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Ciência Animal 22(3): 17-23, 2012 17
CONTAGEM AUTOMÁTICA E MICROSCÓPICA DIRETA DE CÉLULAS
SOMÁTICAS DO LEITE DE OVELHAS SANTA INÊS, UTILIZANDO COMO
CORANTES O BROADHURST-PALLEY E A HEMATOXILINA-EOSINA
(Automatic and direct microscopic somatic cell count in Santa Ines ewes, using the Broadhurst-
Palley and Hematoxili-eosin stains)
Débora Assis BARBOSA1*, Maiara Garcia BLAGITZ2, Camila Freitas BATISTA1, Viviani
GOMES1, Milton Ricardo AZEDO3, Fernando Nogueira de SOUZA4, Nilson Roberti
BENITES5, Alice Maria Melville Paiva DELLA LIBERA1*
1. Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Universidade de São
Paulo (USP), São Paulo; 2. Universidade Federal do Paraná, Campus Palotina, Palotina, Paraná; 3. Faculdade de
Medicina Veterinária, Universidade Metropolitana de Santos, Santos, SP; 4. Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva, Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG.; 5. Departamento
de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, FMVZ-USP, São Paulo, SP.
RESUMO
A presença de processos inflamatórios na glândula mamária pode ser avaliada pela contagem de
células somáticas (CCS) no leite. Em ovinos, devido ao maior conteúdo de sólidos totais, sobretudo
gordura, a contagem microscópica pode ser prejudicada, sendo necessário reavaliar os métodos de
coloração do esfregaço. O presente estudo buscou avaliar a celularidade do leite de ovelhas e a
comparação entre diferentes métodos de CCS no leite de ovinos da raça Santa Inês, através da
contagem microscópica direta utilizando os corantes Broadhurst-Palley (BP) e Hematoxilina-eosina
(HE) e a contagem automática de células somáticas em ovinos da raça Santa Inês. Foram utilizadas
602 amostras de leite de ovelhas Santa Inês em lactação. Estas amostras foram destinadas para a
CCS automática e para a contagem leucocitária utilizando as colorações de BP e HE. Os valores
logarítmicos da CCS automática (5,56 + 0,68), da contagem microscόpica utilizando as colorações
de BP (5,75 + 0,76) e HE (5,01 + 0,89) foram diferentes entre si (P < 0,0001). A contagens de
leucόcitos polimorfonucleares e mononucleares foram maiores ao utilizar a coloração de BP quando
comparado com a coloração de HE (P < 0,0001). As correlações entre a CCS automática e a CCS
microscópica utilizando as colorações de BP e HE foram de r = 0,82 e r = 0,79 (P < 0,0001),
respectivamente. A correlação entre a contagem microscόpica direta utilizando as colorações de
BP e HE foi de 0,76 (P < 0,0001). Conclui-se que, a metodologia empregada influencia a CCS no
leite de ovinos, apesar da alta correlação observada entre a contagem automática de células somáticas
e a contagem microscópica direta de células somáticas utilizando as colorações de BP e HE.
PALAVRAS CHAVES: LEITE, LEUCÓCITOS, MASTITE, OVINOS.
ABSTRACT
The somatic cell count (SCC) have been widely used as an indirect marker of inflammation, and
consequently in the diagnosis of mastitis. In ewes, there is a need to evaluate the different dyes used
in microscopic SCC due to the higher total solid content, mainly due to the fat content, that can
*Endereço para correspondência
Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Universidade de São
Paulo (USP), São Paulo – SP.
CEP 05508-270, E-mail: dellalibera@usp.br
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impair the evaluation of the microscopic SCC. Thus, the present study aimed to evaluate the milk
cellularity and compare different methodologies used to determine milk SCC as the microscopic
leukocyte count using the Broadhurst-Palley (BP) and Hematoxilin-eosin (HE) stains and the
automatic somatic cell count in Santa Ines ewes. Thus, 602 milk samples from Santa Ines ewes in
different lactation stages were used and submitted for automatic SCC and the microscopic leukocyte
count using the BP and HE stains. The logarithm values of automatic SCC (5.56 + 0.68), the
microscopic somatic SCC using the BP (5.75 + 0.76) and the HE dye (5.01 + 0.89) were different
(P < 0.0001). The polymorphonuclear and mononuclear leukocytes counts were higher using the
BP dye when compared to the HE dye (P < 0.0001). The correlations among automatic CSS and the
microscopic SCC using the BP and HE were r = 0.82 and r = 0.79, respectively (P < 0.0001). The
correlation between the microscopic SCC using the BP and HE dyes was 0.76 (P < 0.0001). Thus,
despite the high correlation observed among the automatic somatic cell count and the microscopic
leukocyte count using the BP and HE stains, the methodology applied can influence the milk SCC
from Santa Ines ewes.
KEY WORDS: LEUKOCYTES, MILK, MASTITIS, SHEEP.
são fundamentais para a obtenção do diagnóstico
correto e preciso.
A CCS do leite de ovelhas abrange
diferentes elementos celulares normalmente
presentes no leite, compreendendo os leucόcitos
e as células epiteliais. No entanto, a glândula
mamária dos pequenos ruminantes, por ser
considerada glândula com secreção apόcrina,
apresenta particularidades. Isto acarreta na
presença de partículas citoplasmáticas que
apresentam diâmetro e morfologia semelhantes
aos leucόcitos, que contêm grande quantidade
de proteína e ácido ribonucléico, mas ausência
de ácido desoxiribonucléico (ADN) (Paape et al.,
2001; Gomes et al., 2010, Souza et al., 2012).
Sabe-se que a correta determinação da CCS é
imprescindível para a detecção da infecção
intramamária (Nunes et al., 2008, Souza et al.,
2012), sendo ainda utilizada para a determinação
da qualidade do leite, e políticas de pagamento
do leite em alguns países (Paape et al., 2001). A
CCS de ovinos sadios varia entre 10 a 200 x 103
células/mL, sendo compostas por
aproximadamente 02 a 28% de neutrόfilos, e 46
a 84% de macrόfagos (Paape et al., 2001, Souza
et al., 2012). Diante de um processo infeccioso
da mama, há expressivo aumento da CCS devido
INTRODUÇÃO
A maioria dos estudos referentes à saúde
da glândula mamária em ruminantes se concentra
na espécie bovina, principalmente por ser a
espécie de maior impacto econômico. Desta
forma, os testes diagnósticos disponíveis para
detecção da mastite bovina, de certa forma
acabam sendo usados também para diagnosticar
a mastite caprina e ovina. Na prática, o
diagnóstico precoce de mastite em ovelhas de
corte encontra como limitação principal as
características da criação extensiva ou semi-
extensiva que predomina no país, fato que
contribui para a inspeção do úbere apenas no
período da parição e às vezes ao desmame
(Clements et al., 2003; Blagitz et al., 2008;
Blagitz et al., 2012), o que dificulta o diagnóstico
desta enfermidade nestes animais.
Tanto o exame da glândula mamária
quanto o exame do leite, realizado pelo exame
bacteriológico, pela prova de fundo escuro, pelo
California Mastitis test (CMT), pela contagem
de células somática (CCS) automática ou
microscópica (McDougall et al., 2001; Bergonier
et al., 2003; Nunes et al., 2008; Della Libera et
al., 2011; Souza et al., 2012; Blagitz et al., 2013)
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principalmente a infiltração de leucόcitos
polimorfonucleares, chegando a representar 90%
da população celular (Della Libera et al., 2011;
Souza et al., 2012).
As colorações ideais para o leite dos
pequenos ruminantes ainda são discutíveis.
Gonzalo et al. (2003) verificaram falhas na
coloração de azul de metileno, que por ser
inespecífico entre as células e os corpúsculos
citoplasmáticos, induziu alterações nas contagens
celulares. Gomes et al. (2010) observaram que
uma das colorações ideais para a CCS
microscópica em ovelhas da raça Lacaune foi a
pyronina-Y, porém uma limitação desta
coloração é o processamento. Os reagentes
utilizados são extremamente cancerígenos
prejudicando o responsável pela coloração. Neste
ínterim, muitas colorações vêm sendo estudadas
para vacas, como exemplo, as colorações de
Hematoxilina-eosina (HE), de Newman, de
Wright, de Broadhurst-Palley (BP) e o May-
Grünwald-Giemsa (Paape et al., 1963), porém
elas ainda precisam ser estudadas quando
aplicadas ao leite de ovinos. Além disso, em
ovinos, devido ao maior conteúdo de sólidos
totais, sobretudo gordura (Park et al., 2007), a
CCS por microscopia óptica pode ser
prejudicada, sendo necessário reavaliar os
métodos de coloração do esfregaço.
Na coloração de HE, os componentes
celulares básicos reagem com os corantes ácidos,
como ocorre com a eosina (corante ácido) que
cora de róseo ou vermelho o citoplasma celular.
Da mesma forma ocorre com a hematoxilina
(corante básico), que confere a cor púrpura-
azulada à cromatina celular (Raposo & Silva,
1999). Na coloração de BP, os sólidos do leite
se coram em rosa, as células mononucleares
(MN) se coram em azul, os leucócitos
polimorfonucleares (PMN) se coram em azul
pálido e as bactérias se coram em azul. O método
referência recomendado pelo International Dairy
Federation para a CCS é a microscopia direta
corada pelo azul de metileno (Gonzalo et al.,
2003), que tem como aspecto negativo a falta de
especificidade entre as células e partículas
citoplasmáticas.
Pelo supracitado, fica claro que a correta
enumeração da CCS é crucial para a detecção
do processo infeccioso da glândula mamária.
Desta forma, o presente estudo buscou avaliar a
celularidade do leite de ovelhas e a comparação
entre diferentes métodos da CCS no leite de
ovinos da raça Santa Inês, através da contagem
microscópica direta utilizando os corantes BP e
HE e a contagem automática de células
somáticas.
MATERIAL E MÉTODOS
O presente estudo utilizou 602 amostras
de leite de ovelhas Santa Inês em diferentes fases
da lactação provenientes de 17 rebanhos
localizados no Estado de São Paulo. Estas
amostras foram destinadas para a contagem
automática de células somáticas e para a
contagem leucocitária direta pelos corantes BP
e HE. Inicialmente, as amostras de leite (50 mL)
foram coletadas em frasco plástico contendo 8
mg de Bronopol (2-bromo-2-nitropropane-1-3,
diol) e 0,3 mg do antifúngico natamicina. A CCS
automática foi realizada por citometria de fluxo
utilizando o aparelho Somacount 300 (Bentley
Instruments® Inc., EUA) calibrado com leite de
bovinos, onde se detectou a fluorescência do
brometo de etídeo que forma um complexo com
o ácido desoxiribonucléico celular no núcleo
celular.
Para a contagem microscόpica direta, 10
μL de leite foram distribuídos em um cm2. O
método de Prescott e Breed (1910) foi
modificado utilizando a coloração de HE
conforme descrito por Benites et al. (2001) e a
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coloração de BP, sendo as metodologias
adaptadas para ovinos (Blagitz et al., 2013).
Efetuou-se a contagem leucocitária em cem
campos visuais das lâminas confeccionadas
usando objetiva de imersão, e multiplicou-se este
valor pelo fator microscό pico previamente
calculado (Paape et al., 2001). Salienta-se que o
presente trabalho está de acordo com os
princípios éticos de experimentação animal da
Comissão de Bioética da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São
Paulo sendo registrado sob o número 484/2004.
A distribuição de Gaussian foi verificada
pelo teste de Kolmogorov e Smirnov. Todos os
dados apresentaram distribuição não paramétrica.
As comparações entre as contagens leucocitárias
de polimorfonucleares e mononucleares
utilizando as colorações de BP e HE se deram
pelo teste de Wilcoxon para amostras pareadas.
A comparação entre a CCS automática e a
contagem microscόpica direta utilizando as
colorações de BP e a de HE, se deram utilizando
o teste de Friedman. A análise estatística foi
realizada utilizando o programa GraphPad
Prisma 5.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego,
CA, EUA). Foram consideradas significantes as
análises que apresentaram P < 0,05. As
correlações entre as diferentes contagens se
deram pela correlação de Spearmann utilizando
o programa MINITAB 16 (Minitab Inc., EUA).
RESULTADOS
Os valores logarítmicos da contagem
automática de células somáticas (5,56 + 0,68)
foram menores do que a contagem microscόpica
direta utilizando a coloração de BP (5,75 + 0,76)
(P < 0,0001), porém foram maiores do que a
contagem micro scόpica direta utilizando a
coloração de HE (5,01 + 0,89) (P < 0,0001).
Observou-se maior contagem de
leucόcitos polimorfonucleares utilizando a
coloração de BP (5,52 + 0,94) ao confrontar com
coloração de HE (4,59 + 1,44) (P < 0,0001). Do
mesmo modo, encontrou maior contagem de
leucόcitos mononucleares utilizando a coloração
de BP (5,15 + 0,78) ao com a coloração de HE
(4,31 + 1,27) (P < 0,0001).
Porém, correlações positivas fortes foram
encontradas entre a CCS automática e a
contagem microscόpica direta utilizando as
colorações de BP (r = 0,82; P < 0,0001) e HE (r
= 0,79; P < 0,0001), assim como entre a contagem
microscόpica direta utilizando as colorações de
BP e HE (r= 0,76; P < 0,0001). Ademais, a
correlação entre a contagem de leucόcit o s
polimorfonucleares utilizando as colorações de
BP e HE foi de 0,53 (P < 0,0001), e leucόcitos
mononucleares foi de 0,41 (P < 0,0001).
DISCUSSÃO
O presente estudo baseia-se na hipótese
do processo inflamatório causado pela infecção
mobiliza células para o sítio inflamatório, e essas
apresentam variação morfo-tintorial, pelos
diferentes graus de ativação e degeneração, que
limitam a impregnação por diferentes corantes
ou prejudicam de alguma forma a visualização
das estruturas.
Para comparar a eficácia de cada técnica
de contagem de células somáticas, usamos como
padrão a contagem automática de células
somáticas pelo método fossomático. Salienta-se
que dentre os métodos de contagem automática
de células somáticas, a CCS pelo método
fossomático têm apresentado resultados
interessantes. Isto se deve a utilização do brometo
de etídio que liga ao ADN no núcleo celular.
Assim, este método quantifica as células
epiteliais e os leucόcitos, não enumerando desta
forma os corpúsculos citoplasmáticos (Gonzalo
et al., 1993; Gonzalo et al., 2003; Gonzalo et al.,
2004; Souza et al., 2012).
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A contagem automática de células
somáticas apresentou resultados compatíveis
com sua aplicação no leite de ovelhas, porém
apresentaram valores superiores à contagem
microscόpica utilizando a coloração de HE. No
entanto, a contagem automática apresentou
valores inferiores a CCS pela coloração de BP.
Isto ficou mais visível, quando as duas colorações
foram confrontadas. As contagens de leucόcitos
polimorfonucleares e mononucleares utilizando
a coloração de BP foram superiores às contagens
de leucócitos polimorfonucleares e de
mononucleares corados com HE.
Esse fenômeno deve-se principalmente
a possível erro na técnica da coloração HE, que
passou por uma adaptação de Benites et al.
(2001), mas mesmo assim algumas amostras
ficaram pouco coradas. Como o núcleo das
células mononucleares impregna menos corante
do que o núcleo das células polimorfonucleares,
há maior dificuldade na visualização das células
mononucleares, o mesmo pode-se dizer das
células polimorfonucleares. Além disso, seria
preciso fazer uma lâmina piloto cada vez que
fosse corar uma amostra em dias diferentes, já
que o corante modifica-se pela quantidade de
vezes que é usado e pela sua maturação (Benites
et al., 2001).
Além disto, a coloração de BP apresenta
algumas vantagens em relação à coloração de HE
na contagem de células somáticas em leite de
ovelha sob alguns aspectos, a exemplo da
facilidade de execução da técnica, já que basta
uma passagem no corante e lavagem em água
corrente para a lâmina estar pronta para leitura,
gastando não mais do que cinco minutos,
enquanto no HE são necessárias várias passagens
pelos corantes, álcool-ácido e álcool absoluto,
gastando mais de 15 minutos e aumentando a
probabilidade de haver erros. Além disso, na
técnica da HE há grande perda de esfregaços,
sendo necessário corar as duplicatas, aumentando
com isso o tempo e materiais gastos (Benites et
al., 2001). Porém, o corante BP deve ser usado
com alguns cuidados, tais quais o
armazenamento em recipiente escuro e ser
conservado refrigerado, além de boa
homogeneização do corante imediatamente antes
do uso, já que ele tem tendência a precipitar.
Outro cuidado importante é quanto a sua
manipulação, que deve ser sempre com luvas e
evitando sua inalação, já que contém em sua
fórmula princípios tóxicos (Kapronezai, 2004).
A contagem diferencial tanto de
leucócitos polimorfonucleares quanto de
leucócitos mononucleares em ambas as
colorações apresentou correlação positiva, bem
como entre a CCS pelo contador automático e
pelas duas colorações de microscopia direta; ou
seja, toda vez que há aumento na concentração
de PMN ou de MN em uma coloração, esse
aumento também se repete para a outra, e sempre
que há aumento no total de células somáticas
detectado pelo contador automático há também
aumento em ambas as colorações.
CONCLUSÕES
Desta forma, pode-se concluir que a
metodologia influencia a CCS no leite de ovinos,
apesar dos resultados das CCS serem
semelhantes entre todas as técnicas empregadas.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a FAPESP pelo
auxílio financeiro concedido.
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