Green Bioprinting: Immobilisierung von Mikroalgen in 3D-Hydrogelen für biotechnologische und medizinische Anwendungen

Abstract

Photobiotechnologische Prozesse zur Gewinnung erneuerbarer Energien, Plattformchemikalien und pharmazeutischen Wirkstoffe sind von wachsendem industriellen Interesse. Die meisten Anwendungen nutzen suspendierte Zellen, wobei die Kultivierung von immobilisierten Kulturen Vorteile für die Abtrennung der Zellen vom Kulturmedium und Schutz hinsichtlich auftretender Scherkräften (durch Rühren oder Begasen) bietet.
In einem interdisziplinären Forschungsprojekt entwickelten Wissenschaftler der TU Dresden eine Immobilisierungsmethode für Mikroalgen, das so genannte Green Bioprinting, welches auf einem 3D-Druck-Verfahren basiert, das ursprünglich im Tissue Engineering angewendet wird. Die in einer Alginat/Methylcellulose-Lösung suspendierten Mikroalgen werden mittels BioScaffolder in einer strukturell definierten Geometrie geplottet. Das resultierende Hydrogel-Konstrukt kann in konventionellen Kultivierungssystemen photoautotroph kultiviert werden. Die Verwendung dieses 3D-Druck-Verfahrens ermöglicht zahlreiche neue und interessante Anwendungsfelder.
Unser Team konnte erstmalig, zeigen, dass die Hydrogel-Umgebung exzellente Bedingungen für die photoautotrophe Kultivierung von Chlamydomnas reinhardtii 11.32b bietet. Während die Viabilität und Wachstumsraten von Suspensionskulturen stark von den Kultivierungsparametern Temperatur (26°C - 37°C) und Beleuchtung (Dauerbeleuchtung vs. Hell/Dunkel-Zyklen) abhängig waren, wurden stabile und hohe Wachstumsraten für Hydrogel-immobilisierte C. reinhardtii 11.32b Kulturen identifiziert.
Als Proof-of-Principle und potentielle Anwendung des Green Bioprinting im medizinischen Bereich zeigen wir die Herstellung einer strukturierten Co-Kultur aus Algen und humanen Zellen innerhalb eines Hydrogel-Scaffolds. Das Ziel dieses Konzeptes ist die Verhinderung von Sauerstofflimitationen während des Tissue Engineerings durch die photoautotrophe Sauerstoffbereitstellung durch die Mikroalgen. Diese Technologie bietet Potential für zahlreiche weitere Applikationen, z.B. Kaskadenreaktionen oder die Entwicklung von Modellsystemen für Biofilme oder symbiotisch lebende Organismen.

Full text

TECHNISCHE UNIVERSITÄT DRESDEN
Institut für Lebensmittel-und Bioverfahrenstechnik
Kontakt:
Felix Krujatz, MSc.
Tel.: +49 351 / 463 32727
Felix.Krujatz@tu-dresden.de
Dr. rer. nat. Anja Lode
Tel.: +49 351 / 458 6692
Anja.Lode@tu-dresden.de
Green Bioprinting: Immobilisierung von Mikroalgen in
3D-Hydrogelen für
biotechnologische und medizinische Anwendungen
Felix Krujatz1, Karsten Helbig1, Juliane Steingroewer1, Anja Lode2, Sophie Brüggemeier2, Mandy Quade2, Kathleen Schütz2, Sven
Knaack2, Thomas Bley1, Michael Gelinsky2, Jost Weber1
1 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik, TU Dresden, Bergstraße 120, 01069 Dresden
2Zentrum für Translationale Knochen-, Gelenks- und Weichgewebsforschung, Universitätsklinik Dresden, Fetscherstraße 74, 01307 Dresden
Referenzen
[1] Lode A, Krujatz F et al. (2015) Eng. Life Sci. 15, 177-181.
[2] Krujatz F, Lode A et al. (2015) Eng. Life Sci. In press.
[3] Hopfner U et al. (2014) Acta Biomater.10, 2712-2717.
Einleitung und Motivation
Photobiotechnologische Prozesse zur Gewinnung erneuerbarer Energien, Plattformchemikalien und pharmazeutischer Wirkstoffe sind von wachsendem
industriellen Interesse. Die meisten Anwendungen nutzen suspendierte Zellen, wobei die Kultivierung von immobilisierten Zellen Vorteile für die Ab-
trennung der Zellen vom Kulturmedium und Schutz hinsichtlich auftretender Scherkräfte durch Rühren oder Begasen bietet. In einem interdisziplinären
Forschungsansatz entwickelten Wissenschaftler der TU Dresden eine neue Immobilisierungsmethode für Mikroalgen, das so genannte Green
Bioprinting, welches auf einem 3D-Druck-Verfahren basiert, das ursprünglich im Tissue Engineering angewendet wird. Das 3D-Druck-Verfahren erlaubt
die Herstellung beliebiger Immobilisatstrukturen, die in konventionellen Kultivierungssystemen kultiviert werden können. Am Modellorganismus
Chlamydomnas reinhardtii 11.32b wurde gezeigt, dass die Hydrogelumgebung exzellente Bedingungen für das Algenwachstum und die Viabilität bietet.
Material und Methoden
3D-Druck: BioScaffolder 2.1 (GeSiM) mit 3-Kanal-Dosiervorrichtung (Abb. 1); Suspendieren von C. reinhardtii
11.32bin einer sterilen Alginat/Methylcellulose Mischung (3:1), 3D-Druck mittels Bioscaffolder 2.1
und anschließendes Vernetzen der Hydrogelstruktur in 100 mM CaCl2bei Raumtemperatur [1]
Viabilität: Hydrogel: 5 µM Sytox Green (λex/λem:488 nm/525±10 nm) Färbung der toten Zellen, Analyse mittels
Zeiss cLSM 510, Chlorophyllfluoreszenz für Gesamtzellzahl (λex/λem:561 nm/605±15 nm) [1];
Suspension: DIBAC4(3)-Färbung toter Zellen, Analyse mittels Cube8 flow cytometer [2]
Kultivierung: Photoautotrophe Schüttelkolbenkultivierung in 25 mL Tris-Phosphat Medium, Bedingungen:
26°C,100 rpm, 150 µmol m-2 s-1 LED-Panel, [2] (Suspensions- und Hydrogelkulturen)
µ[d-1]: Hydrogelaufschluss, Chlorophyllextraktion und Kalibrierung gegen die Zellzahl nach [3]
Zusammenfassung und Ausblick
Hohe Transparenz des Alginat/Methylcellulose Hydrogels bietet hervorragende Bedingungen für das
photoautotrophe Wachstum von Mikroalgen und optische Viabilitätsanalysen
Mikroalgen können mittels Bioprinting in einem strukturierten Hydrogel immobilisiert werden
Das Bioprinting Verfahren ermöglicht es verschiendene Zelltypen in direkter Nähe aber ohne
physischen Kontakt in Co-Kultur zu kultvieren (Abb. 6 und [1])
Die Verkapselung von Mikroalgen mittels 3D-Bioprinting-Verfahren (Green Bioprinting)
ermöglicht neue und interessante Anwendungsgebiete, z.B. Kaskadenreaktionen von
Ganzzellbiokatalysatoren, neue Ansätze für die Wasseraufbereitung oder die Erstellung von
Modellsystemen für symbiotische lebende Organismen.
Tote Zellen (525±10 nm)Chlorophyll (605±15 nm) Gesamt
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Abb. 1: BioScaffolder 2.1 (GeSiM)
Abb. 2: Mikroalgenwachstum in 3D-geplotteten Hydrogelen
(Aufnahmen durch Stereo-Lichtmikroskop)
Ergebnisse
Abb. 4: Vergleich der erzielten Wachstumsraten
für Suspensionskulturen und Hydrogel-
immobilisierte Mikroalgenkulturen [2]
Suspensionskulturen: Die Wachstumsrate µ [d-1] ist direkt von der Temperatur
und den Beleuchtungsbedingungen (Abb. 4, schwarze Balken) abhängig
Die Hydrogel-Immobilisierung führte zu stabilen Wachstumsraten (0.4 - 0.7 d-1)
und einer hohen Viabilität (80 - 90 %) (Abb. 5, rote Balken und Tab. 1)
C. reinhardtii 11.32b konnte durch den Bioprinting Prozess homogen
im Hydrogelkonstrukt verteilt und eingebettet werden
C. reinhardtii 11.32b zeigte eine hohe Viabilität nach dem Bioprinting
Prozess und vermehrte sich unter photoautotrophen
Prozessbedingungen (Abb. 2)
Es bildeten sich nach 12 Tagen sehr vitale und photosynthetisch
aktive Algenclutser (30-40 µm) im Hydrogel aus (Abb. 2,3)
Abb. 6: Co-Kultivierung von SaOS-2 Humanzellen und
C. reinhardtii 11.32 b in einem strukturierten Hydrogel-
Scaffold. Photosynthetisch produzierter O2verhindert
eine O2-Limitierung der humanen SaOS-2 Zellen.
Lebendfärbung (links unten, rot: Algen; grün SaOS-2)
Danksagung
Die Autoren danken dem SMWK und der DFG Exzellenz Initiative der TU Dresden für die finanzielle Unterstützung
Abb. 3: Viabilitätsbestimmung mittels Sytox Green Färbung toter Zellen im
Hydrogelkonstrukt
C
. reinhardtii 11.32b Dauerlicht
24/0 Stunden Hell/Dunkel Zyklen
14/10 Stunden
26
°C
Viabilität
Suspension [%] 63.6 ±12.8 71.3 ±7.1
Viabilität
immobilisiert [%] ≈ 90 % ≈ 85 %
30
°C
Viabilität
Suspension [%] 14.6 ±14.0 86.0 ±2.2
Viabilität
immobilisiert [%] ≈ 80 % ≈ 80 %
37
°C
Viabilität
Suspension [%] 5.2 ±4.8 93.0 ±0.24
Viabilität
immobilisiert [%] ≈ 80 % ≈ 85 %
Abb. 5: Fiji-basierte Viabilitätsbestimmung
im Hydrogel mit Hilfe der auto-
matischen Partikelerkennung [2]
Tab. 1: Vergleich der erzielten Viabilitäten für Suspensions- und Hydrogel-immobilisierte Kulturen
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