Assessment of phagocytic activity of peritoneal cells and white blood cells of rat using markers phagosome acidification pHrodoTM (Article in Russian)

Abstract

Sex differences in phagocytic activity of blood leukocytes and peritoneal cells in rats with the pHrodoTM green zymosan A BioParticles® conjugate which reflects the level of phagosome acidification were investigated. It was found that in female rats compared to male observed a more intensive fluorescence of the ingested objects. Besides phagocytosis parameters females have significantly more variable than in males.

Full text

РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2015, том 9 (18), № 2 (1)
Иммунные механизмы 352
Исследование поддержано грантом РФФИ
УрО РАН 14-04-96002.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. LaVoy E.C.P., McFarlin B. K., Simpson R. J. Wilder-
ness & Environmental Medicine 2011, 22, 343-351.
2. Kizkai T., Suzuki K., Hitomi Y., Iwabuchi K.,
Onoé K., Ishida H., Izawa T., Ohno H. Biochemical
and Biophysical Research Communications 2001,
283 (3), 700-706.
3. Hangalapura B. N. et al. Dev Comp Immunol 2006,
30, 503-11.
4. Zhao F. Q., Zhang Z. W., Yao H. D. Research in Vet-
erinary Science 2013, 95, 146-155.
5. Jansky L. et al. Eur J Appl Physiol Occup Physiol
1996, 72, 445-50.
CYTOKINE PRODUCTION BY MICE SPLENOCYTES UNDER
COLD STRESS. OPIATE RECEPTORS’ EFFECT
Sharav’eva I.L.1, Tendryakova S. P.1,2
1Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, UB RAS; 2Perm State
National Research University, Perm, Russia
It is proved that the production of IFN-γ depends on the acute cold stress durability. When cold stress
duration is one hour then the IFN-γ production is enhanced, while under 10-min hypothermia this indi-
cator is inhibited. Opiate receptors blockade did not abolish the modulating e ect of this stress.
Актуальность. Основной методической
проблемой при исследовании фагоцитарной
активности лейкоцитов радиоизотопным,
флюориметрическим и другими инструмен-
тальными методами являлась сложность от-
деления нефагоцитированных меченых объ-
ектов фагоцитоза от поглощенных, которая
усугублялась их агглютинацией при взаимо-
действии с антителами биологических жид-
костей. Эта проблема частично решилась при
широком внедрении проточной лазерной
цитометрии, однако при использовании тра-
ОЦЕНКА ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ
ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ КЛЕТОК И ЛЕЙКОЦИТОВ
КРОВИ КРЫС С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАРКЕРА
АЦИДИФИКАЦИИ ФАГОСОМ pHrodoTM
Шилов С. Ю.1,2, Жукова А. Е.2, Петухова А. А.3,
Барков С. Ю.2, Шилов Ю. И.1,2,3
1ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН; 2ГБОУ ВПО
«Пермский государственный медицинский университет имени академика Е. А. Вагнера»
Минздрава России; 3ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный
исследовательский университет», Пермь, Россия
Исследованы половые различия фагоцитарной активности лейкоцитов крови ипери-
тонеальных клеток у крыс с использованием зимозана, меченого отражающим уровень
ацидификации фагосом флюорохромом – зеленым pHrodoTM. Установлено, что у самок
крыс всравнении ссамцами наблюдается более интенсивная флюоресценция поглощен-
ных объектов. Помимо этого показатели фагоцитоза усамок характеризуются значительно
большей вариабельностью, чем усамцов.
Ключевые слова: фагоцитоз, фагосомы, лейкоциты крови, перитонеальные фагоциты,
pHrodo, крысы, половые различия.

РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2015, том 9 (18), № 2 (1)
Тематический выпуск «Пермский научный форум» 353
диционных флюорохромов, например флю-
оресцеинизотиоционата (ФИТЦ), в ходе ци-
тофлюрометрического исследования иногда
сложно отделить при гейтировании погло-
щенные объекты от адгезированных [1]. Для
решения этой задачи предлагалось использо-
вание тушения свечения непоглощенных ча-
стиц трипановым синим, параллельное прове-
дение исследования при низких температурах
для выключения поглощения споследующим
сравнением сопытной пробой, использование
для негативного контроля показателей соста-
новкой поглощения цитохолазиномD. Одна-
ко эти подходы далеко не всегда позволяют
решить проблему и процедура гейтирования
становится крайне сложной [1, 2]. Поэтому
не случайно с большим интересом многие
исследователи встретили появление pH-сен-
ситивных флюорохромов, в частности крас-
ного изеленого pHrodoTM (Molecular Probes® /
Life Technologies), которые нефлюоресцируют
при физиологических значениях pH, но на-
чинают светиться под действием возбуждаю-
щего света c интенсивностью прямо пропор-
циональной снижению pH до4,0. Поскольку
впроцессе фагоцитоза происходит закисление
среды внутри фагосомы, красный и зеленый
pHrodoTM стали использоваться для оценки
фагоцитоза и процессов ацидификации фа-
госом [2, 3]. В связи с отсутствием флюорес-
ценции при физиологичеcких значениях pH
вне фагосомы эти флюорохромы перспектив-
ны и для кинетической оценки фагоцитоза
с помощью современных флюориметров [4].
Однако рекомендуемые производителями ва-
рианты методов не всегда удобны для задач
конкретных исследований иимеющегося обо-
рудования.
Цель работы – адаптация метода оценки
фагоцитарной активности перитонеальных
клеток илейкоцитов крови крыс сиспользо-
ванием зимозана, меченого зеленым pHrodoTM,
для проточного лазерного цитометра Guava
EasyCyte (Millipore).
Материалы и методы. Исследования про-
водили на18 нелинейных белых крысах ввоз-
расте 4–7 месяцев.
Лейкоциты крови (50 ЕД гепарина/мл кро-
ви) выделяли методом седиментации с 0,1%
метилцеллюлозой (Sigma-Aldrich, США). Пе-
ритонеальные лейкоциты выделяли методом
промывания брюшной полости 10 мл среды
199 сдобавлением 10 ЕД/мл гепарина. После
двукратного отмывания центрифугированием
при 400 g втечение 10 мин клетки ресуспен-
дировали вполной питательной среде (ППС)
следующего состава: среда RPMI-1640 без
L-глутамина сдобавлением 2 мМ GlutaMAXTM,
1 мМ пирувата натрия, 1% заменимых амино-
кислот вMEM (все Gibсо®, life technologiesTM),
10 мМ HEPES (Sigma-Aldrich). Концентрацию
клеточной суспензии доводили до25×106 кле-
ток/мл ППС.
Технические отличия проточного лазер-
ного цитометра Guava EasyCyte (Millipore)
от традиционных цитометров, заключаю-
щиеся в отсутствии обтекающей жидкости,
малом объеме промывающей жидкости (рас-
ход менее 8 мл за8 часов работы всравнении
с8000 мл вцитометрах собтекающей жидко-
стью), низких потерях анализируемых клеток
ирасхода реагентов, прямом определении аб-
солютного количества протекающих клеток
намкл раствора и др., связанных с иннова-
ционной ассиметричной структурой капил-
ляра проточной ячейки, атакже сцифровой,
анеаналоговой обработкой сигнала [5], по-
зволили при адаптации метода существенно
снизить объем реагентов. Впробирках Эппен-
дорф смешивали 88 мкл ППС, 4 мкл суспен-
зии лейкоцитов (25×106 клеток/мл) и8 мкл
преинкубированной для опсонизации при
37°C втечение 30 мин смеси равных объемов
частиц зимозана, меченого зеленым pHrodoTM
(100×106 частиц/мл; pHrodoTM Green zymosan
A BioParticles® conjugate, Molecular probes® by
life technologiesTM, P35365, Lot 1617699), иау-
топлазмы.
После перемешивания смеси на Votex-
Genie-2 (Scienti c Industries, США) пробы ин-
кубировали при при 37°C втечение 120мин.
Далее впробирки вносили по900 мкл лизиру-
ющего раствора (0,15М NH4Cl, 0,01М NaHCO3,
0,0001М ЭДТА, pH=7,2–7,4), пробы переме-
шивали иинкубировали втечение 5мин при
комнатной температуре. После осаждения
клеток центрифугированием и снятия су-
пернатанта клетки дважды отмывали стоп-
реагентом (0,1 объёма 0,5 М ЭДТА + 92,95
объёма забуференного 10 мМ HEPES офи-
цинального 0,9% раствора хлорида натрия
для инъекций). Смесь доводили до объёма
250 мкл стоп-реагентом ипосле тщательного
ресуспендирования вносили в 96-луночный
плоскодонный планшет для ИФА («Медполи-
мер», Санкт-Петербург).

РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2015, том 9 (18), № 2 (1)
Иммунные механизмы 354
Для сбора ианализа данных использовали
программное обеспечение “Millipore CytoSo
5.3”, модули “Guava Express Plus/Pro”. Стати-
стический анализ проводили сиспользовани-
ем методов описательной статистики инепар-
ного t-критерия Стьюдента. Различия считали
статистически значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение. Установлено,
что фагоцитарная активность лейкоцитов
самцов исамок крыс существенно отличается
поинтегральным показателям, характеризую-
щим интенсивность свечения всех фагоцити-
рованных объектов (Х–Mean, гейтирование
пообщему количеству флюоресцирующих со-
бытий). Так, средняя интенсивность свечения
усамцов слейкоцитами периферической кро-
ви составляет 35,977±1,470 (n=10), аусамок–
93,363±13,198 (n=8; p=0,00328 погетероскеда-
стическому варианту t-критерия Стьюдента
для неравных дисперсий). Этот же показа-
тель с перитонеальными клетками у самцов
составляет 46,132±3,019 (n=10), а у самок –
171,812±55,489 (n=8; p=0,04074 по гетеро-
скедастическому варианту t-критерия Стью-
дента для неравных дисперсий). Анализ
различий дисперсий между двумя группами
поF-отношению показал высоко статистиче-
ски значимую неоднородность показателей
в группе самок в сравнении с самцами, что,
по-видимому, связано с физиологическими
колебаниями уровней гормонов при эстраль-
ном цикле (6 самок извыборки намомент ис-
следования поданным кольпоцитологии были
вфазе проэструса, а2– вфазе диэструса). Бо-
лее детальная взаимосвязь уровня фагоцитоза
сфазами эстрального цикла нами продолжает
исследоваться.
Таким образом, при оценке фагоцитарной
активности перитонеальных клеток и лейко-
цитов крови крыс сиспользованием зимоза-
на, меченого отражающим уровень ациди-
фикации фагосом флюорохромом – зеленым
pHrodoTM, установлено, что у самок крыс
всравнении ссамцами наблюдается более ин-
тенсивное свечение поглощенных объектов.
Помимо этого показатели фагоцитоза усамок
характеризуются значительно большей вариа-
бельностью, чем усамцов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Nuutila J., Lilius E. – M. Cytometry. Part A. 2005
Vol. 65A (2). P. 93-102.
2. Neaga A., Lefor Ju., Lich K. E., Liparoto S. F.,
Xiao Y. Q. J. Immunol. Methods. 2013. Vol. 390
(1–2). P. 9–17.
3. Colas C., Menezes S., Gutiérrez-Martínez E.,
Péan C. B., Dionne M. S., Guermonprez P. J. Immu-
nol. Methods. 2014. Vol. 412. P. 1–13.
4. Ruangsri J., Kitani Y., Kiron V, Lokesh J., Brinch-
mann M. F., Karlsen B. O., Fernandes J. M.O. PLoS
One. 2013. 8 (4). P. e62302.
5. King D., Cappione A., Ilkov F., Goldman B., Lefeb-
vre R., Pittaro R., G. J. Dixon G. J. In:  e micro ow
cytometer. Ed. by J. S. Kin, F. S. Ligler. Pan Stanford
Publlishing Pte. Ltd., 2010. P. 69-87.
ASSESSMENT OF PHAGOCYTIC ACTIVITY OF PERITONEAL
CELLS AND WHITE BLOOD CELLS OF RAT USING MARKERS
PHAGOSOME ACIDIFICATION pHrodoTM
Shilov S. Ju.1,2, Zhukova A. E.2, Petuhova A. A.3,
Barkov S. Ju.2, Shilov Ju.I.1,2,3
1Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the UB RAS; 2Acad. E. A. Wagner
Perm State Medical University, Perm, 3Perm State University, Perm, Russia
Sex di erences in phagocytic activity of blood leukocytes and peritoneal cells in rats with the pHrodoTM
green zymosan A BioParticles® conjugate which re ects the level of phagosome acidi cation were investigat-
ed. It was found that in female rats compared to male observed a more intensive  uorescence of the ingested
objects. Besides phagocytosis parameters females have signi cantly more variable than in males.
Key words: phagocytosis, phagosome, white blood cells, peritoneal phagocytes, pHrodoTM,
rats, sex differences.

oblohka_N4_2014.indd 1 8/14/14 12:35:22 PM
Том 9 (18), Номер 2 (1) Июнь 2015

Индекс 15590
 "Н А У К А" 
Журналы РАН, выходящие в свет на русском языке
Автоматика и телемеханика*
Агрохимия
Азия и Африка сегодня
Акустический журнал*
Алгебра и анализ
Астрономический вестник*
Астрономический журнал*
Биологические мембраны*
Биология внутренних вод*
Биология моря*
Биоорганическая химия*
Биофизика*
Биохимия*
Ботанический журнал
Вестник РАН*
Вестник древней истории
Вестник Южного научного центра
Водные ресурсы*
Вопросы истории естествознания и техники
Вопросы ихтиологии*
Вопросы философии
Вопросы языкознания
Восток
Вулканология и сейсмология*
Высокомолекулярные соединения (Сер. А, В, С)*
Генетика*
Геология рудных месторождений*
Геомагнетизм и аэрономия*
Геоморфология
Геотектоника*
Геохимия*
Геоэкология, инженерная геология, гидрогеология,
геокриология
Государство и право
Дефектоскопия*
Дискретная математика
Дифференциальные уравнения*
Доклады Академии наук*
Журнал аналитической химии*
Журнал высшей нервной деятельности имени
И.П. Павлова
Журнал вычислительной математики и математической
физики*
Журнал неорганической химии*
Журнал общей биологии
Журнал общей химии*
Журнал органической химии*
Журнал прикладной химии*
Журнал технической физики*
Журнал физической химии*
Журнал эволюционной биохимии и физиологии*
Журнал экспериментальной и теоретической физики*
Записки Российского минералогического общества
Земля и Вселенная
Зоологический журнал
Известия РАН. Механика жидкости и газа*
Известия РАН. Механика твердого тела*
Известия РАН. Серия биологическая*
Известия РАН. Серия географическая
Известия РАН. Серия литературы и языка
Известия РАН. Серия математическая
Известия РАН. Серия физическая*
Известия РАН. Теория и системы управления*
Известия РАН. Физика атмосферы и океана*
Известия РАН. Энергетика
Известия русского географического общества
Исследование Земли из космоса
Кинетика и катализ*
Коллоидный журнал*
Координационная химия*
Космические исследования*
Кристаллография*
Латинская Америка
Лесоведение
Лёд и Снег
Литология и полезные ископаемые*
Математические заметки*
Математический сборник
Математическое моделирование
Микология и фитопатология
Микробиология*
Микроэлектроника*
Мировая экономика и международные отношения
Молекулярная биология*
Наука в России
Научное приборостроение
Нейрохимия*
Неорганические материалы*
Нефтехимия*
Новая и новейшая история
Общественные науки и современность
Общество и экономика
Океанология*
Онтогенез*
Оптика и спектроскопия*
Палеонтологический журнал*
Паразитология
Петрология*
Письма в Астрономический журнал*
Письма в Журнал технической физики*
Письма в Журнал экспериментальной и теоретической
физики*
Поверхность*
Почвоведение*
Приборы и техника эксперимента*
Прикладная биохимия и микробиология*
Прикладная математика и механика
Природа
Проблемы Дальнего Востока
Проблемы машиностроения и надежности машин*
Проблемы передачи информации*
Программирование*
Психологический журнал
Радиационная биология. Радиоэкология
Радиотехника и электроника*
Радиохимия*
Расплавы
Растительные ресурсы
Российская археология
Российская история
Российский иммунологический журнал
Российский физиологический журнал имени
И.М. Сеченова
Русская литература
Русская речь
Сенсорные системы
Славяноведение
Социологические исследования
Стратиграфия. Геологическая корреляция*
США. Канада. Экономика - политика - культура
Теоретическая и математическая физика
Теоретические основы химической технологии*
Теория вероятностей и ее применение
Теплофизика высоких температур*
Труды Математического института имени В.А. Стеклова*
Успехи математических наук
Успехи современной биологии
Успехи физиологических наук
Физика Земли*
Физика и техника полупроводников*
Физика и химия стекла*
Физика металлов и металловедение*
Физика плазмы*
Физика твердого тела*
Физикохимия поверхности и защита материалов*
Физиология растений*
Физиология человека*
Функциональный анализ и его применение
Химическая физика*
Химия высоких энергий*
Химия твердого топлива*
Цитология*
Человек
Экология*
Экономика и математические методы
Электрохимия*
Энергия, экономика, техника, экология
Этнографическое обозрение
Энтомологическое обозрение*
Ядерная физика*
* Материалы журнала издаются группой Pleiades Publishing на английском языке
oblohka_N4_2014.indd 1 8/14/14 12:35:22 PM