Antioxidants and porphyrin from in vitro cultures of Adesmia boronioides, Larrea divaricata and Atriplex lampa

Abstract

Polyphenols are involved in defense against UV-radiation as well as in antioxidant activity. There are many native plants from Patagonia empirically used with therapeutic goals. In order to study their antioxidant activity and pigments, three native patagonic species were cultured in vitro: Adesmia boronioides, Larrea divaricata and Ariplex lampa. Seedlings obtained from sterile seeds were micropropagated for 60 days in MS medium + (2219 μM) 6-bencil amine purine-(0.053 μM) naftalen acetic acid, with a luminic intensity of 45 μmol foton.m-2.s-1,16:8 light: darkness, 22-24°C, subcultured every 20 days. A. boronioides showed 1.7 and 3.7 times more porphyrin than the other cultures. A low level of total and a/b chlorophyll ratio (2.98) was observed and catalase activity (EC 1.11.1.6) was the lowest. The highest amount of chlorophyll was found in L. divaricata, with a high content of clorophyll a (chlorophyll a/b ratio:21.04) and 2 to 13 times as much anthocyanins as the other cultures. A. lampa showed 4 to 6 times more polyphenols and catalase activity was 5 to 20 times higher than in the other cultures.

Full text

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Antioxidantes y porrinas de A. boronioides, L. divaricata y A. lampa cultivadas in vitro
Tomo 42 • N° 2 • 2010
RESUMEN
Los polifenoles están involucrados en la
defensa contra la radiación ultravioleta, en la
actividad antioxidante, con un signicado evo-
lutivo. En la región patagónica existen plantas
nativas de interés medicinal muy valoradas por
la herbolaria tradicional de la zona. Se estudió
actividad antioxidante y pigmentos en Adesmia
boronioides, Larrea divaricata y Atriplex lampa
(plántulas enteras, 60 días) micropropagados
a partir de semillas estériles, cultivadas en
MS suplementado con 6-bencil-amino-purina
(2219 µM), ácido naftalén-acético (0,053 µM),
45 µmoles fotón.m-2 .s-1, 16h/8h luz/:oscuridad,
22-24°C, subcultivo: 20 días. A.boronioides
presentó entre 1,7 y 3,7 veces mayor contenido
de porrinas respecto de los otros cultivos. Se
observó una baja cantidad de clorola total con
disminución de clorola a a expensas de la b
(clorola a/b:2,98). La actividad de catalasa
(EC1.11.1.6) fue la menor de los tres cultivos.
El mayor contenido de clorolas fue encontrado
en L. divaricata con un alto contenido de clorola
a (clorola a/b:21,04) y tuvo 2 a 13 veces más
antocianinas que los otros cultivos. A. lampa
presentó baja cantidad de clorola (clorola
Rev. FCA UNCuyo. Tomo 42. N° 2. Año 2010. 135-142.
Originales: Recepción: 29/04/2009 - Aceptación: 15/08/2009
Antioxidantes y porfirinas de Adesmia boronioides,
Larrea divaricata y Atriplex lampa cultivadas in vitro
Antioxidants and porphyrin from in vitro cultures of Adesmia
boronioides, Larrea divaricata and Atriplex lampa
Diego Estomba 1, 2
Hernán Mattes Fernandez 2
Ana María Stella 1
1 Laboratorio de Ecoporrinas. Dpto. de Química Biológica. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
Universidad de Buenos Aires, CONICET. Int. Güiraldes 2620, Pabellón II, piso 4. Buenos Aires,
Argentina. C1428EAH. anamariastella@ecoporrinas.com.ar
2 Laboratorio de Propagación Vegetativa. Asentamiento Universitario de San Martín de los Andes.
Universidad Nacional del Comahue. Pasaje de la Paz 235. (8370) San Martín de los Andes. Neuquén.
Argentina.
ABSTRACT
Polyphenols are involved in defense
against UV-radiation as well as in antioxidant
activity. There are many native plants from
Patagonia empirically used with therapeutic
goals. In order to study their antioxidant activity
and pigments, three native patagonic species
were cultured in vitro: Adesmia boronioides,
Larrea divaricata and Ariplex lampa. Seedlings
obtained from sterile seeds were micropropa-
gated for 60 days in MS medium + (2219 µM)
6-bencil amine purine-(0.053 μM) naftalen
acetic acid, with a luminic intensity of 45 µmol
foton.m-2.s-1,16:8 light: darkness, 22-24°C,
subcultured every 20 days. A. boronioides
showed 1.7 and 3.7 times more porphyrin
than the other cultures. A low level of total
and a/b chlorophyll ratio (2.98) was observed
and catalase activity (EC 1.11.1.6) was the
lowest. The highest amount of chlorophyll was
found in L. divaricata, with a high content of
clorophyll a (chlorophyll a/b ratio:21.04) and
2 to 13 times as much anthocyanins as the
other cultures. A. lampa showed 4 to 6 times
more polyphenols and catalase activity was 5
to 20 times higher than in the other cultures.

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Revista de la Facultad de Ciencias Agrarias
a/b:8,53); 4 a 6 veces más polifenoles y 5 a 20
veces mayor actividad de catalasa, respecto
de los otros cultivos. Los resultados indican
la posibilidad de aplicar estos cultivos in vitro
como fuente de metabolitos bioactivos.
Palabras clave Keywords
polifenol • catalasa • antocianina •
plantas patagónicas • metabolitos
bioactivos
polyphenol • catalase • anthocyanin
• patagonic plants • bioactive meta-
bolites
INTRODUCCIÓN
En la región patagónica existen plantas nativas de considerable interés etnobotá-
nico, valoradas por la herbolaria de los pueblos originarios de la zona (etnia mapuche
especialmente), cuyo uso fue trasmitido empíricamente en el marco del saber popular
de la región (1).
El riesgo de pérdida de las especies vegetales patagónicas, constatado tanto a nivel
cultural como ecológico, constituye una importante motivación para su conservación,
investigación y eventual domesticación (3, 20). En este marco, resulta de interés la micro-
propagación in vitro, técnica que permite obtener plantas sanas, libres de contaminantes
y con altos niveles de multiplicación, lo que aporta a la conservación de la especie (12).
A su vez, el creciente desarrollo de la biotecnología ha centrado su interés en
el estudio de los metabolitos bioactivos. Parte importante de estos últimos son los
llamados "metabolitos secundarios". Estos metabolitos pueden ser una fuente natural
de antioxidantes para la industria alimentaria como se ha propuesto en plantas de
Córdoba (Argentina) (4). También pueden ser compuestos tóxicos o repelentes para
insectos y herbívoros, vinculados a una función de defensa de la planta y frecuente-
mente presentan actividad farmacológica útil para el hombre (16). Entre ellos están
los polifenoles, involucrados en la defensa contra la radiación ultravioleta, hecho al
que se le ha asignado además un signicado evolutivo (8, 21, 27). Desde un punto
de vista ecosiológico, la síntesis de metabolitos secundarios está sujeta a un limita-
do número de factores ambientales, entre ellos el agua, la luz y la disponibilidad de
nutrientes. Existen evidencias de que el estrés abiótico controlado puede favorecer la
biosíntesis de metabolitos secundarios. En ese sentido, el cultivo in vitro, al posibilitar
la manipulación de la condiciones ambientales, es una alternativa muy promisoria
para la producción masiva de los mismos (18, 31, 33, 34).
Si bien bajo condiciones de crecimiento normal la producción de radicales libres
se mantiene baja, su producción es estimulada en la mayoría de las situaciones de
estrés que interrumpen la homeostasis celular. El cultivo in vitro puede representar
una fuente de estrés y, como tal, podría alterar el metabolismo (en particular el de
porrinas), modicar el contenido de clorolas, aumentar los radicales libres y llevar a
These results show that in vitro cultures of
Adesmia boronioides, Larrea divaricata and
Ariplex lampa can be used as source of bioac-
tive metabolites.

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una disminución de las defensas antioxidantes tales como el contenido de antocianinas,
polifenoles y la actividad especíca de enzimas antioxidantes como la catalasa (2, 11).
La síntesis de las porrinas ocurre a través de una ruta común, a partir de molé-
culas simples (2). Los productos nales se diferencian por presentar sustituyentes del
anillo de diferente naturaleza y puntos de ramicación. Las clorolas, esenciales para
el metabolismo de las plantas verdes son, al igual que el hemo y el sirohemo (grupos
prostéticos de las nitrito y sulto reductasas), el grupo cromóforo de los tocromos y
los grupos prostéticos de las enzimas antioxidantes, porrinas (2, 11, 30).
El objetivo del presente trabajo fue estudiar la actividad antioxidante de tres es-
pecies nativas patagónicas, de interés aromático o medicinal, cultivadas in vitro:
a) Adesmia boronioides (Leguminosae), arbusto aromático, de hojas resinosas,
presente desde el sur de Mendoza hasta Santa Cruz, Argentina (10, 17, 31).
b) Larrea divaricata (Zygophyllaceae), arbusto aromático de tallo leñoso y hojas
bifoliadas, difundido desde México hasta la Patagonia (Chubut, Argentina) (24).
c) Atriplex lampa (Chenopodiaceae), arbusto de hojas de color ceniciento que habita
en zonas áridas, desde Córdoba hasta el norte de Santa Cruz, Argentina, utili-
zado como planta forrajera (26). Además, se completó el estudio de pigmentos
(clorolas y porrinas) en las tres especies nativas patagónicas, para comprobar
el estado siológico del cultivo in vitro.
MATERIALES Y MÉTODOS
A. boronioides, L. divaricata y A. lampa fueron cultivadas in vitro en el Laborato-
rio de Propagación Vegetativa del Asentamiento Universitario de San Martín de los
Andes, Universidad Nacional del Comahue, a partir de semillas suministradas por la
Cátedra de Botánica General de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad
Nacional del Comahue. Las semillas de A. boronioides y L. divaricata se esterilizaron
con hipoclorito de sodio (20%) (inmersión repetida de las semillas durante 10, 5, 5 y
5 minutos) y lavado intensivo con agua destilada estéril. A. lampa necesitó el mismo
número de inmersiones con menor concentración de hipoclorito de sodio (4%) para su
esterilización. Se sembró, cada semilla, sobre 30 ml de medio semisólido (25) suple-
mentado con 6 -bencil-amino-purina (2219 μM) y ácido naftalén acético (0,053 μM),
sacarosa (30 g/l), Agar-agar (7 g/l)), previamente esterilizado en autoclave a 120°C,
1 atm de presión, durante 15 minutos), en frasco de vidrio (145 ml). Las plántulas
fueron incubadas en cámara de cultivo bajo luz uorescente (45 μmol photon m-2 s-1),
a 22-24°C (fotoperíodo de 16 horas-luz / 8 horas-oscuridad). Los subcultivos se reali-
zaron cada 20 días. Las plántulas fueron examinadas diariamente durante 60 días.
Todas las determinaciones bioquímicas se realizaron sobre la totalidad de la
plántula cortada con bisturí estéril y machacada en mortero. A partir de 0,20 + 0,05 g
de plántulas (de 30 y 60 días) de A. boronioides, L. divaricata y A. lampa se realizó la
determinación de clorolas por el método de Lichtenthaler y Wellburn (22), porrinas
según la metodología de Divo de Sésar et al. (11) y proteínas totales de acuerdo

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con Bradford (6), usando como estándar suero fetal bovino. Para la determinación
de antocianinas y polifenoles, a partir de 0,50 + 0,06 g de plántulas de 60 días de
A. boronioides, L. divaricata y A. lampa se procedió de acuerdo con Stella et al. (29)
empleando el reactivo de Folin - Ciocalteau y solución de Na2 CO3, usando ácido gálico
como estándar de polifenoles. Las antocianinas se cuanticaron por pH diferencial
según la técnica descripta por Benvenuti et al. (3), Sellapan et al. (28) y López Agüero
et al. (23). En ambos casos se midió la absorbancia empleando un espectrofómetro
Beckman serie D500. La actividad de catalasa (EC 1.11.1.6) se realizó de acuerdo con
Brees y Sizer (7). El extracto enzimático de A. boronioides, L. divaricata o A. lampa
crecidas durante 60 días, se obtuvo a partir del homogenato de 10000 xg del cultivo
(0,10 + 0,07 g) previamente machacado con mortero y buffer 50 mM K2HPO4, pH 7,5,
en una relación 1:60 (p:v). La actividad de catalasa se midió por la caída en la absor-
ción a 240 nm de 0,8 ml de agua oxigenada (20 mM, pH 7,0) a 25°C, empleando un
coeciente de extinción molar 4,7 x107 M-1 cm-1 de acuerdo con Chance et al. (9). La
actividad de catalasa fue expresada como µmol(U)/mg proteínas .
El diseño experimental fue completamente aleatorizado con las repeticiones
correspondientes en cada caso (n=3). Los datos fueron sometidos a un análisis de
varianza (ANOVA) y para detectar diferencias entre tratamientos y entre diferentes
tiempos se usó la prueba de Tukey HDS (p < 0,05).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Con el interés de obtener plántulas sanas in vitro para una rápida multiplicación (12)
a través de la micropropagación es que se determinó en las tres especies el contenido de
clorolas a y b, porrinas y proteínas a 30 y 60 días. Un desorden siológico común en la
propagación in vitro es la vitricación o hiperhidricidad, la cual resulta en alteraciones morfo-
lógicas, anatómicas y bioquímicas en las plántulas tales como hojas quebradizas, traslúcidas
y arrugadas acompañadas con una disminución de clorolas y de la relación clorola a/b
(11,15). Las plántulas no mostraron signos morfológicos de vitricación durante los 60 días
de cultivo. La relación porrinas/proteínas totales a los 30 días de cultivo in vitro: A. boronioi-
des: 0,827, L. divaricata: 0,188 y A. lampa: 0,09, y la de clorola a/b para: A. boronioides:
3,0, L. divaricata: 21,3 y A. lampa: 8,02, fue similar a los 60 días (tabla y gura 1, pág. 139).
Cultivo Porrinas (µg/g PF) Proteínas (mg/g PF)
A5,898 + 0,505 a 7,133 + 0,037 c
B1,636 + 0,497 c 8,657 + 0,335 b
C3,527 + 0,307 b 38,905 + 0,099 a
Tabla. Contenido de porrinas y proteínas de Adesmia boronioides (A), Larrea di-
varicata (B) y Atriplex lampa (C); plántulas cultivadas in vitro de 60 días.
Table. Porphyrin and protein content from Adesmia boronioides (A), Larrea divari-
cata (B) and Atriplex lampa (C); seedlings cultured in vitro during 60 days.
PF = peso fresco. Letras diferentes indican diferencias signicativas (p < 0,05).
Different letters indicate signicant difference (p < 0.05).

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A partir de estas investigaciones se exploró el potencial bioquímico de A. boronioides,
L. divaricata y A. lampa. Para ello se realizó un estudio descriptivo y compartivo, en cuanto
a pigmentos y antioxidantes, en las tres especies crecidas durante 60 días. A. boronioides
presentó entre 1,7 y 3,7 veces mayor contenido de porrinas, respecto de L. divaricata y
A. lampa, mientras que esta última fue la que presentó el mayor contenido de proteínas
(tabla, pág. 138). Si bien la cantidad de porrinas es elevada, A. boronioides mostró
baja cantidad de clorola total (gura 1A). Este resultado se debería a la disminución de
clorola a a expensas de la b (gura 1D). Por otro lado, si bien el contenido de porrinas
de L. divaricata fue el menor de las tres especies, el de clorolas totales y la relación
clorola a/b fue la mayor entre las tres especies (guras 1B y 1D). En cuanto a A. lampa,
la relación clorola a/b fue intermedia entre las otras dos especies (fIguras 1C y 1D).
A. lampa presentó un nivel entre 4 y 6 veces más alto de polifenoles totales, y
también 5 a 20 veces mayor actividad de catalasa respecto de los otros dos cultivos,
mientras que L. divaricata tuvo 2 a 13 veces más antocianinas que los otros cultivos
(gura 2A, 2B y 2C, pág. 140).
Letras diferentes indican diferencias signicativas (p < 0,05).
Different letters indicate signicant difference (p < 0.05).
Figura 1. Contenido de clorolas de A. boronioides (A), L. divaricata (B) y A. lam-
pa (C). Relación clorola a/b de A. boronioides, L. divaricata y A. lampa (D);
plántulas cultivads in vitro durante 60 días.
Figure 1. Chlorophyll content from A. boronioides (A), L. divaricata (B) and A. lam-
pa (C). Chlorophyll (a/b) ratio from A. boronioides, L. divaricata and
A. lampa (D); seedlings cultured in vitro during 60 days.

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Estos resultados podrían explicar el empleo popular (13,19) de Adesmia boro-
nioides como antirreumático y cosmético para el cabello (17), de Larrea divaricata
en alteraciones dermatológicas y reumatológicas (24), y de Atriplex lampa como
astringente, digestivo y antirreumático (26).
El consumo de alimentos con altos contenidos de antioxidantes, tales como los
polifenoles, está siendo ampliamente utilizado en la prevención de enfermedades
crónicas y en la disminución de inamaciones. La utilidad de los compuestos fenólicos
en tratamientos médicos se basa en su capacidad antioxidante, anticarcinogénica
o antimutagénica y antiinamatoria (14). La capacidad antioxidante en cuanto a la
concentración de polifenoles totales presentes en las tres especies patagónicas
A. boronioides, L. divaricata y A. lampa cultivadas in vitro es comparable, y en algu-
nos casos mayor, a las observadas en arándanos y frambuesas (géneros Vaccinium
y Rubus), frutos del bosque comestibles ampliamente utilizados por sus propiedades
antioxidantes (3), con alto potencial nutracéutico, que al igual que las especies pata-
gónicas han demostrando tener propiedades siológicas beneciosas para la salud
humana, ya sea en la prevención de enfermedades tales como infecciones urinarias
o inamaciones oculares (5, 32).
Figura 2. Contenido de polifenoles (A), antocianinas (B) y actividad de catalasa (C)
de A. boronioides, L. divaricata y A. lampa: plántulas cultivadas in vitro
durante 60 días.
Figure 2. Polyphenols and antocyanin content, catalase activity from A. boronioides,
L. divaricata and A. lampa, seedlings cultured in vitro during 60 days.
Letras diferentes indican diferencias signicativas (p < 0,05).
Different letters indicate signicant difference (p < 0.05).

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CONCLUSIÓN
Los estudios realizados en cultivos in vitro de las especies nativas patagónicas
Adesmia boronioides, Larrea divaricata y Atriplex lampa presentan un punto de partida
en la obtención de material vegetal sobre el cual sería posible trabajar como fuente de
compuestos que lo caracterizan como alimento nutracéutico, entendiéndose como tal
cualquier sustancia considerada alimento o parte de un alimento que provee benecios
a la salud, incluyendo la prevención de ciertas enfermedades.
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