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Summa Phytopathol., Botucatu, v. 32, n. 3, p. 267-273, 2006 26 7
Metodologias de preparação de amostras de ferrugem para estudos morfológicos
de urediniósporos por meio de Microscopia Eletrônica de Varredura
Louise Larissa May-De Mio1, Quelmo Silva de Novaes2 e Eduardo Alves3
1 Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo – UFPR, Rua dos Funcionários 1540, 80035-050, Curitiba-PR, maydemio@ufpr.br
2 Departamento de Fitotecnia e Zootecnia – UESB, Caixa Postal 95, 45085-900, Vitória da Conquista, BA
3 Departamento de Fitopatologia – UFLA. Caixa postal 3037, 37200-000, Lavras-MG
Data de chegada: 23/06/2005. Aceito para publicação: 10/01/2006.
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ABSTRACT
Samples from Urediniospores of some rust fungi such as Melampsora
epitea, Melampsora medusae, Hemileia vastatrix, Uromyces
appendiculatum, Puccinia sorghi, Tranzschelia discolor and
Phakopsora euvitis respectively from Salix sp., Populus deltoides,
Coffea arabica, Phaseolus vulgaris, Zea mays, Prunus persicae and
Vitis vinifera, were processed by three different methodologies for
scanning electron microscopy (SEM) observations. These
methodologies were: a) conventional methodology (glutaraldehyde
and osmium tetroxide fixation, dehydrated in an acetone series, dried
in a critical point dryer and sputtered with gold); b) fixation using
osmium tetroxide vapor technique and sputtering with gold and c)
direct sputtered of the samples with gold (with free urediniospores).
May De Mio, L. L.; Novaes, Q. S; Alves E. Methodologies processed of some rusts fungi by scanning electron microscopy. Summa
Phytopathologica, v.32, n.3, p.267-273, 2006.
Also fractures of leaf sample frozen in liquid nitrogen were used to
observe details within the uredia from grape rust (P. euvitis). The
samples were observed in a scanning electron microscope (SEM)
LEO 435VP and the images were captured and recorded by using
the software LeoUserInterface and processed with Corel Photopaint
9.0 software. The dimension of the urediniospores was also
measured. Regardless of the technique the structure of the
urediniospores were very well preserved resulting in images of high
quality. However the technique of direct sputtering was more useful
and quick to see the urediniospores. The liquid nitrogen fractures
allowed a perfect observation from the interior of the grape rust
uredia.
RESUMO
Amostras de urediniósporos de ferrugens das espécies Melampsora
epitea Thum., Melampsora medusae Thuem., Hemileia vastatrix Berk.,
Uromyces appendiculatum Pers., Puccinia sorghi Schwein.,
Tranzschelia discolor Fuckel e Phakopsora euvitis Ono, coletadas
dos hospedeiros, chorão (Salix sp.), álamo (Populus deltoides Bartr.
Ex. Marsh), cafeeiro (Coffea arabica L.), feijoeiro (Phaseolus vulgaris
L.), milho (Zea mays L.), pessegueiro (Prunus persicae L.) e videira
(Vitis vinifera L.) respectivamente, foram processadas de 3 formas: a)
método convencional (fixação em glutaraldeído e tetróxido de ósmio,
desidratação em acetona e secagem ao ponto crítico); b) método do
vapor de ósmio e metalização com ouro; c) metalização direta de
amostras (utilizado para esporos soltos). A técnica de fratura de amostra
congelada em nitrogênio líquido também foi testada para o estudo do
interior de pústulas da ferrugem da videira (P. euvitis). As amostras
foram visualizadas em microscópio eletrônico de varredura no NAP/
MEPA da ESALQ/USP. Procedeu-se à mensuração dos esporos e as
imagens obtidas foram capturadas pelo software LeoUserInterface e
processadas utilizando-se o programa de computador “Corel Draw”.
Em todos os métodos analisados obteve-se uma boa preservação da
estrutura possibilitando imagens de alta qualidade. No entanto, para
esporos livres (mantidos em cápsula de gelatina) o método da
metalização direta foi mais prático e rápido. Para observação das
pústulas em tecido vegetal os dois métodos de processamento de
amostras avaliados proporcionaram resultados satisfatórios. A técnica
de fratura em nitrogênio líquido também permitiu perfeita visualização
do interior das pústulas da ferrugem da videira.
May-De Mio, L. L.; Novaes, Q. S; Alves E. Estudo morfológico de urediniósporos de fungos causadores de ferrugem por meio de Microscopia
Eletrônica de Varredura – Avaliação de metodologias de preparação. Summa Phytopathologica, v.32, n.3, p.267-273, 2006.
Keywords: Melampsora epitea, Phakopsora euvitis, Melampsora medusae, Hemileia vastatrix, Uromyces appendiculatum, Puccinia sorghi and
Tranzschelia discolor
Palavras-chave adicionais: Melampsora epitea, Phakopsora euvitis, Melampsora medusae, Hemileia vastatrix, Uromyces appendiculatum,
Puccinia sorghi e Tranzschelia discolor
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INTRODUÇÃO
A microscopia eletrônica de varredura (MEV) tem se mostrado,
cada vez mais, uma importante ferramenta para estudo de
caracteres morfológicos em fungos de diferentes espécies. A
morfometria das estruturas é extremamente facilitada utilizando-
se a MEV, pois esta técnica permite maior segurança e precisão
dos resultados. A MEV também tem sido utilizada para
demonstração de estruturas fúngicas modificadas em
decorrência dos diversos eventos que ocorrem durante a
interação fungo-planta, além de ser uma ferramenta chave na
classificação de fungos da ordem uredinales. As imagens de
paráfises, urediniósporos, teliósporos e outras estruturas
geradas são de grande importância para a correta taxonomia
desta ordem de fungos. Como exemplos, temos o trabalho de
Rezende & Dianese (11) que utilizaram esta técnica como
ferramenta para realizarem uma revisão taxonômica das espécies
de Ravenelia em leguminosas do cerrado brasileiro, os livros
de Cummins & Hiratsuka (1) e Littlefild & Health (6) que utilizaram
várias eletromicrografias de varredura para ilustrar gêneros e
ultraestruturas de espécies de ferrugens, respectivamente.
Na interação dos fungos causadores de ferrugem com
plantas, a MEV tem se mostrado extremamente útil. Os eventos
iniciais da infecção por urediniosporos de Puccinia sorghi
Schwein. em milho foram revelados por Hughes & Rijkenberg
(3). Mims et al. (7) também empregaram a MEV para estudar a
forma dos haustórios de Frommeela mexicana var. indicae
Mcclain & Hennen em Duchesnea indica (Anb.)Focke. Hu &
Rijkenbeng (2) observaram através da MEV diferenças na
morfologia do peg de penetração de Puccinia recondita Rob ex
Desm.f.sp. tritici Eriks em linhagens de trigo suscetíveis e
resistentes, inoculadas com urediniósporos do referido fungo.
Entretanto, a maioria dos trabalhos da literatura relata o
uso de MEV pelo método convencional ou pelo uso da
criofratura com observação direta da amostra. No primeiro caso,
apesar de se ter excelentes resultados com amostras em folhas,
o método é trabalhoso e demorado e no segundo caso, são
necessários equipamentos complementares que muitas vezes
não estão disponíveis nas Universidades e Centros de
Pesquisas brasileiros. Desta forma, o presente buscou comparar
alguns métodos alternativos de processamento de amostras,
bem como, caracterizar alguns aspectos da morfologia de
urediniósporos das espécies de ferrugens estudadas.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras. Urediniósporos de ferrugens das espécies Melampsora
epitea Thuem., Melampsora medusae Thuem., Hemileia vastatrix
Berk, Uromyces appendiculatum Pers., Puccinia sorghi Schuen.
e Tranzschelia discolor Fuckel, coletadas dos hospedeiros, chorão
(Salix sp.), álamo (Populus deltoides Batl. ex Marsh.), cafeeiro
(Coffea arábica L.), feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), milho (Zea
mays L.) e pessegueiro (Prunus persicae l.), respectivamente, foram
processadas de 3 formas: a) método convencional (fixação em
glutaraldeído e tetróxido de ósmio, desidratação em acetona e
secagem ao ponto crítico); b) método do vapor de ósmio e
metalização com ouro; c) metalização direta de amostras (utilizados
para esporos soltos). A técnica de corte em nitrogênio líquido
também foi testada para o estudo do interior de pústulas da ferrugem
da videira (Phakopsora euvitis Ono).
Processamento de amostras pelo método convencional.
Amostras de Melampsora epitea em folha de chorão e
Phakopsora euvitis em folhas de videira e urediniósporos de
Melampsora medusae em membrana de diálise e em papel de
seda e Tranzschelia discolor em folha de nectarina foram
processadas seguindo as seguintes etapas :a) Fixação com
aldeído: foi usado o fixador Karnovksy modificado –
(glutaraldeído 2,5%, formaldeído 2,5% em tampão cacodilato de
sódio 0,05M CaCl2 0,001M, pH 7,2. A amostra ficou submersa
nesta solução durante 5 horas na geladeira, sendo utilizado um
volume de fixador 10 vezes maior do que o volume da amostra;
b) pós-fixação com tetróxido de ósmio (OsO4 a 1%): as amostras
pré-fixadas com aldeído foram lavadas (3 passagens
consecutivas de cerca de 10 minutos cada em tampão cacodilato
0,05M pH 7,2 e deixadas por mais 1 hora em solução de OsO4
(1%), a temperatura ambiente em uma capela; c) desidratação:
decorrido o tempo de uma hora as amostras fixadas em OsO4
foram lavadas em água destilada e a seguir passaram por
concentrações crescentes de acetona (30, 50, 70, 90 e 100%)
permanecendo cerca de 10 minutos em cada uma. Na solução
de 100% foi passada por três vezes consecutivas e ali
permaneceram até serem levadas ao aparelho de secagem ao
ponto crítico; d) as amostras foram levadas ao aparelho de
secagem ao ponto crítico (CPD 050 da Balzers) onde sofreram
vários banhos com CO2 até chegar ao ponto ideal de secagem e
em seguida; e) foram montadas em “stubs” de alumínio e levadas
ao metalizador (MED 010 da Balzers) onde receberam um banho
de vapor de ouro por 180 segundos(5).
Processamento de amostras pelo método do vapor de ósmio.
Amostras de Melampsora epitea em folha de chorão,
urediniósporos de Melampsora medusae em membrana de diálise
e em papel de seda, Puccinia sorghi em folha de milho e Hemileia
vastatrix em folha de café foram processadas seguindo o
protocolo do método desenvolvido para preparo de fungos
crescidos em ágar descrito por Quattlebaun & Carner (9) e King
& Brown (4) com algumas modificações. As amostras foram
colocadas em placa de Petri grande (diâmetro 15 cm) contendo
papel de filtro umedecido e um vidro de relógio contendo uma
solução de ósmio 2% + cacodilato 0,1M (volume/volume). As
amostras permaneceram nesta placa fechada com papel alumínio
em capela de exaustão por 12 horas. Decorrido este tempo, a
solução do vidro de relógio foi substituída por ósmio 2% puro
onde permaneceram por mais 5 horas. Após o término deste
período as amostras foram deixadas para secar ao ambiente por
30 minutos e em seguida foram metalizadas da mesma forma
como descrito no item anterior.
Metalização direta de amostras. Esporos livres de ferrugem
(M. medusae do álamo, U. appendiculatum de feijão e T. discolor
de pessegueiro) mantidos em cápsula de gelatina em congelador,
foram delicadamente colocados sobre fita adesiva dupla face
de carbono, fixadas nos “stubs” e em seguida foram metalizados.
Corte das amostras de ferrugem da videira em nitrogênio
líquido. Para esta metodologia foi utilizada a técnica descrita
por Tenaka e Nagaya, (14) modificada conforme segue: amostras
de folhas de videira com pústulas de ferrugem, depois de
coletadas, foram imersos em solução fixativa (Karnovksy
modificado), pH 7,2 por um período de 24 h. Em seguida, foram
transferidas para líquido crio-protetor (glicerol 30%) por 30 min
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imersas em nitrogênio líquido e fraturadas. As secções obtidas
foram transferidas para uma solução de tetróxido de ósmio 1%
em água por 1 hora e subseqüentemente desidratadas em uma
série de acetona (30, 50, 70, 90 e 100% por três vezes) e depois
levadas para o aparelho de secagem ao ponto crítico. Os
espécimes obtidos foram montados em “stubs” utilizando fita
de carbono dupla face colocada sobre uma película de papel
alumínio e cobertos com ouro.
Obtenção de imagens no MEV e preparação das mesmas para
publicação. As amostras foram visualizadas em microscópio
eletrônico de varredura LEO 435 VP no NAP/MEPA da ESALQ/
USP, a aumentos variáveis. As condições de trabalho foram de
20 Kv e distância de trabalho de 9 mm, mensurações, quando
necessárias foram feitas diretamente no monitor, usando o
software do fabricante (LEO) . As imagens geradas foram
gravadas e abertas no Software Photopaint, trabalhadas
principalmente nos itens coloração, brilho, intensidade,
contraste e “gamma”. Em seguida as imagens foram transferidas
para o programa Corel Draw 9, onde foram preparadas as
pranchas apresentadas neste trabalho.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Comparação entre os métodos de preparação.
Em todos os métodos analisados obteve-se uma boa
preservação da estrutura possibilitando imagens de alta
qualidade (Figuras 1, 2, 3 e 4). No entanto, para esporos livres
(mantidos em cápsula de gelatina) o método da metalização
direta foi mais prático e rápido. Smith et al. (13) utilizaram este
método para a visualização de M. epitea, porém neste estudo o
material depois de metalizado foi observado a baixo vácuo e não a
Figura 1. Eletromicrografia de varredura de: A) Pústula de M. epitea em chorão, B) Pústula de M. medusae em álamo C) Detalhe da pústula de
M. medusae mostrando as paráfises (ponta de seta) e do urediniósporos (seta), D) Detalhe da pústula de M. epitea em chorão rompendo a cutícula
e mostrando as paráfises (cabeça de seta) e do urediniósporos (seta).
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alto vácuo como no presente trabalho. A eficiência do método se
explica para o caso dos urediniósporos pelo fato de que estes
apresentam paredes espessas que permitem suportar melhor o
efeito do alto vácuo e dos feixes de elétrons sobre a amostra.
Para observação das pústulas em tecido vegetal, o
método convencional e o de vapor de ósmio proporcionaram
resultados satisfatórios. Entretanto, deve se considerar que o
método do vapor de ósmio é mais rápido e permite conservar
todas as características das amostras que poderiam ser afetadas
pela imersão da mesma em solução fixativa. Um fator que deve
ser considerado na utilização deste método é que o material
depois de preparado deve ser observado rapidamente para não
perder suas características.
A utilização de membrana de diálise e de papel de seda para
envolver os urediniósporos de ferrugens mostrou-se altamente
eficiente mantendo as estruturas intactas para a visualização.
Figura 2.A,B e C) Urediniósporos de M. medusae (A e B- preparados pelo método direto, C preparado pelo método convencional), D)
urediniósporos da ferrugem da videira P. euvitis preparados pelo método convencional.
Obtenção de imagens do MEV e melhoramento com a utilização
do programa “Corel Draw”.
Todas as imagens geradas ao MEV ficaram nítidas sendo
possível visualizar aspectos importantes das ornamentações
dos esporos e da forma como as pústulas estavam inseridas no
tecido vegetal (Figura 1).
Foram feitas algumas imagens de urediniósporos
individualizadas para evidenciar características morfológicas
de cada espécie (Figura 2). Além disso, foram feitas imagens
com aspectos de vários urediniósporos agregados comparando
métodos de preparação entre as espécies (Figura 2) e na mesma
espécie (Figuras 2B e 2C).
Diferenças entre os urediniósporos (ornamentação, tamanho
e forma).
Os esporos variaram em relação às ornamentações. Por
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Figura 3. A) T. discolor preparado pelo método convencional B) U. appendiculatum em pêssego, método de metalização direta, C) M. medusae
em álamo, método convencional, D) P. sorghi em milho, método do vapor de ósmio, E) H. vastatrix em café método do vapor de ósmio, F) M.
medusae em álamo, método do vapor de ósmio
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Figura 4. Eletromicrografias de varredura de amostras congeladas no nitrogênio líquido e fraturadas mostrando: A) corte transversal de uma
uredia em folha de videira colonizada por Phakopsora euvitis. Pode se observar as P = paráfises, U – urediniósporos, as células mães dos
urediniósporos junto à desorganização do tecido da folhas abaixo da uredia. B) Detalhes das hifas (H) de P. euvitis desenvolvendo entre as células
(C) do parênquima esponjoso foliar.
exemplo, urediniósporos de M. epitea e P. sorghi apresentaram
parede totalmente ornamentada, enquanto outros, como M.
medusae, U. appendiculatum, H. vastatrix e T. discolor
revelaram falhas na ornamentação em diferentes partes. Por
exemplo, em M. medusae observou-se ausência de ornamentação
na parte intermediária do esporo (Figura 3 C), em U.
appendiculatum a falha é no hilo (Figura 3 B). Em H. vastatrix
observou-se toda uma metade do esporo sem ornamentação (1)
(Figura 3 E). Por fim, em T. discolor, a falha ocorre na parte
superior do esporo (Figuras 3 A). Tais características observadas
são importantes e até fundamentais para a identificação
taxonômica das referidas espécies. Outra característica
diferenciadora para fungos do gênero Melampsora visível com
clareza nos materiais processados pelos três métodos foi a
densidade das ornamentações. Apesar desta não ter sido
quantificada neste estudo como fez Smith et al. (13), se
necessário, isto poderia ser facilmente feito. M. medusae é
separada das demais espécies do gênero por possuir paráfises
uniformes com ápices globosos e urediniósporos com falta de
ornamentação em uma larga região equatorial do esporo (16).
(Fig. 1C; 2 A-C; 3C,F).
Foram também obtidos dados referentes ao comprimento
dos urediniósporos através da análise das imagens. O
comprimento variou entre as espécies analisadas: M. epitea
apresentou comprimento médio de 17,6 µm; M. medusae de 36,0
µm e P. sorghi 22,2 µm. Para M. epitea, Smith et al. (13) encontrou
medidas para o comprimento variando de 18,79 µm (± 2,51) a
25,13 µm (± 2,62). Estes valores são um pouco maiores do que
os observados aqui, possivelmente em função do hospedeiro e
devido às condições climáticas da região Sul onde foram
coletadas as amostras. Para M. medusae Newcombe et al. (8)
nos EUA encontrou um comprimento médio de 28 µm um pouco
menor que o observado neste estudo. Ruaro & May (12) no
Brasil obtiveram urediniósporos de M. medusae com tamanho
variando de 20 – 38 de comprimento e 13 - 21 µm de largura,
limites próximos aos obtidos anteriormente por Walker, (16) e
Trench et al.(15). Para M. medusae variações no tamanho devido
ao hospedeiro e a região também são possíveis (8). Outro fator
que poderia justificar até certo ponto as diferenças é o fato de
que nos estudos referidos acima as medidas foram obtidas em
microscópio de luz, enquanto que neste estudo, as medidas
foram realizadas em MEV, o que permite maior precisão nos
resultados. Para P. sorghi o comprimento dos urediniósporos
estão dentro dos descritos por Reis & Casa (10) como
característicos da espécie.
Amostras de ferrugem da videira em nitrogênio líquido.
A técnica da fratura de peças congeladas em nitrogênio
líquido também permitiu perfeita visualização do interior das
pústulas da ferrugem da videira Phakopsora euvitis,
possibilitando visualizar as paráfises. Observou-se também uma
desorganização total do tecido do parênquima esponjoso e o
crescimento intercelular das hifas (Figura 4). Em relação ao corte
do tecido com lâminas foram obtidas imagens com uma melhor
qualidade e com superfícies limpas o que, no caso das ferrugens,
é de extrema importância para o estudo da formação de
haustórios, de teliósporos e urediniósporos. Em relação ao
simples corte com lâminas esta técnica apresentou grandes
vantagens por permitir o estudo do interior das células com
grande facilidade, comparada à crio-técnica se mostrou bem
mais barata não exigindo nenhum investimento em
equipamentos, geralmente caros.
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