielzahl von Anwen-
dungsmöglichkeiten. Voraussetzung für deren Umsetzbarkeit ist aber einerseits die
Vervollständigung der Referenzdatenbank, andererseits auch die Übernahme der Bar-
coding-Methode durch kommerzielle Anbieter. Langfristig kann es kaum die Aufgabe
wissenschaftlicher Institute öffentlicher Trägerschaft sein, solche Leistungen zu über-
nehmen. Dass ein entsprechendes Geschäftsfeld gerade im Entstehen ist, zeigt eine
jüngst erfolgte Firmengründung in München. Ein Hindernis hierbei mag sein, dass -
wie beschrieben - auch durch DNA-Barcoding nicht alle Arten eindeutig identifizier-
bar sind. Hier obliegt es den Forschungsinstituten, die öffentlich zugänglichen Daten
so zu strukturieren, dass mögliche Fehlerquellen klar aufgezeigt werden und so eine
Nutzung der Daten auch durch Nicht-Experten ermöglicht wird.
Technisch gesehen zählt DNA-Barcoding jedoch bereits heute zu den vergleichsweise
aufwandsarmen und preiswerten Methoden der Biotechnologie. Durch die rasante
Entwicklung der Technik ist eine weitere deutliche Verringerung des Aufwands in
den nächsten Jahren anzunehmen. Noch ist zur Erstellung eines Barcodes ein voll
ausgestattetes Molekularlabor nötig. Die Erstellung genetischer Sequenzen mit tragba-
ren Geräten unter Feldbedingungen ist jedoch heute bereits möglich und wurde auch
bereits durchgeführt (s. http://de.mongabay.com/2015/06/wissenschaftler-identifizieren-
frosch-durch-dna-test-ohne-dafur-den-wald-zu-verlassen/). Ein „tragbarer Barcoder“
im Westentaschenformat ist aus heutiger Sicht sicherlich noch Zukunftsmusik. Es
kann aber davon ausgegangen werden, dass der Stellenwert von DNA-Barcoding und
anderen molekulargenetischen Methoden durch deren zunehmende Leistung und
Erschwinglichkeit in naher Zukunft noch deutlich anwachsen wird.
Dank
Wir danken Michael Wink (Heidelberg) für Proben der Sumpfschildkröte sowie Wolfgang
Böhme (Bonn), Ursula Bott (Bonn), Mirko Daus (Schwerin), Hans-Jürgen Gruber (München),
Ulli Heckes (München), Dennis Rödder (Bonn) und Björn Rulik (Bonn) für weitere Proben und
156 Hawlitschek, Franzen & Glaw
Daten. Jérôme Morinière und Andreas Dunz (beide München) danken wir für ihre umfangrei-
chen Tätigkeiten beim Barcoding-Projekt. Dem BOLD-Team (Guelph, Canada) danken wir für
die Bearbeitung der Proben und für die Pflege der Datenbank. Die Regierungsbezirke von Bay-
ern stellten dankenswerterweise Genehmigungen zum Sammeln der verwendeten Proben aus.
Die Barcoding-Projekte in Bayern und Deutschland werden vom Bayerischen Staatsministerium
für Bildung und Kultus, Wissenschaft und Kunst und vom Bundesministerium für Bildung und
Forschung finanziert.
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