Development and Validation of an HPLC Method for Determination of Carbamazepine in Human Plasma

Abstract

A rapid and simple HPLC method for determination of carbamazepine in human plasma was developed and validated. The chromatographic conditions were: C-18 column, acetonitrile/methanol/ammonium acetate 0,05 M (30/10/ 60) as mobile phase; flow rate 1,2 ml/min and 230 nm detection. Plasma samples were spiked with an internal standard (nitrazepam). The method was successfully applied to determine pharmacokinetics parameters in a healthy volunteer. The method was validated with respect to linearity, precision, accuracy, limit of quantification, selectivity, specificity and stability. The response was linear for the drug concentration range from 0,075 up to 3,00 μg/ml. The RSD values for precision studies were less than 5,0%. The recovery of the drug ranged between 83-99% and the limit of quantification 0,075 μg/ml. The method was specific in relation to biological matrix and to caffeine. The drug was stable in the matrix under the studied conditions. The method can be used in clinical trials with healthy human volunteers, like bioequivalence or pharmacokinetic studies.

Full text

80 ISSN 0326-2383
PALABRAS CLAVE: Carbamacepina. Cromatografía líquida de alta resolución. Plasma humano. Validación.
KEY WORDS: Carbamazepine. High performance liquid chromatography. Human plasma. Validation.
*Autor a quien debe dirigirse la correspondencia. E-mail: kv@biol.unlp.edu.ar
Latin American Journal of Pharmacy
(formerly Acta Farmacéutica Bonaerense)
Lat. Am. J. Pharm. 28 (1): 80-5 (2009)
Original Article
Received: October 27, 2008
Accepted: December 6, 2008
Desarrollo y Validación de un Método por HPLC
para la Determinación de Carbamacepina en Plasma Humano
María G. VOLONTÉ*, María A. VIÑAS, Carolina E. GORRITI, María C. ESCALES,
Laura A. SÁNCHEZ & M. Esperanza RUIZ
Cátedra Control de Calidad de Medicamentos, Área Farmacia, Departamento de Ciencias Biológicas,
Facultad Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata,
Calle 47 y 115, 1900 La Plata, Argentina.
RESUMEN. Se desarrolló y validó un método rápido y simple por HPLC para la determinación de carba-
macepina en plasma humano. Las condiciones cromatográficas fueron: columna C-18, fase móvil acetoni-
trilo:metanol:acetato de amonio 0,05 M (30:10:60), flujo 1,2 ml/min y detección a 230 nm. Se utilizó nitra-
zepan como estándar interno. El método fue exitosamente aplicado a la determinación de los parámetros
farmacocinéticos de carbamacepina en un voluntario sano. Durante la validación se evaluó linealidad, pre-
cisión, exactitud, límite de cuantificación y especificidad del método. La respuesta resultó lineal en el inter-
valo de concentraciones 0,075–3,00 μg/ml. La precisión fue menor del 5,0% expresada como coeficiente de
variación. La exactitud fue del 83–99% y el límite de cuantificación fue de 0,075 μg/ml. Se demostró la es-
pecificidad del método respecto a la matriz biológica y a cafeína. La droga resultó estable en la matriz ba-
jo las condiciones ensayadas. El método puede ser aplicado en estudios clínicos con voluntarios humanos
sanos, como estudios farmacocinéticos o de bioequivalencia.
SUMMARY. “Development and Validation of an HPLC Method for Determination of Carbamazepine in Human
Plasma”. A rapid and simple HPLC method for determination of carbamazepine in human plasma was developed
and validated. The chromatographic conditions were: C-18 column, acetonitrile/methanol/ammonium acetate
0,05 M (30/10/60) as mobile phase; flow rate 1,2 ml/min and 230 nm detection. Plasma samples were spiked
with an internal standard (nitrazepam). The method was successfully applied to determine pharmacokinetics pa-
rameters in a healthy volunteer. The method was validated with respect to linearity, precision, accuracy, limit of
quantification, selectivity, specificity and stability. The response was linear for the drug concentration range
from 0,075 up to 3,00 μg/ml. The RSD values for precision studies were less than 5,0%. The recovery of the
drug ranged between 83–99% and the limit of quantification 0,075 μg/ml. The method was specific in relation to
biological matrix and to caffeine. The drug was stable in the matrix under the studied conditions. The method can
be used in clinical trials with healthy human volunteers, like bioequivalence or pharmacokinetic studies.
INTRODUCCIÓN
Carbamacepina (CBZ) es una droga de estre-
cho margen terapéutico 1, perteneciente al gru-
po de las benzoazepinas, (5H-dibenz[b,f]azepi-
na-5-carboxamida), ampliamente utilizada para
el tratamiento de convulsiones tónico-clónicas y
convulsiones parciales complejas, tanto en niños
como en adultos 2.
Por tratarse de una droga de estrecho mar-
gen terapéutico, pequeñas fluctuaciones en la
velocidad de absorción y/o cantidad absorbida,
pueden resultar tanto en toxicidad como en pér-
dida de efecto, y por lo tanto del control de las
convulsiones. Resulta imprescindible entonces
minimizar la variabilidad en el proceso de ab-
sorción de drogas como CBZ. Sin embargo, las
formas farmacéuticas convencionales de libera-
ción inmediata de CBZ suelen requerir adminis-
tración frecuente, y existen reportes de variabili-
dad considerable en los niveles sanguíneos de
la droga 3. Por otro lado, la CBZ es una droga
capaz de autoinducir su metabolismo hepático

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en aproximadamente un período de dos sema-
nas. Todos estos factores tienen un impacto ne-
gativo en la biodisponibilidad y bioequivalencia
de CBZ 4-7.
Si bien existen en la bibliografía varios méto-
dos por HPLC para la determinación de CBZ en
plasma humano, muchos de ellos requieren lar-
gos procesos de extracción, tanto en fase sólida
8,9 como en fase líquida 10,11. Por otro lado se
encuentran métodos cuyo proceso de prepara-
ción de la muestra resulta simple pero que lue-
go requieren condiciones cromatográficas com-
plicadas, como altas temperaturas, fase móvil
compleja o equipamiento específico y/o costoso
8,11-13.
En el presente trabajo, se desarrolla y valida
un método simple, rápido y económico para la
determinación de CBZ en plasma humano, el
cual tiene aplicación directa en estudios farma-
cocinéticos y de bioequivalencia, en los cuales
se deben procesar y analizar simultáneamente
un gran número de muestras. El método aquí
presentado sólo requiere una etapa de despro-
teinización que se realiza en un único paso, y
equipamiento básico de HPLC operado en con-
diciones isocráticas. Cuenta además con la ven-
taja de que los tiempos de retención son cortos.
En estudios de biodisponibilidad es esencial
usar métodos analíticos bien caracterizados y
completamente validados, de manera de obte-
ner resultados confiables que puedan ser inter-
pretados satisfactoriamente. Es por esto que en
el presente trabajo se han seguido las guías de
la Food and Drug Administration (FDA), así co-
mo las recomendaciones de expertos en el te-
ma, los cuales brindan criterios generales para
la validación de métodos bioanalíticos 14,15.
MATERIALES Y MÉTODOS
Equipamiento
Se utilizó un cromatógrafo Gilson, equipado
con un sistema de bombeo modelo 322-H2, un
detector UV-Visible modelo 156, una unidad de
interfase modelo 506C y una estación de trabajo
operada con el software UniPoint LC versión 3.3
(Gilson SAS, Villiers-Le-Bel, Francia). El inyector
manual es un modelo 7725 con loop fijo de 20
µl (Rheodyne, CA, USA). Se trabajó en fase re-
versa, con una columna Lichrocart C-18, de 250
mm x 4 mm d.i. y tamaño de partícula de 5 µm
(Merck, Darmstadt, Alemania). Para la prepara-
ción de las muestras se utilizaron micropipetas
Eppendorf de 100-1000 y 5000 µl. Todas las pe-
sadas se realizaron en una balanza Metler Tole-
do AG 204 (Metler, Greinfensee, Suiza).
Materiales
Las sustancias de referencia Carbamacepina
(CBZ), Nitrazepam (NTZ), utilizado como están-
dar interno, SI y Cafeína (CF) fueron donadas
por el Laboratorio de Control de Calidad del Co-
legio de Farmacéuticos de la Provincia de Bue-
nos Aires. Los solventes utilizados, acetonitrilo,
metanol y agua, fueron grado HPLC y el acetato
de amonio, grado analítico. (J.T. Baker, Phillis-
burg, USA). La fase móvil y las muestras fueron
filtradas a través de membranas Millipore tipo
HV, de tamaño de poro 0,45 µm (Millipore,
Bedford, MA, USA).
Condiciones Cromatográficas
La fase móvil empleada consistió en una
mezcla de acetonitrilo, metanol y acetato de
amonio (0,05 M), (30:10:60), previamente filtra-
da y desgasificada. Se trabajó en forma isocráti-
ca a temperatura ambiente (23-25 °C), con un
flujo de fase móvil de 1,2 ml/min, con detección
a 230 nm y utilizando altura de pico (AP) como
parámetro de integración. Las inyecciones se re-
alizaron en forma manual y el volumen de las
mismas fue de 20 µl.
Preparación de las soluciones estándar
Las soluciones stock de los estándares fueron
preparadas en acetonitrilo, con una concentra-
ción final de 0,5 mg/ml para CBZ y 1,2 mg/ml
para NTZ. Todas las diluciones posteriores de
estas soluciones también fueron realizadas en
acetonitrilo. De la solución stock de CBZ se ob-
tuvieron diluciones de concentración 7,5; 15; 75;
150 y 300 µg/ml y de la de NTZ de 50 µg/ml.
Las soluciones estándar utilizadas para deter-
minar la linealidad del método se prepararon
agregando 50 µl de cada una de las diluciones
de CBZ y 170 µl de la dilución de NTZ a plas-
ma humano libre de droga previamente despro-
teinizado (1,5 ml de acetonitrilo por cada ml de
plasma), hasta un volumen final constante de 5
ml.
En el caso del ensayo de exactitud, se proce-
dió de forma similar a la indicada en el párrafo
anterior, excepto que la etapa de desproteiniza-
ción se realizó luego de mezclar las diluciones
de las soluciones estándar con el plasma huma-
no libre de droga.
Preparación de las muestras
El volumen inicial de muestra fue de 1,0 ml
(plasma en estudio conteniendo CBZ), sobre el
que se adicionaron 85 µl de solución de NTZ
(50 µg/ml) y se agitó en vórtex durante 2 min.

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VOLONTÉ M.G., VIÑAS M.A., GORRITI C.E., ESCALES M.C., SÁNCHEZ L.A. & RUIZ M.E.
Se midieron 0,5 ml de esa mezcla y se agrega-
ron lentamente sobre 0,75 ml de acetonitrilo pa-
ra su desproteinización, luego de lo cual se so-
nicó 5 min y se centrifugó durante 10 min a
1500 g. El sobrenadante fue filtrado y transferi-
do a un vial para su posterior inyección en el
sistema HPLC.
Validación del método
La linealidad del método fue evaluada utili-
zando una curva de calibración obtenida con
cinco niveles de concentración de CBZ estándar
en plasma humano libre de droga, previamente
desproteinizado. Dichas soluciones fueron pre-
paradas como se indicó anteriormente. Las con-
centraciones finales fueron 0,075; 0,15; 0,75; 1,5
y 3,0 µg/ml para CBZ, y 1,7 µg/ml para NTZ.
Mediante un análisis de regresión se determinó
el coeficiente de determinación, la pendiente y
la ordenada de dicha curva. Para confirmar el
ajuste de la misma al modelo lineal se realizó
un análisis del factor respuesta (relación entre la
señal y la concentración), un análisis de residua-
les y el test de Student.
El límite de cuantificación (LC) se define co-
mo la menor concentración de CBZ en una
muestra susceptible de ser determinada con pre-
cisión y exactitud aceptables, bajo las condicio-
nes experimentales descriptas. Para ello se utili-
zaron las recomendaciones de la FDA 14, que in-
dican que la menor concentración de la curva
de calibración puede ser aceptada como LC.
La precisión del sistema se calculó como el
coeficiente de variación (CV) de cinco inyeccio-
nes de una misma solución estándar de CBZ en
plasma humano libre de droga, a dos niveles de
concentración, 0,15 y 2,00 µg/ml. La repetibili-
dad o precisión del método se calculó como el
CV obtenido a partir de la inyección de cinco
muestras independientes de CBZ en plasma hu-
mano libre de droga, a tres niveles de concen-
tración, 0,076; 0,15 y 2,00 µg/ml.
La exactitud del método se determinó com-
parando las alturas de pico obtenidas con solu-
ciones estándar de CBZ preparadas en plasma
previamente desproteinizado, las que represen-
taron el 100%, con aquellas obtenidas cuando la
desproteinización con acetonitrilo se realizó des-
pués del mezclado de las soluciones estándares
con el plasma, como se indicó en Preparación
de las soluciones estándar. La exactitud se ex-
presó como el porcentaje recuperado de cinco
determinaciones a tres niveles de concentración,
uno cerca del LC (0,076 µg/ml), otro en el me-
dio del rango (0,15 µg/ml) y uno próximo al lí-
mite superior de la curva de calibración (2,00
µg/ml).
La especificidad del método respecto a la
matriz biológica fue establecida empleando seis
muestras independientes de dicha matriz. Para
ello se utilizó plasma humano libre de droga
obtenido a partir de seis voluntarios sanos.
Por otra parte, se estableció la selectividad
del método respecto a Cafeína (CF), ya que ésta
es una droga presente en diversas bebidas que
los voluntarios suelen ingerir habitualmente, por
lo cual se consideró que podría ser una poten-
cial interferencia.
También se estudió la estabilidad en el corto
plazo de CBZ en plasma humano bajo las con-
diciones experimentales del presente trabajo. Se
determinó por triplicado la influencia de tres ci-
clos de congelamiento-descongelamiento a dos
niveles de concentración, 0,20 y 2,00 µg/ml. Pa-
ra ello, tres muestras independientes de cada ni-
vel de concentración fueron almacenadas a –20
°C durante 24 h, luego de lo cual se dejaron
descongelar libremente a temperatura ambiente,
para volver a repetir el ciclo de congelamiento-
descongelamiento dos veces más. Las muestras
se analizaron al inicio del ensayo y luego del
tercer ciclo, y se calculó la relación entre la altu-
ra de pico de CBZ obtenida antes y después de
los ciclos.
Por otro lado, las mismas muestras fueron
mantenidas a temperatura ambiente de 4 a 24 h
y analizadas para establecer su estabilidad du-
rante el período de tiempo en que las mismas
permanecen en esas condiciones durante cada
día de trabajo.
Aplicación
El método fue aplicado a la determinación
de los parámetros farmacocinéticos de CBZ en
un voluntario sano, no fumador, con caracterís-
ticas antropométricas normales, sin anteceden-
tes de alcoholismo ni hipersensibilidad a la dro-
ga ni a ninguna sustancia químicamente relacio-
nada con ella, quién firmó un consentimiento
informado para participar en el ensayo. Este es-
tudio se realizó con la única intención de corro-
borar, con una aplicación práctica, las bondades
del método.
Utilizando el programa PK Solutions 2.0
(Summit Research Services, Montrose, USA) se
calcularon los siguientes parámetros: área bajo
la curva desde tiempo cero (T0) hasta el último
tiempo de toma de muestra (ABC(0-t), área bajo
la curva desde T0hasta infinito (ABC(0-∞), con-
centración plasmática máxima (Cmáx.), cociente

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Cmáx./ABC(0-t), como una medida de la velocidad
de absorción 16, tiempo requerido para alcanzar
la concentración máxima (Tmáx.), constante de
eliminación de primer orden (Ke), tiempo de vi-
da media (T1/2) y tiempo medio de residencia
(MRT).
Las muestras de plasma fueron extraídas lue-
go de la administración al voluntario de un
comprimido de liberación inmediata contenien-
do 200 mg de CBZ. La administración se realizó
en ayunas, y ninguna otra droga fue permitida
al menos 96 horas antes del estudio, como tam-
poco se permitió la ingesta de alcohol ni de be-
bidas conteniendo xantinas durante las 48 horas
previas al estudio ni hasta que la última muestra
fue extraída.
Las muestras de sangre fueron extraídas a
tiempo cero (T0ó predosis), 4, 5, 6, 8, 25, 32,
49 y 104 h post-dosis. El plasma se separó in-
mediatamente por centrifugación a 1500 gy se
almacenó a -20 °C hasta el momento de su aná-
lisis.
RESULTADOS
En la Figura 1 se muestran los cromatogra-
mas típicos obtenidos con muestras de plasma
blanco, plasma blanco adicionado con estánda-
res de CBZ y NTZ y plasma del voluntario luego
de la administración de un comprimido de CBZ
200 mg. Se utilizó NTZ como estándar interno
debido a que presentó una separación óptima
respecto a CBZ. Los tiempos de retención (tr)
fueron 8,58 min para CBZ y 10,63 min para
NTZ.
El método desarrollado demostró ser lineal
en el intervalo de concentraciones 0,075 – 3,0
µg/ml, con un coeficiente de determinación r2=
0,9976. La ordenada al origen (a) y la pendiente
(b) con sus respectivos intervalos de confianza
del 95% fueron: a = 0,0135 ± 0,178 y b = 0,6797
± 0,102.
El factor respuesta calculado se mantuvo
constante a lo largo del intervalo de concentra-
ciones de la curva de calibración, corroborando
la hipótesis de linealidad.
Durante el análisis de los residuales, los mis-
mos siguieron un patrón de distribución aleato-
rio alrededor de cero para todo el rango de
concentraciones estudiado, y la suma de los
mismos fue 3,33 x 10–16.
Mediante el test de Stu-
dent también se demostró la correlación lineal
(p > 0,05), tomando como hipótesis nula la no
existencia de correlación entre las variables X e
Y 17. Todos los resultados anteriores confirman
el ajuste de los datos obtenidos al modelo lineal.
Figura 1. Cromatogramas típicos obtenidos con: (A)
plasma blanco; (B) plasma blanco adicionado con
CBZ (tr8.58) y NTZ (tr10.63) (tr: tiempo de retención
en minutos); (C) plasma de un voluntario luego de
una administración oral de CBZ 200 mg.
El LC fue la menor concentración de la curva
de calibración, 0,075 µg/ml, ya que se cumplen
las siguientes condiciones: la señal de CBZ a
ese nivel es al menos 5 veces mayor que la se-
ñal del blanco y el pico de CBZ es identificable,
discreto y reproducible con una precisión me-
nor del 20% y una exactitud entre el 80 y 120%.
La precisión del sistema fue 2,4% para el ni-
vel de concentración 0,15 µg/ml y 3,2% para
2,00 µg/ml, expresado como CV. La precisión
del método, junto con los resultados del ensayo
de exactitud, expresado como porcentaje recu-
perado, para los tres niveles de concentración
estudiados, se muestran en la Tabla 1. En todos
Concentración % Recuperado Precisión
de CBZ (n = 5) del método
(µg/ml) (CV%, n = 5)
0,076 83,73 4,8
0,15 97,07 3,2
2,00 98,55 2,9
Tabla 1 Resultados de los ensayos de exactitud y pre-
cisión del método, para los tres niveles de concentra-
ción estudiados.

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VOLONTÉ M.G., VIÑAS M.A., GORRITI C.E., ESCALES M.C., SÁNCHEZ L.A. & RUIZ M.E.
los casos se cumplió el criterio de que la preci-
sión alrededor del valor medio no debe exceder
el 15% expresada como CV, excepto en el LC en
donde no debe exceder el 20% CV 14,15.
El método demostró ser específico respecto
a la matriz biológica debido a que en ninguna
de las seis fuentes independientes de plasma
blanco se observaron picos interferentes con la
CBZ. También se demostró la selectividad res-
pecto a CF ya que el tiempo de retención de la
misma fue de 2,14 min, no interfiriendo por lo
tanto con el análisis.
Los resultados del estudio de estabilidad de
CBZ en la matriz biológica demostraron la tole-
rancia de la misma a los ciclos de congelamien-
to-descongelamiento y a las condiciones norma-
les de trabajo, ya que no se observaron diferen-
cias significativas en las señales obtenidas antes
y después de dicho estudio (Tabla 2).
En la Tabla 3 se presentan los parámetros
Antes del Después del
primer ciclo de congelamiento tercer ciclo de congelamiento
RAP aCBZ/NTZ (A) RAP aCBZ/NTZ (B)
(n = 3) (n = 3)
0,20 0,153 0,164 1,072
2,00 0,754 0,806 1,069
Tabla 2. Estabilidad a corto plazo frente a ciclos de congelamiento-descongelamiento de Carbamazepina en
plasma humano. aRelación de alturas de pico entre CBZ y NTZ.
Concentración
(µg/ml) (A)/(B)
Parámetros Resultados
ABC(0-104 )a96,76 µg.h/ml
ABC(0-∞) b117,27 µg.h/ml
Cmax/ABC(0-104) c0,0213 h–1
Cmax d2,02 µg/ml
Tmax e6 h
T1/2 f43 h
Ke g0,0160 h–1
MRT h62 h
Tabla 3. Parámetros farmacocinéticos de CBZ en un
voluntario sano luego de una única dosis por vía oral
de CBZ 200 mg. aÁrea bajo la curva desde tiempo
cero hasta el último tiempo de muestreo. bÁrea bajo
la curva desde tiempo cero hasta infinito. cRelación
Cmax/ABC(0-104). dConcentración plasmática máxima
de CBZ. eTiempo en el que se alcanza la concentra-
ción plasmática máxima. fTiempo de vida medio. g
Constante de eliminación de primer orden. hTiempo
medio de residencia (Mean Residence Time, MRT).
farmacocinéticos calculados luego de la admi-
nistración de un comprimido de CBZ 200 mg al
voluntario sano. El perfil de concentración vs.
tiempo obtenido luego de dicha administración
se muestra en la Figura 2.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Los métodos analíticos utilizados para la
cuantificación de drogas en muestras biológicas
juegan un rol significativo en la evaluación e in-
terpretación de los datos obtenidos en estudios
de biodisponibilidad, bioequivalencia y farma-
cocinéticos. Por ello la importancia de contar
con métodos bien caracterizados, validados y
por lo tanto confiables.
El método desarrollado y validado en el pre-
sente trabajo demostró poseer todos los pará-
metros esenciales para su aplicación a la deter-
minación de CBZ en muestras de plasma huma-
no: estabilidad de dicho principio activo en la
matriz biológica estudiada y bajo las condicio-
nes normales de trabajo, linealidad de la res-
puesta frente a la concentración, límite de cuan-
tificación adecuado, exactitud, precisión, repeti-
bilidad y especificidad acordes con los requeri-
mientos para métodos bioanalíticos.
Figura 2. Perfil plasmático (Concentración vs. tiempo)
obtenido luego de la administración oral de un com-
primido conteniendo 200 mg de CBZ a un voluntario
sano.
Tiempo (hs)
Conc. CBZ (μg/ml)

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Latin American Journal of Pharmacy - 28 (1) - 2009
Los parámetros farmacocinéticos obtenidos a
partir de la aplicación del método presentado al
seguimiento plasmático de las concentraciones
de CBZ en el voluntario sano, son equiparables
a los de bibliografía 18-21.
Se trata además de un método simple, poco
costoso y de rápida aplicación que ofrece una
opción para aquellos que trabajan en farmacoci-
nética y deben adecuar metodologías analíticas
a las condiciones de equipamiento con que
cuenta su laboratorio. Por lo tanto, puede utili-
zarse en toda clase de estudios clínicos que in-
cluyan voluntarios humanos sanos, utilizando
plasma como fluido biológico, tales como estu-
dios de bioequivalencia y/o estudios farmacoci-
néticos de CBZ.
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