Assessment of toxic effects and lethal concentration 50 of surfactant Cosmoflux® 411F on juveniles of cachama blanca (Piaractus brachypomus)

Abstract

En Colombia, el surfactante Cosmoflux® 411F es usado en fumigaciones de cultivos ilícitos para mejorar la efectividad del glifosato. El uso del Cosmoflux® 411F no está soportado por estudios toxicológicos. Los objetivos del presente trabajo fueron determinar las lesiones anatomopatológicas derivadas de la exposición al Cosmoflux® 411F y establecer la concentración letal 50 (CL50) a 96 horas en cachama blanca (Piaractus brachypomus). Se utilizaron juveniles de cachama blanca (~40 g) en dos experimentos: 1) toxicidad subletal (n =126) y, 2) determinación de la CL50 (n =84). Las concentraciones del ensayo de toxicidad subletal fueron: 0 mg/l (Tratamiento 0), 0.17 mg/l (Tratamiento 1), 0.34 mg/l (Tratamiento 2), 0.68 mg/l (Tratamiento 3), 1.36 mg/l (Tratamiento 4), y 2.72 mg/l (Tratamiento 5), en sistema semiestático. Para determinar la CL50 las dosis fueron: 3000, 3450, 3900, 4350 y 4800 mg/l de Cosmoflux® 411F. La CL50 obtenida fue de 4417.99 mg/l. En los peces se evidenció leve disminución de la actividad de nado. A la necropsia se halló palidez del hígado y acumulación de material mucoso en las branquias. Por histopatología se halló: vacuolización de hepatocitos, hiperplasia de células epiteliales, de cloro y caliciformes branquiales, vacuolización de enterocitos, aumento de centros melanomacrófagos renales, gliosis, degeneración neuronal e infiltración de células granulares eosinofílicas/células mastocitos en telencéfalo. Los hallazgos concuerdan con lo reportado en peces expuestos a surfactantes, exceptuando las lesiones del sistema nervioso central que pueden tener consecuencias sobre interacciones sociales, de alimentación y reproducción de la especie; siendo necesario profundizar la investigación sobre dicho efecto. El hígado, branquias y piel constituyen órganos blanco de la acción tóxica. La CL50 hallada (4417.99 mg/l) es alta comparada con lo reportado en surfactantes no-iónicos. Se prevé un efecto sinérgico en la mezcla asperjada; sin embargo, el desconocimiento de la estructura del surfactante limita el análisis de su dinámica.

Full text

Rev Col Cienc Pec 2007; 20:431 - 446 431
Evaluación de los efectos tóxicos y
concentración letal 50 del surfactante
Cosmoflux® 411F sobre juveniles de cachama
blanca (Piaractus brachypomus)¶
Assessment of toxic effects and lethal concentration 50 of surfactant Cosmoflux® 411F
on juveniles of cachama blanca (Piaractus brachypomus)
Iang S Rondón-Barragán1∗, MVZ; Wilson F Ramírez-Duarte1, MVZ; Pedro R Eslava-Mocha1, MV, MS.
1Grupo de Investigación en Sanidad de Organismos Acuáticos, Instituto de Acuicultura de los Llanos (IALL), Universidad
de los Llanos, Km 12 Vía Apiay. Fax: (578) 6698700. AA 110. Villavicencio, Colombia.
iangrondon@gmail.com
(Recibido: 25 agosto, 2006; aceptado: 27, septiembre 2007)
Resumen
En Colombia, el surfactante Cosmoflux® 411F es usado en fumigaciones de cultivos ilícitos
para mejorar la efectividad del glifosato. El uso del Cosmoflux® 411F no está soportado por estudios
toxicológicos. Los objetivos del presente trabajo fueron determinar las lesiones anatomopatológicas
derivadas de la exposición al Cosmoflux® 411F y establecer la concentración letal 50 (CL50) a 96 horas
en cachama blanca (Piaractus brachypomus). Se utilizaron juveniles de cachama blanca (~40 g) en dos
experimentos: 1) toxicidad subletal (n =126) y, 2) determinación de la CL50 (n =84). Las concentraciones
del ensayo de toxicidad subletal fueron: 0 mg/l (Tratamiento 0), 0.17 mg/l (Tratamiento 1), 0.34 mg/l
(Tratamiento 2), 0.68 mg/l (Tratamiento 3), 1.36 mg/l (Tratamiento 4), y 2.72 mg/l (Tratamiento 5), en
sistema semiestático. Para determinar la CL50 las dosis fueron: 3000, 3450, 3900, 4350 y 4800 mg/l de
Cosmoflux® 411F. La CL50 obtenida fue de 4417.99 mg/l. En los peces se evidenció leve disminución de
la actividad de nado. A la necropsia se halló palidez del hígado y acumulación de material mucoso en las
branquias. Por histopatología se halló: vacuolización de hepatocitos, hiperplasia de células epiteliales, de
cloro y caliciformes branquiales, vacuolización de enterocitos, aumento de centros melanomacrófagos
renales, gliosis, degeneración neuronal e infiltración de células granulares eosinofílicas/células mastocitos
en telencéfalo. Los hallazgos concuerdan con lo reportado en peces expuestos a surfactantes, exceptuando
las lesiones del sistema nervioso central que pueden tener consecuencias sobre interacciones sociales,
de alimentación y reproducción de la especie; siendo necesario profundizar la investigación sobre dicho
efecto. El hígado, branquias y piel constituyen órganos blanco de la acción tóxica. La CL50 hallada (4417.99
mg/l) es alta comparada con lo reportado en surfactantes no-iónicos. Se prevé un efecto sinérgico en la
mezcla asperjada; sin embargo, el desconocimiento de la estructura del surfactante limita el análisis de su
dinámica.
Palabras clave: anatomopatología,cachamablanca,CL50,Cosmoflux®411F,lesioneshistopatológicas,
surfactantesnoiónicos,toxicologíaambiental
¶ Para citar este artículo: Rondón-Barragán IS, Ramírez-Duarte WF, Eslava-Mocha PR. Evaluación de los efectos tóxicos y concentración letal 50 del
surfactante Cosmoux® 411F sobre juveniles de cachama blanca (Piaractus brachypomus). Rev Col Cienc Pec 2007; 20:431-446.
∗ Autor para el envío de correspondencia y la solicitud de separatas: Instituto de Acuicultura de los Llanos (IALL), Universidad de los Llanos, Km 12 Vía
Apiay. AA 110. Villavicencio, Colombia. E-mail: iangrondon@gmail.com

Rev Col Cienc Pec 2007; 20:431 - 446432
Summary
In Colombia, surfactant Cosmoflux® 411F is used for the fumigation of illicit crops in order to
improve the glyphosate herbicide activity. The use of Cosmoflux® 411F is not supported by toxicological
surveys. The aims of this study were to determinate the anatomopathological lesions due to the exposure to
Cosmoflux® 411F and to establish lethal concentration 50 (LC50) to 96 hours in cachama blanca (Piaractus
brachypomus). Juveniles of cachama blanca (~40 g) in two assays were used: 1) sublethal toxicity (n= 126)
and 2) determination of LC50 (n=84). Sublethal toxicity assay concentrations were: 0 mg/l (Treatment 0)
0.17 mg/l (Treatment 1), 0.34 mg/l (Treatment 2), 0.68 mg/l (Treatment 3), 1.36 mg/l (Treatment 4), and 2.72
mg/l (Treatment 5); through semi-static system. For the determination of LC50 of Cosmoflux® 411F 3000,
3450, 3900, 4350 y 4800 mg/l concentrations were used. LC50 was 4417.99 mg/l. Animals showed slight
decrease in swimming activity. At necropsy examination were found paleness in liver and whitish material
accumulation in top of gill filament. Histopathologically, it was found fatty degeneration and hepatocyte
vacuolization, epithelial cells, chloride cells and mucous cells hyperplasia, enterocyte vacuolization,
increase in the expression of melanomacrophage centres in kidney, gliosis, neuronal degeneration and
infiltration of eosinophilic granule cells/mast cells in telencephalon. With exception of central nervous
system lesions, the findings are according to the reported in literature about surfactant exposure in fish.
Central nervous system effects can have consequences on feeding, reproductive and social interactions,
due to close telencephalon/olfactory system relationship, being necessary to deep in research to these
processes. In same way, liver, gills and skin are target organs of toxic action of this xenobiotic. LC50 is
high (4417.99 mg/l) compared with that reported for other nonionic surfactants. Nevertheless, the lack
of information about the structure of surfactant restrict the analysis of the dynamic and implications of
xenobiotic in the generation of lesions, although, a synergic effect on the mixture is foreseen.
Key words: anatomopathologicallesions,cachamablanca,Cosmoflux®411F,environmentaltoxicology,
LC50,non-ionicsurfactants.
Introducción
La política de aspersión de cultivos ilícitos en
Colombia se inició en la década de 1970, debido a
la gran producción nacional de marihuana. Desde
entonces, las prácticas de cultivo de marihuana,
coca y amapola y la distribución de coca y opio/
heroína han constituido un objetivo de intervención
del gobierno colombiano a través de un programa
nacional de control y erradicación de cultivos
ilícitos. En 1984, ante la escalada narcoterrorista
en el país reforzó la lucha contra la producción de
drogas, permitiendo la aspersión aérea con glifosato.
Desde 1992, se inició la práctica de aspersión con
glifosato bajo la presentación comercial Roundup®
Ultra por aplicación aérea para el control de los
cultivos de amapola y coca (14). El glifosato además
es usado como madurante de caña, desecante de
granos y para el control de malezas en cultivos de
arroz (40, 52).
La mezcla de aspersión sobre cultivos de coca
y amapola se compone de glifosato utilizado bajo la
presentación comercial Roundup® Ultra constituyendo
el 44% de la mezcla en proporción volumen/
volumen lo que determina una concentración de
180 g de glifosato como principio activo por litro
de la mezcla, además de un surfactante catiónico
poliexietilamina (POEA) (72); este producto además
contiene un surfactante no-iónico denominado
Cosmoux® 411F, cuyo uso se realiza únicamente
en Colombia, al 1%, y el 55% restante de la mezcla
está constituido por agua. La tasa de aspersión de la
mezcla sobre los cultivos para el Roundup® Ultra es
de 17.6 a 30.8 l/ha (14).
Hasta el 2004, se han utilizado 1’420.130 litros
de Roundup Ultra (Solomon et al, 2005), mientras
que en el 2005, las áreas de coca y amapola
asperjadas fueron 138.775 y 1624 hectáreas,
respectivamente (69).
Marc et al (34) determinaron que el glifosato,
en diferentes productos comerciales conteniendo
agentes surfactantes, a una concentración de 0.01
a 0.12 mM (variable dependiendo del producto
comercial y por ende de los compuestos surfactantes
presentes en el producto) en una microgota asperjada
es suciente para ocasionar una disregulación en la
transición del ciclo celular, la cual es inferior a la

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concentración recomendada para aspersión de 40
mM, siendo incluso más baja a la concentración
de glifosato en la aspersión de cultivos de coca y
amapola realizada en Colombia que es de 234 mM.
Conjuntamente con el retraso en la progresión del
ciclo celular, estos mismos autores han descrito que
los herbicidas a base de glifosato inhiben la síntesis
del ADN durante la fase S (33). En Colombia, se ha
descrito citotoxicidad y genotoxicidad en células
humanas expuestas in vitro al glifosato (37), lo cual
concuerda con resultados de estudios hechos en el
Ecuador (43).
Aun cuando se han adelantado estudios en
Colombia tendientes a dilucidar el efecto de la
aspersión con glifosato y sus mezclas, aquellos que
favorecen la inocuidad (61) de este herbicida están
basados en el principio activo glifosato y no en el
producto comercial de aspersión el cual contiene
surfactantes que han demostrado ser mas tóxicos
que el glifosato solo (16) y que en mezcla muestran
sinergismo (14). Con respecto al Cosmoux 411F,
de acuerdo con el concepto toxicológico LP-0593-
93 del Ministerio de Salud de Colombia es un
producto de categoría toxicológica IV (ligeramente
tóxico) y posee licencia de venta del Instituto
Colombiano Agropecuario - ICA (Nº 054-2186).
La ausencia de trabajos acerca de las
características toxicológicas del Cosmoux 411F
hace notable la carencia de respaldo argumentado
en bioensayos (in vitro o in vivo) que permitan
determinar la viabilidad ecológica, tanto a corto
como largo plazo de la adición del Cosmoux
411F a la mezcla de aspersión, cuyos componentes
presentan características toxicológicas y riesgosas
para el ambiente. Los posibles mecanismos por los
cuales los surfactantes pueden inuir en la toxicidad
del glifosato incluyen la reducción de la tensión
supercial así como la alteración de la permeabilidad
de membranas biológicas y barreras de difusión o
procesos de transporte de membrana, incluyendo
la permeabilidad al glifosato e interactuando
directamente con el glifosato alterando, de este modo,
la disposición del herbicida (12).
Este trabajo tuvo por objeto determinar las
lesiones macro y microscópicas en branquias, piel,
cerebro, intestino, hígado y riñones del Cosmoux®
411F en cachama blanca, (Piaractusbrachypomus),
así como la determinación de la concentración letal
50 (CL50) a 96 horas.
Materiales y método
Comitédeética
El estudio contó con la aprobación del Comité de
Bioéctica de la Universidad de los Llanos para los
procedimientos de experimentación animal (Acta
001 del Consejo Institucional de Investigaciones,
del 19 de enero de 2005).
El trabajo se realizó en el Laboratorio de
Bioensayos del Instituto de Acuicultura de los Llanos
(IALL), Universidad de los Llanos, Villavicencio
(Meta) Km 4 Vía Puerto López. Vereda Barcelona.
A una altitud de 420 msnm y temperatura promedio
de 25 ºC.
Animalesexperimentales
En el estudio se utilizaron juveniles de cachama
blanca (Piaractusbrachypomus), obtenidos de un
mismo desove de la estación piscícola del IALL,
clínicamente sanos y criados en estanques en
tierra; con un peso de ~42 g, alojados en acuarios
de vidrio, con un volumen de 48 l de agua,
acondicionados con aireación constante, sin filtro.
Los animales experimentales fueron alimentados
dos veces al día (7 a.m. y 4 p.m.) con concentrado
comercial “Mojarra” al 30% de proteína bruta con
una ración correspondiente al 2% del peso. Los
animales fueron aclimatados por un periodo de 15
d y fueron medidos los parámetros de calidad de
agua: pH (Pinpoint pH Monitor, American Marine
Inc. USA), temperatura y oxígeno disuelto (Hach
Portable LDO HQ10 Dissolved Oxygen Meter,
USA) a la misma hora cada día (07:00 am).
El experimento de toxicidad subletal se basó en
un sistema semiestático con recambio diario del
50% del volumen de agua con mantenimiento de la
concentración mediante la adición de la mitad de la
dosis. Para la determinación de la CL50 se empleó
un sistema estático.

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Sustanciaexperimental
El Cosmoux 411F es elaborado por la empresa
colombiana Cosmoagro, del cual no se describe la
composición exacta, pero se sabe contiene como
ingredientes activos una mezcla de sustancias
tensoactivas estereoespecícas no-iónicas basada
en alcoholes lineales etoxilados propoxilados con
pequeñas cantidades de un compuesto aril etoxilado
y se le adiciona aceite isoparafínico.
Diseñoexperimental
Toxicidad subletal. En el estudio se evaluaron
concentraciones de Cosmoux 411F de: 0 (Tratamiento
0), 0.17 (Tratamiento 1), 0.34 (Tratamiento 2), 0.68
(Tratamiento 3), 1.36 (Tratamiento 4), y 2.72 mg/l
(Tratamiento 5). Los animales fueron sometidos
a dichas concentraciones por un periodo de 96 h
y fueron realizadas tres réplicas (n total = 126;
n tratamiento = 21). Las concentraciones subletales
se tomaron a partir de la concentración letal 50 y
sus pruebas piloto realizadas en el Laboratorio de
Bioensayos del IALL.
CL50(Concentraciónletal50).Las concentraciones
del experimento de determinación de la CL50 del
Cosmoux 411F a 96 h fue establecida con base
en una prueba piloto que arrojó un valor de CL50
de 4583 mg/l. Dicho valor fue tomado como base
para la determinación de las concentraciones
del surfactante a usar durante el bioensayo. Las
concentraciones utilizadas fueron las siguientes (en
orden ascendente del grupo 1 al 5): 0 (Tratamiento
0), 3000 (Tratamiento 1), 3450 (Tratamiento 2),
3900 (Tratamiento 3), 4350 (Tratamiento 4) y 4800
mg/l (Tratamiento 5). Se realizaron dos replicas,
incluyendo un grupo control sin exposición a la
sustancias experimental y se expusieron peces
diferentes a los usados para el ensayo de toxicidad
subletal, exponiendo 7 peces por acuario (n total =
84; n tratamiento = 14).
Determinación de CL50. El valor de CL50 se
determinó mediante el análisis de la mortalidad
a las 96 horas por medio del programa Trimmed
Spearman – Karber- TSK versión 1.0 (18).
Previo al periodo de aclimatación, para todos
los experimentos, los peces fueron sometidos a un
baño con cloruro de sodio (NaCl) industrial (no
yodado) al 1 %/60 min con el objetivo de eliminar
ectoparásitos de acuerdo con lo descrito por Francis-
Floyd (17).
Muestreodelospeces
Los animales fueron tranquilizados mediante
inmersión en agua fría a 5 °C/30 seg, para la
medición de la longitud estándar y pesaje con una
balanza digital Scout Pro 400 x 0.1 g. Al cabo de las
96 h de la fase experimental se registró la mortalidad
de cada tratamiento, y los peces sobrevivientes
fueron tranquilizados con agua fría como se describió
previamente. Dos peces sobrevivientes de cada
acuario (seleccionados al azar) fueron insensibilizados
mediante sección de la médula espinal, dorsal a los
opérculos. Además de estos dos ejemplares, a todos
los peces muertos durante la fase experimental se les
realizó la necropsia siguiendo el protocolo descrito
por Reimschuessel et al, (51). Para histopatología
se tomaron: estómago, intestino, hígado, riñón
caudal, piel y cerebro, y para branquias se tomó el
segundo arco branquial izquierdo. Las muestras
se jaron en formalina tamponada al 3.7 % para el
procesamiento histológico, embebidas en parana,
realizando cortes de 4–5 μm de grosor y tinción
con hematoxilina-eosina tradicional. La evaluación
histopatológica se realizó en un microscopio óptico
Nikon Eclipse 80i (Nikon Corporation, Japan) y se
fotograaron utilizando una cámara DS-5M (DS
Camera Head + DS Camera Control Unit DS-L1,
Nikon Corporation, Japan).
De la misma forma, los patrones de nado
fueron evaluados en los animales experimentales,
mediante observación directa.
Análisisestadístico
Los resultados de mortalidad se analizaron
tomando cada acuario como unidad experimental.
Las lesiones halladas al examen de necropsia fueron
descritas y expresadas en porcentaje de animales
afectados y las alteraciones histopatológicas de
acuerdo con el grado de severidad. Los parámetros
de calidad del agua se analizaron mediante ANOVA,
utilizando SPSS® para Windows versión 12 y son
expresados como promedio ± desviación estándar.

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Resultados
Ensayodetoxicidadsubletal
Las variables de temperatura (24.5 ± 1.2 °C),
oxígeno disuelto (7.2 ± 0.6 mg/l) y pH (7.13 ± 0.17)
del agua no mostraron variaciones signicativas
entre tratamientos durante el periodo de aclimatación
ni durante la fase experimental (p<0.05).
Comportamiento
En todos los tratamientos de exposición al
Cosmoux 411F se evidenciaron leves alteraciones
en el patrón de nado durante las 96 h del experimento
y fue posible observar movimiento aleatorio en
los tres tercios del acuario, algunos se describen
a continuación: a las 2 h del inicio de la fase
experimental, dos individuos del tratamiento 2 (0.34
mg/l) manifestaron episodios de nado explosivo. A
las 4 horas los individuos del tratamiento 1 (0.17 mg/
l) se mostraron pasivos comparados con los demás
tratamientos, incluyendo el grupo control. A las 8 h
los animales del tratamiento 3 (0.68 mg/l), tratamiento
4 (1.36 mg/l) y tratamiento 5 (2.72 mg/l) evidenciaron
quietud en el tercio inferior del acuario; por otra parte,
en el tratamiento 4 tres individuos mostraron quietud
en el tercio medio. En los tratamientos 3 y 4, aunque
presentaron movimientos aleatorios, la velocidad
del movimiento se redujo considerablemente. En el
tratamiento 4 a la 8ª hora, los animales permanecieron
en el tercio inferior de manera estática, sin embargo,
respondieron con prontitud al estímulo de amenaza
visual. A las 24 h los animales del tratamiento 5
manifestaron hiperactividad comparados con los
demás tratamientos.
Hallazgosdenecropsia
Tanto en el grupo control como en los
tratamientos en la exposición subletal no fueron
halladas alteraciones macroscópicas relevantes.
Histopatología
Los hallazgos histopatológicos aumentaron en
severidad con el aumento en la concentración del
tóxico:
Branquia: en el tratamiento 0 fue posible hallar
leve hiperplasia de células de moco, mientras en
los tratamientos 2-4 se observó posible observar
necrosis epitelial interlamelar basal y denudación
lamelar severa. En todos los tratamientos se
evidenciaron algunas formaciones quísticas por
myxosporidios en las lamelas.
Figura 1. Hígado Tratamiento 0. No se observan alteraciones
morfológicas del tejido. 40x. H-E
Hígado: el grupo control no evidenció
cambios morfológicos (véase Figura 1). En los
tratamientos 1-5 se encontró vacuolización lipídica
de los hepatocitos, cariorrexis evidente de algunos
hepatocitos acompañada de inltración de células
mononucleares (véase Figura 2). En el tratamiento 1
se halló anisocitosis de los hepatocitos, mientras en el
tratamiento 2 se observó picnosis de los hepatocitos.
Por otra parte el tratamiento 4 mostró congestión
severa y picnosis de algunos hepatocitos.
Figura 2. Hígado. Tratamiento 1. Pérdida de la densidad de los
hepatocitos, vacuolización leve generalizada asociada a cambio
graso (flecha), así como anisocitosis de los hepatocitos. 40x. H-E

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Estómago e intestino: el grupo control no
evidenció cambios morfológicos. En los tratamientos
1-5, tanto en el estómago como en el intestino se
hallaron hiperplasia moderada de células caliciformes
e inltrado de linfocitos y de células mononucleares
en la lámina propia. Por otra parte, en los tratamientos
2-5 en el intestino se observó hiperplasia moderada
de células caliciformes acompañada de vacuolización
moderada de enterocitos, de carácter generalizado
(véase Figura 3).
Riñón: el grupo control no evidenció cambios
morfológicos. En los tratamientos 1-5 se observaron
centros melanomacrófagos (CMMs) aumentados de
distribución multifocal, picnosis tubular así como
algunos quistes por myxosporidios y pérdida de la
densidad celular. En el tratamiento 4, por otra parte,
se observó degeneración leve de células epiteliales
tubulares y desprendimiento de las mismas.
Figura 3. Intestino medio. Tratamiento 3. Vacuolización moderada
de células epiteliales (flecha corta) e infiltración de células
mononucleares en la lamina propia y submucosa (flecha larga),
40x, H-E
Piel: el grupo control no evidenció cambios
morfológicos. En los tratamientos 1-5, se evidenció
inltración de células mononucleares en la dermis,
activación de células de alarma, hiperplasia de
células de moco y edema en la dermis observándose
separadas las bras de colágeno y presencia de
pigmentos en la dermis.
ConcentraciónLetal50(CL50)
La CL50 fue de 4417.99 mg/l. La mortalidad de
los diferentes tratamientos se registra en la tabla 1.
Tabla 1. Mortalidad CL50 a 96 horas
Tratamientos Control T1 T2 T3 T4 T5
Numero de animales
muertos n total = 84;
n tratamiento = 14 - - 7 1 7 8
Hallazgosdenecropsia
En el grupo control no fueron hallados signos
relevantes a excepción de una leve palidez en uno de
los animales. En el tratamiento 1 se evidenció una
coloración clara de la piel. En el hígado se observó
una coloración roja intensa en algunos animales
(2/14) mientras en otros animales (4/14) se halló un
hígado con coloraciones blanquecinas leves focales
circulares. Además, en algunos individuos (2/14)
se encontró el riñón pálido. El tratamiento 2 mostró
dos animales con palidez severa del hígado (2/14).
En el tratamiento 3 fue posible evidenciar en
branquias, acumulación de material blanquecino en el
tercio distal de los lamentos (14/14) (véase Figura 4).
El hígado, al igual que en el tratamiento I, evidenció
coloraciones blanquecinas leves más denidas y de
mayor extensión acompañada de palidez leve (7/14).
En este tratamiento se observó contenido gástrico
blanquecino (14/14) al igual que en el tratamiento
5 (14/14). En el tratamiento 4 se halló palidez
en el hígado así como presencia de coloraciones
blanquecinas difusas moderadas (2/14) al igual que
en el tratamiento 5 (14/14). Los animales también
presentaban residuos blanquecinos en el tercio distal de
los lamentos branquiales (12/14). En el tratamiento
5 se observaron residuos blanquecinos en el extremo
distal de los lamentos branquiales, así como cambios
en la coloración de la porción distal de los lamentos
branquiales compatibles con hemorragias (14/14).
Figura 4. Tratamiento 3. Acumulación de material blanquecino en
el extremo distal branquial (flecha).

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Histopatología para la CL50
La severidad de las lesiones histopatológicas
aumentó con el incremento en la concentración del
Cosmoux 411F.
Branquias: en el tratamiento 0, las branquias
presentaron hiperplasia leve lamental distal e
interlamental (véase Figura 5). En los tratamientos
1-5, en la región faríngea, se evidenció un aumento
del grosor de la mucosa, así como inltración
leve de células mononucleares acompañada de
inltración en la región interlamental (véase
Figura 6), en algunos ejemplares se hallaron quistes
de myxosporidios de severidad variable ocupando
una a varias lamelas, acompañados de focos de
hiperplasia leve. También se evidenciaron cambios
festoneados en la supercie celular, congestión, edemas
subepiteliales leves, inltraciones interlamentales
proximales, hiperplasia interlamental y activación
de células de cloro (véase Figura 7). En el tratamiento
3, la branquia mostró congestión y hemorragias
lamelares multifocales, rupturas de células pilar
acompañado de pequeños aneurismas en las lamelas
así como fusión lamelar con reacción inamatoria.
En los tratamientos 4 y 5 se evidenció hiperplasia
de células de moco y fusión lamelar severa (véanse
Figuras 8, 9 y 10).
Figura 5. Branquia. Tratamiento 0. Sólo se observa una hiperplasia
ligera en la región interfilamental (flecha). 40x H-E
Hígado: el grupo control no mostró lesiones
en el hígado. En los tratamientos 1-5 se
observó vacuolización lipídica de hepatocitos
acompañada de congestión leve. De la misma
manera, se observaron algunos focos quísticos
por myxosporidios en algunos ejemplares. En
los tratamientos 3-4 se observó anisocitosis de
hepatocitos, apoptosis y cariorrexis. En los tratamientos
4 y 5 se halló degeneración parenquimatosa de los
hepatocitos así como necrosis de coagulación.
Figura 6. Branquia. Tratamiento 1. Hiperplasia interfilamental
leve, cambios festoneados en la células epiteliales de las
lamelas branquiales. 40x. H-E.
Figura 7. Branquia. Tratamiento 1. Hiperplasia moderada de la
región interfilamental (flecha corta), cambios festoneados sobre
la superficie de las células epiteliales (flecha larga). 100x H-E.
Figura 8. Branquia. Tratamiento 4. Hiperplasia interlamelar severa
(Flecha), incluyendo células de moco, de tipo generalizada. 10x. H-E.

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Figura 9. Branquia. Tratamiento 4. Hiperplasia severa interlamelar
(flecha corta), e infiltración de células mononucleares (flecha
larga), pseudoepitelización incipiente. 40x. H-E.
Estómago e intestino: el grupo control no
evidenció lesiones. En los tratamientos 3-5, en el
estómago se halló congestión en los vasos de la
lámina propia y submucosa. Adicionalmente, se halló
congestión en serosas de los órganos digestivos,
cambios degenerativos en glándulas gástricas e
hiperplasia de células de moco. En los tratamientos
1-3, el intestino medio mostró vacuolizaciones leves
no generalizadas de los enterocitos en la región
apical. También fue posible hallar inltraciones de
células mononucleares en la lámina propia. En los
tratamientos 4 y 5 se halló inltración de células
mononucleares, aumento de la producción de moco,
necrosis de enterocitos y vacuolización leve de la
región apical de algunos enterocitos.
Cerebro: el grupo control no evidencio lesiones
(véase Figura 11). En la región anterior del encéfalo
correspondiente al telencéfalo, de los tratamientos
1-5 se hallaron inltración perivascular de CGE/
CM y células de la glía en la corteza, congestión en
meninges, plejos coroidales y vasos sanguíneos de
la región cortical y cuerpos de neuronas apoptóticas
(véase Figura 12).
Riñón: el grupo control no evidenció lesiones
o cambios compatibles con patologías. En los
tratamientos 1-2 se observó un aumento en la
presencia de CMMs (~15-20 %), de gran tamaño y
localizados principalmente en los túbulos y algunos
granulomas pequeños (lesión crónica nodular)
los cuales corresponden a respuestas a esporas de
myxosporidios. En el Tratamiento III se hallaron
CMMs grandes activados de manera multifocal
asociados a lesiones tubulares, así como asociados
a esporas de myxosporidios, necrosis tubular leve
y congestión vascular cortical. En el tratamiento 4
se presentó menor densidad de CMMs aun cuando
en mayor extensión que en los grupos anteriores,
áreas de necrosis de coagulación a nivel tubular
con inltración de células mononucleares y de
CGE/CM.
Figura 10. Branquia. Tratamiento 5. Hiperplasia interlamelar severa
generalizada, formación de estructura semiquísticas por alcance
de extremos distales de lamelas branquiales (flecha). 10x. H-E.
Figura 11. Cerebro. Tratamiento 0. Estructura normal del encéfalo,
porción craneal (telencefalo). 10x. H-E.
Figura 12. Cerebro. Tratamiento 3. Neuronas con granulaciones
hialinas (cabeza de flecha) y células granulares eosinofílicas
(flecha). 40x. H-E.

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Piel: el grupo control presentó normalidad en
la piel (véase Figura 13). En los tratamientos 1-5
se observó ligera hiperplasia de células de moco e
inltración de células mononucleares en el estrato
basal de la epidermis. En los tratamientos 3-5 se
halló engrosamiento de la epidermis, hiperplasia
de células pavimentosas y de moco, inltración
moderada de células mononucleares (véase Figura
14) y espongiosis leve.
Figura 13. Piel. Tratamiento 0. Tejido normal, se aprecia la
epidermis, delgada y regular. 40x. H-E.
Figura 14. Piel. Tratamiento 4. Hiperplasia severa de células de
moco (cabeza de flecha), acompañada de infiltración de células
mononucleares (flecha). 40x. H-E.
Discusión
La evaluación de los efectos de los surfactantes
sobre los organismos vivos, y en especial en
organismos acuáticos, ha sido de gran interés, dada
la alta tasa de descarga desde diversas fuentes,
así como por el desconocimiento de los efectos
reales de los mismos, debido a que su modo de
acción es amplio (gracias a su carácter anfílico y
a sus propiedades de solubilización de membranas,
disrupción endocrina, entre otras) (12, 31). Se debe
tener en cuenta que gran parte, sino la totalidad, de
los trabajos de investigación realizados acerca del
efecto de los surfactantes sobre cuerpos de agua
están descritos en países que poseen regulaciones
estrictas acerca de la descarga de sustancias (i.e.
detergentes, compuestos de amonio cuaternario,
etc) a cuerpos de agua; por lo cual los niveles
ambientales esperados son mucho mas bajos. De
esta manera, los estudios encaminados a evaluar
dichos efectos utilizan concentraciones mas bajas y
la evaluación es de carácter subletal y crónica.
En Colombia, la fumigación aérea se soporta en
estudios (61) en los cuales no es tomada en cuenta
la inclusión de un surfactante (Cosmoux 411F®)
en la mezcla de aspersión. Además, se desconoce la
estructura molecular del compuesto, bajo lo cual se
podría evaluar parcialmente la toxicidad, teniendo
en cuenta relaciones estructura/actividad descritas
para otros compuestos (38, 74).
Algunos autores argumentan que las
concentraciones nocivas para surfactantes no-iónicos,
con algunas excepciones, exceden 0.5 mg/l (28).
Además, se ha demostrado que los peces perciben
surfactantes a bajas concentraciones, evitando aguas
contaminadas incluso a 0.001 mg/l (62).
En el presente trabajo se observaron alteraciones
en el comportamiento y la actividad de nado a
la 4ª hora del inicio del ensayo, sin que estas
fueran conservadas a lo largo del experimento.
Dichas alteraciones, se pueden explicar por la
aclimatación al tóxico o como una consecuencia
del gasto energético que involucra el metabolismo
del mismo. No obstante, Abel y Skidmore (1), en
peces expuestos a laurilsulfato sódico, evidenciaron
un incremento inmediato en la actividad de nado
y episodios de tos. Hofer et al, (20) demostraron
disminución en la capacidad de nado de alevinos
de trucha arco iris expuestos a surfactantes. Así
mismo, algunos autores han descrito una secuencia
de cambios de comportamiento asociados con
la intoxicación: excitación, nado errático con
incremento en la frecuencia respiratoria, boqueo,
convulsión y muerte (25). Dichas alteraciones
en el comportamiento son relevantes debido a la

Rev Col Cienc Pec 2007; 20:431 - 446440
importancia en la conservación de la habilidad de
escape que determina gran parte de la supervivencia
de las especies en el medio natural.
Histopatología
Los hallazgos histopatológicos tanto para
el ensayo de toxicidad subletal como para la
determinación de CL50, son similares y de mayor
severidad a mayor concentración del Cosmoux
411F, por lo cual el análisis se plantea de forma
global, discerniendo acerca de las diferencias a
las que haya lugar. En las branquias las lesiones
interlamelares, tanto proliferativas como
inamatorias, han sido descritas ante la exposición
a otros surfactantes (1, 2, 60). El incremento en la
celularidad ha sido sugerido como una respuesta
adaptativa que reduce la difusión del toxico hacia
la sangre (41, 67). No obstante, dicha celularidad
implica un aumento en la distancia de difusión
del oxigeno al torrente sanguíneo, permitiendo
el desarrollo de hipoxia y estrés respiratorio (10,
32). La concentración crítica a la cual ocurre
la transición de respiración independiente a
dependiente es de 2 mg O2/l (a 30 °C) (56), dichos
niveles están por debajo de los registrados para este
ensayo. Por lo tanto, la hipoxia desarrollada en este
experimento puede deberse a una disminución en
la difusión de O2 debido a las lesiones ocasionadas
de forma directa por el surfactante y a los cambios
proliferativos del epitelio branquial. Estas respuestas
proliferativas generan deformación de las lamelas,
fusión lamelar y pseudoepitelización, lo cual ha sido
descrito en exposición a contaminantes (3, 5). Esta
respuesta adaptativa aumenta el espacio de difusión
de iones, oxigeno y del tóxico hacia la sangre.
El levantamiento de las células epiteliales
branquiales es similar a lo descrito en trabajos
anteriores en los cuales las células en sus estadios
nales de lesión comenzaron a levantarse (2, 5, 60).
Dicho proceso incrementa la barrera de difusión
agua-sangre, limitando igualmente la difusión del
tóxico hacia la sangre (60). El festoneamiento de las
células epiteliales ha sido descrito por otros autores
tras exposición a contaminantes (39) y puede ser
generado por la capacidad de los surfactantes no-
iónicos de solubilizar proteínas presentes en las
membranas celulares (11).
En este experimento se halló hiperplasia leve de
células compatibles con células de cloro, hiperplasia
leve de células de moco así como inltración de
CGE/CM, lo cual ha sido descrito de manera similar
ante exposición a otros contaminantes (3, 5, 25). Las
células de cloro proveen protección frente al estrés
osmorregularorio branquial (6, 44).
La proliferación de células de moco constituye
una respuesta adaptativa ante agentes irritantes
(3, 10, 55) y es desencadenada por niveles
elevados de cortisol (26). El estrato mucoso de
las branquias posee un papel de ionorregulación,
sin embargo su incremento limita la difusión de
iones, debido al aumento de la barrera de difusión
iónica (19, 55, 59).
Las CGE/CM han sido descritas en estrecha
asociación a las paredes de los capilares sanguíneos
(47) y muestran marcadas semejanzas con las células
mastocitos de mamíferos (46). La proliferación
de células mononucleares en los espacios
interlamelares ha sido descrita como reacción de
alarma frente a la exposición a surfactantes y otros
contaminantes (1-3). En este trabajo, de la misma
forma, no fueron evidenciables CGE/CM activas en
el lamento branquial descritas por otros autores
tras la exposición a surfactantes (1, 2).
La presencia de aneurismas y hemorragias
puede ser explicada porque gradualmente las
células pilar fueron distendidas y colapsaron,
dicho colapso progresa desde la región proximal
hacia la distal de la lamela, este fenómeno ha sido
descrito por otros autores (1). En dicho trabajo las
células pilares ocluyeron los espacios vasculares
y se presentó la formación de hematomas lo cual
fue evidente en este trabajo. Los eritrocitos aunque
enlagunados dentro del sistema pilar estuvieron
aparentemente connados dentro del epitelio
lamelar (1). Por otra parte, han sido descritos
cambios en los mecanismos de control adrenérgicos
y vasodilatación en branquias de salmón a
concentraciones de alkilbenceno sulfonato lineal
de 0.6 mg/l o mayores (28).
La lisis de células pilar así como la necrosis de
células epiteliales puede deberse a una acción toxica
del Cosmoux 411F por alteración de la membrana

Rev Col Cienc Pec 2007; 20:431 - 446 441
generando una pérdida de la función celular
(hipoxia asxia o falla osmorregulatoria) (32). Los
surfactantes son capaces de alterar el potencial
transepitelial branquial en ausencia de gradientes de
difusión, lo que sugiere un efecto inhibitorio directo
del transporte iónico electrogénico (63). Además,
los surfactantes no-iónicos así como los aniónicos
forman canales de conducción catiónica en bicapas
lipídicas (63) y generan desequilibrios iónicos
(por ujo de electrolitos a través de los mismos)
afectando el estatus ionorregulatorio del pez.
Las vacuolizaciones lipídicas en el hígado
evidenciadas en el presente trabajo, han sido
descritas en peces expuestos a otros contaminantes
(39, 42, 65) y representan una estrategia para
reducir la disponibilidad de xenobióticos lipofílicos.
Algunos autores explican dicha vacuolización
debido a la presencia de retículo endoplásmico
rugoso dilatado así como a cuerpos de mielina en
el citoplasma (39, 42). Además son compatibles
con la evidencia macroscópica de coloraciones
blanquecinas halladas.
En la piel, se halló en los tratamientos 2, 3
y 4, hiperplasia leve de células de moco y de
alarma así como CGE/CM inltradas; dicha
respuesta representa una reacción inamatoria
ante un agente irritante; el edema generado tras
los cambios vasculares inamatorios se evidenció
como espongiosis. Esta proliferación de CGE/CM
ha sido evidenciada en truchas arco iris expuestas
a agua ácida, en las cuales, además, se acumulan
macrófagos y linfocitos dentro de la epidermis (21)
y en peces expuestos a otros contaminantes (5, 8).
Además el moco que cubre la supercie epidermal
es la primera línea de defensa contra patógenos
invasores (15). Los surfactantes son capaces de
reducir el componente lipídico en las células de
moco, células epiteliales y células de alarma. Sin
embargo, la secreción de moco generada por el
surfactante no es suciente para contrarrestar, como
barrera, el efecto del mismo (53).
En el intestino la vacuolización de los
enterocitos fue mayor a medida que aumentaba
la concentración de Cosmoux 411F. Esta
vacuolización podría corresponder a surfactante
transportado (pinocitosis) por los enterocitos,
gracias a la lipolicidad del mismo que permite
atravesar las membranas celulares. El estrés generado
por la exposición a xenobióticos desencadena
degeneración de la mucosa intestinal y perturbación
de la función de barrera y mecanismos de absorción
(36, 57)
La presencia de CMM en el estroma renal se
vio incrementada de manera directa con el aumento
en la concentración del surfactante. La formación
leve de vacuolas o gotas proteicas (degeneración
hialina) en células epiteliales tubulares renales ha
sido descrita por otros autores (24, 49, 50), y podría
corresponder a la absorción de proteínas del ltrado
glomerular (23) o a sobrecarga en los lisosomas
tubulares proximales (48).
En el presente trabajo, la formación de
estructuras nodulares y la expresión de CMMs en
el riñón se vio incrementada con el aumento en la
concentración del Cosmoux 411F, evidenciando
una relación directa entre el nivel de respuesta de
depuración requerido y la presentación de áreas
de reacción a esporas de myxosporidios las cuales
son halladas de manera frecuente en ejemplares de
cachama blanca clínicamente sanos, de forma aislada,
sin que se presenten lesiones severas signicativas a
nivel renal (22). Los CMMs probablemente se han
acentuado en los grupos experimentales debido a
una subrregulación del sistema inmune lo cual puede
generar una disminución en los factores solubles
así como en la capacidad de respuesta celular. Estos
procesos están acorde con trabajos de otros autores
(54); gracias al efecto del estrés y la liberación de
corticoesteroides (4, 54, 71) por activación del eje
hipotálamo-hiposiario inter-renal (54).
En el sistema nervioso central fue posible
hallar lesiones en el telencéfalo, en estrecha
relación con el bulbo olfatorio, tales como
degeneración neuronal, cambios apoptóticos
neuronales, gliosis e inltración de CGE/CM
(satelitosis) tanto en las meninges como en la
supercie cerebral. Es de destacar que a nuestro
conocimiento, este es el primer reporte sobre este
tipo de hallazgos en exposición a surfactantes. El
daño en el epitelio olfatorio así como en el encéfalo
anterior, puede ocasionar alteraciones reproductivas
y de comportamiento grupal. La respuesta primaria

Rev Col Cienc Pec 2007; 20:431 - 446442
estaría generada a partir de las células de glía y
una posterior inltración de CGE/CM gracias a
la quimiotaxis generada, bien desde las células
neuronales en proceso de apoptosis y necrosis
así como de las células de glía. La interacción de
CGE/CM con neuronas puede ocurrir a través de
fenómenos de contacto celular (transgranulación)
como ha sido descrito en el sistema nervioso
central (73). El cerebro del pez se distingue de
los mamíferos por su habilidad para reemplazar
neuronas perdidas (76). La apoptosis evidenciada en
este trabajo puede ser resultado de un daño directo
del surfactante sobre las células nerviosas, por vía
hemática o por las narinas debido a la focalización
de la lesión en el área anterior del cerebro
(telencéfalo) y su relación con el sistema olfatorio;
y a la falta de una respuesta generalizada, la cual
estaría presente si el fenómeno se presentara por
vía hemática. Además, dada la remoción de detritos
generada por el sistema fagocítico mononuclear, se
puede estar generando, además de un efecto directo
sobre los somas neuronales, un imbalance en la
proporción destrucción/remoción:generación de
neuronas, como han descrito otros autores (27).
Las CGE/CM presentes en el encéfalo se
caracterizaron por la presencia de gotas hialinas
y gránulos de tamaño variable en relación con
las observadas en otros órganos (lamina propia
intestinal y branquias), este fenómeno puede deberse
a la inmadurez de CGE/CM que eventualmente
son incapaces de degranularse (35); sin embargo,
algunos autores describen que la maduración de
dichas células ocurre en el proceso de migración
por lo cual son efectivas en el sitio de acción,
gracias a cambios en el ambiente (70) y que los
gránulos son capaces de regenerarse (35). Por
otra parte, Pfeifer (45) sugirió que la apariencia
de CGE/CM en proceso de degranulación puede
corresponder a cuerpos multivesiculares. Las células
mastocitos (CGE/CM en peces) están en estrecha
asociación con estructuras mielinadas (47) y que las
interacciones entre neuronas y células mastocitos
se deben a estrés y en algunos casos a reacciones
de hipersensibilidad (76). Lewis (28) demostró que
la exposición a surfactantes posee efectos sobre
la siología de la olfación, y que dichos efectos
ocurrieron a concentraciones que excedieron los 0.1
mg/l en la mayoría de los casos (28, 64).
Tabla 2. CL50 para alcoholes etoxilados (lineales y ramificados) y nonilfenoles.
Especie Surfactante CL50 (mg/l) Duración
(horas) Referencia
Cachama blanca (Piaractus
brachypomus)Cosmoflux® 411F 4417.99 96 En el presente
trabajo
AE Ramificado
Pececillo cabeza gorda
(Pimephales promelas)C13EO7 4.5 96 (13)
Pez sol de branquias azules
(Lepomis macrochirus)
C11-15EO9
(alcohol secundario) 4.6 96 (30)
AE lineal
Pececillo cabeza gorda C12-13 EO6.5 1.3 (0.72-2.7) 96 (75)
Trucha arco iris C14-15 EO18 5.0-6.3 96 (66)
Trucha arco iris C14-15 EO11 1.08 96 (68)
Zebrafish (Brachydanio rerio) C12-15 EO7 1.0-2.0 96 (31)
Organismo Nonilfenoles
Pececillo cabeza de oveja
(Cyprinodon variegatus)- 0.142 96 (29)
Trucha arco iris
(salmo gairdneri)-5-6.05 24 (9)
4.12-5.35 96
Trucha arco iris
(Onchorrhynchus mykiss)- 0.221-0.270 96 (58)
Pez sol de branquias azules
(Lepomis macrochirus)- 0.209 96 (7)
Modificado de Madsen et al (31).

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Concentraciónletal50
El valor de CL50 (4417.99 mg/l) se encuentra
por encima del rango descrito para surfactantes
no-iónicos, incluyendo alcoholes etoxilados
(AE) como se muestra en la tabla 2. Debido al
desconocimiento de la estructura molecular del
Cosmoux 411F, los análisis acerca de la variación
de la toxicidad con respecto a otros surfactantes no-
iónicos, basados en relaciones estructura/actividad,
son difíciles de conjeturar. Dado el valor de CL50
tan alto se podría considerar cierta resistencia por
parte de la cachama blanca ante este xenobiótico.
Respecto a la baja mortalidad en el tratamiento 3,
no fue posible hallar una explicación, a parte de
una variación individual.
En conclusión, la piel, el hígado, las branquias,
el cerebro y en menor proporción el riñón y el
tracto digestivo, constituyen órganos afectados
morfológicamente por el Cosmoux 411F. Los
cambios en las branquias corresponden en su
mayoría a fenómenos adaptativos, en los cuales
a través de respuestas proliferativas y, en menor
proporción, inamatorias, se limita la difusión
del tóxico a la sangre, por incremento de la
barrera de difusión agua/sangre. Sin embargo,
algunos hallazgos tales como el festoneamiento
de células epiteliales branquiales, aneurismas,
entre otros, constituyen resultado del efecto toxico
del Cosmoux 411F. En el hígado se hallaron
cambios degenerativos posiblemente asociados al
metabolismo de los compuestos del Cosmoux
411F así como a los efectos directos del mismo
por alteración de la permeabilidad de la membrana.
En el intestino los efectos son de importancia
dada la vacuolización severa de los enterocitos,
lo cual puede afectar de manera considerable su
capacidad de absorción, gracias a cambios en su
permeabilidad. La piel desarrolla una respuesta
proliferativa de células de moco, debido a un posible
efecto irritativo del surfactante. En el cerebro los
surfactantes pueden generar lesiones signicativas,
dada la relación del área anterior del encéfalo con
la olfacción y las funciones intrínsecas asociadas a
la misma.
Aun cuando la CL50 de 4417.99 mg/l es alta
y se encuentra de manera poco probable en
ambientes naturales, el estudio de los efectos
de dicha concentración es de interés para el
entendimiento de la dinámica de los surfactantes a
nivel celular, así como de importancia biológica y
en salud pública. Además, se recomienda diseñar
trabajos encaminados a evaluar la susceptibilidad
de otras especies incluyendo plantas, macro y
microinvertebrados, encargados de la dinámica
poblacional acuática, permitiendo discernir el
efecto real en ecosistemas acuáticos. Igualmente,
deben realizarse ensayos subletales y crónicos, que
semejen la situación real de los cuerpos de agua
en condiciones de campo. Se aconseja dilucidar
la estructura molecular del Cosmoux 411F con
el n de mejorar la evaluación completa de sus
posibles efectos. De la misma forma se recomienda
profundizar sobre su acción en el sistema nervioso
central, así como en el papel de las CGE/CM en
relación con las lesiones descritas.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Instituto de Acuicultura
de los Llanos, IALL, así como al Instituto
Investigaciones de la Orinoquia Colombiana, IIOC
de la Universidad de los Llanos.
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