Decrease in the astrocytic expression of glial fibrillary acidic protein in dogs treated with dexamethasone

Abstract

Glial fibrillary acidic protein (GFAP) is the most important marker of astrocytes, that are the major glial cells in the nervous tissue and exhibit receptors to several steroid hormones, which have an apparent influence in their genic expression. The aim of this study was to evaluate if dexamethasone (DX) administration in therapeutic protocols to dogs would be capable of affecting the astrocytic expression of the protein. Samples from the pons and the spinal cord of dogs, treated (n=6) or not (n=6) with DX, were submitted to GFAP immunohistochemical staining and astrocytic reactivity was determined by colorimetry in a computer system for image analysis. Difference statistically significant was noted for the mean areas stained with GFAP in the pons of dogs treated and non-treated with DX, as well as in the spinal cord of dogs which previously received or not DX, with clear tendency of drug-induced reduction in the astrocyte expression of this protein. GFAP expression in the spinal cord was greater than in the pons, regardless the use of DX or not.

Full text

Redução da expressão astrocitária de proteína glial fi brilar ácida em cães tratados
com dexametasona
Decrease in the astrocytic expression of glial fi brillary acidic protein in dogs treated with
dexamethasone
Eduardo Fernandes BondanI,II* Rogério Loesch ZacariottiII
Maria de Fátima Monteiro MartinsI,II Flávio Cesar VianiII
ISSN 0103-8478
Recebido 20.12.11 Aprovado 05.09.12 Devolvido pelo autor 01.12.12
CR-6520
Ciência Rural, Santa Maria, v.43, n.3, p.485-488, mar, 2013
RESUMO
A proteína glial fi brilar ácida (GFAP) constitui
o principal marcador dos astrócitos, as células gliais mais
numerosas do tecido nervoso e que exibem receptores a diversos
hormônios esteroidais, os quais exercem aparente infl uência
sobre a expressão gênica das mesmas. O objetivo do presente
estudo foi o de avaliar se a administração de dexametasona
(DX) em protocolos terapêuticos para cães seria capaz de afetar
a expressão astrocitária dessa proteína. Para tal, amostras da
ponte e da medula espinhal torácica de cães, tratados (n=6)
ou não (n=6) com DX, foram submetidas à marcação imuno-
histoquímica para a GFAP e a reatividade astrocitária foi
determinada por colorimetria em um sistema computacional de
análise de imagens. Diferença estatisticamente signifi cativa foi
constatada para as médias das áreas marcadas para GFAP na
ponte de cães tratados e não-tratados com DX, assim como na
medula espinhal torácica dos que haviam recebido previamente
o corticoide ou não, com clara tendência, induzida pela droga,
de redução da expressão astrocitária da proteína. Além disso, a
expressão de GFAP na medula espinhal foi maior que na ponte,
independentemente do emprego de DX ou não.
Palavras-chave: astrócitos, cães, corticoide, dexametasona, GFAP,
imuno-histoquímica.
ABSTRACT
Glial fi brillary acidic protein (GFAP) is the most
important marker of astrocytes, that are the major glial cells in the
nervous tissue and exhibit receptors to several steroid hormones,
which have an apparent infl uence in their genic expression.
The aim of this study was to evaluate if dexamethasone (DX)
administration in therapeutic protocols to dogs would be capable
of affecting the astrocytic expression of the protein. Samples
from the pons and the spinal cord of dogs, treated (n=6) or not
(n=6) with DX, were submitted to GFAP immunohistochemical
staining and astrocytic reactivity was determined by colorimetry
in a computer system for image analysis. Difference statistically
signifi cant was noted for the mean areas stained with GFAP in
the pons of dogs treated and non-treated with DX, as well as in
the spinal cord of dogs which previously received or not DX,
with clear tendency of drug-induced reduction in the astrocyte
expression of this protein. GFAP expression in the spinal cord was
greater than in the pons, regardless the use of DX or not.
Key words: astrocytes, corticoid, dexamethasone, dogs, GFAP,
immunohistochemistry.
Modifi cações na estrutura química
do glicocorticoide cortisol acabaram por gerar
corticosteroides sintéticos, tais como a dexametasona
(DX), considerada 30 vezes mais potente que o
cortisol quanto a sua potência anti-infl amatória,
embora com diminuição de seus possíveis
efeitos mineralocorticoides. As propriedades
anti-infl amatórias e imunomoduladoras da DX
são amplamente aproveitadas na clínica médica
veterinária e o fármaco é empregado em uma grande
variedade de condições patológicas (GUILPAIN &
LE JEUNNE, 2012).
Os glicocorticoides difundem-se em quase
todas as células e ligam-se no citoplasma a proteínas
receptoras para regular a expressão de genes
responsivos a corticoides. Determinam modifi cação
- NOTA -
IPrograma de Pós-graduação em Patologia Ambiental e Experimental, Universidade Paulista (UNIP), São Paulo, SP, Brasil.
IICurso de Medicina Veterinária, Universidade Cruzeiro do Sul. *Endereço para correspondência: Rua Caconde, 125/51, 01425-011, São
Paulo, SP, Brasil. E-mail: bondan@uol.com.br.

486 Bondan et al.
Ciência Rural, v.43, n.3, mar, 2013.
conformacional nos receptores e sua translocação ao
núcleo, onde ativam a transcrição gênica. O mRNA
resultante, então, ativa no citoplasma a síntese de
proteínas específi cas e peptídeos reguladores que
controlam a função celular. Embora geralmente haja
aumento na expressão de genes-alvo, os corticoides
podem diminuir a transcrição desses genes, como
ocorre com algumas citocinas, cuja regulação
inibitória tem importante papel nas ações anti-
infl amatórias e imunossupressoras dos corticoides
(GUILPAIN & LE JEUNNE, 2012).
Os hormônios esteroides são capazes de
afetar um amplo espectro de funções neurais, já que
facilmente atravessam a barreira hematoencefálica
e transmitem informação a neurônios e células
gliais no sistema nervoso central (SNC). Tem sido
demonstrado que astrócitos e oligodendrócitos
possuem receptores intracelulares clássicos para
muitas famílias de hormônios esteroidais, tais como
glicocorticoides, mineralocorticoides, andrógenos,
estrógenos e progesterona (MELCANGI et al., 2001).
A proteína glial fi brilar ácida (GFAP)
constitui o principal componente estrutural dos
astrócitos de indivíduos adultos (MONTGOMERY,
1994; SOFRONIEW & VINTERS, 2010), sendo a
imuno-histoquímica o principal método utilizado
na identifi cação da expressão dessa proteína, que é
relativamente específi ca para a população astrocitária.
Uma vez que os corticosteroides são
capazes de modifi car a expressão gênica de várias
proteínas gliais in vitro e in vivo em roedores sob
condições experimentais, este estudo tem por objetivo
identifi car se a administração terapêutica de anti-
infl amatórios esteroidais em cães é também capaz
de promover modifi cações detectáveis na expressão
astrocitária da proteína GFAP.
Foram utilizadas amostras de tecido
nervoso, obtidas da ponte e do 1o segmento da
medula espinhal torácica (T1), de 12 cães que vieram
a óbito por diferentes causas, pertencentes a distintas
raças, idades e sexos e que se adequavam a critérios
de preservação tecidual previamente determinados.
Destes, seis haviam sido tratados com DX nos últimos
15 dias (com doses variáveis de 1 a 3mg kg-1, por via
intramuscular a intervalos regulares de 4-6 horas,
por um período máximo de sete dias) e seis eram
cães clinicamente sadios, sem lesões observáveis no
SNC e sem qualquer administração de fármacos nos
últimos 15 dias.
Após prévia fi xação em formol tamponado a
10% por período sempre inferior a sete dias, as amostras
colhidas foram incluídas em parafi na e submetidas à
marcação imuno-histoquímica da GFAP pelo método
indireto do complexo avidina-biotina-peroxidase
(ABC). Cortes histológicos de 5µm de espessura foram
inicialmente corados com hematoxilina-eosina (HE)
para avaliação da integridade do tecido nervoso na
amostra. Descartada a presença de qualquer possível
alteração histopatológica, cortes histológicos foram
feitos em lâminas silanizadas. A marcação da proteína
glial seguiu o método utilizado por ORSINI et al.
(2007) em seu estudo com cães. Os cortes colhidos em
lâminas silanizadas foram desparafi nizados em xilol e
hidratados em uma sequência decrescente de etanóis.
Foram, então, incubados durante 24 horas, a 4ºC, com
anticorpo primário policlonal anti-GFAP (rabbit anti-
cow GFAP, ZO334, Dako), padronizado na diluição
1:1000. Posteriormente, foram incubados por uma
hora com o anticorpo secundário biotinilado anti-
imunoglobulinas de camundongo (Novostain Super
ABC Kit, Novocastra), na diluição 1:100, e, após,
com o conjugado estreptavidina-biotina-peroxidase
(Novostain Super ABC Kit, Novocastra) por mais
uma hora. A imunorreatividade foi visualizada pela
aplicação sobre os cortes de diaminobenzidina (DAB,
Sigma) a 0,1% como cromógeno e peróxido de
hidrogênio a 0,5%. Os cortes foram contracorados com
hematoxilina, desidratados, diafanizados e montados
com resina sintética sob lamínula. Todas as reações
foram acompanhadas por lâminas de controle negativo,
submetidas a todas as etapas do procedimento, exceto
à aplicação do anticorpo primário.
Áreas de 302.952,5µm2 dos cortes
submetidos à prova imuno-histoquímica foram
analisadas em microscópio de luz (com objetiva de
10x), para avaliação da imunorreatividade das células
marcadas para GFAP. A reatividade astrocitária
foi determinada por colorimetria em um sistema
computacional de análise de imagens, o Image
Pro-Plus 4.5 (Media Cybernetics, Silver Spring,
EUA), quantifi cando, em µm2, a área marcada em
castanho contida na área total de 302.952,5µm2. Os
resultados numéricos foram submetidos à análise
estatística, utilizando-se os testes de Wilcoxon e de
Mann-Whitney, respectivamente, para as amostras
pareadas e não-pareadas e adotando-se um nível de
signifi cância de 5%.
Diferença estatisticamente signifi cativa foi
constatada para as médias das áreas marcadas para GFAP
(Tabela 1) na ponte de cães tratados (6219,21±1084,56)
e não-tratados com DX (8682,73±527,73) (P≤0,05),
assim como na medula espinhal torácica dos
que haviam recebido previamente o corticoide
(7674,91±1028,09) ou não (11620,85±1544,25)
(P≤0,05), com clara tendência, induzida pela droga,
de redução da expressão astrocitária da proteína. Foi

Redução da expressão astrocitária de proteína glial fi brilar ácida em cães tratados com dexametasona.
Ciência Rural, v.43, n.3, mar, 2013.
487
também observada diferença signifi cativa (P≤0,05) na
expressão de GFAP entre as duas regiões analisadas
(ponte x medula espinhal), sendo maior na medula
espinhal do que na ponte, tanto no grupo tratado com
DX quanto no não-tratado.
Os resultados correlacionando o uso de
corticoides e a resposta astrocitária são controversos.
Os glicocorticoides são conhecidos por modularem
a expressão de uma variedade de proteínas gliais,
incluindo GFAP, glutamina sintetase, proteína básica da
mielina (MBP) e glicerol-fosfato desidrogenase (JUNG-
TESTAS et al., 1994; CHENG & de VELLIS, 2000).
De forma semelhante à encontrada em
nosso estudo, tratamentos in vivo com corticosterona
e outros corticoides, como DX, revelaram inibir a
expressão de GFAP no encéfalo de ratos neonatos
e adultos. Já a adrenalectomia mostrou aumentar
os níveis de mRNA e da proteína GFAP, o que foi
posteriormente revertido com a administração de
corticosterona (O´CALLAGHAN et al., 1991;
MELCANGI et al., 2001).
No entanto, um padrão distinto de
atividade foi encontrado com a corticosterona in vitro,
já que a exposição de astrócitos em cultivo a este
esteroide foi capaz de induzir uma resposta contrária,
de aumento no mRNA e na própria proteína GFAP.
Surpreendentemente, este efeito da corticosterona era
revertido se os astrócitos fossem co-cultivados com
neurônios (MELCANGI et al., 2001), um achado que
sugere uma complexa interação entre os dois tipos
celulares e fornece uma explicação plausível para os
resultados discrepantes in vivo e in vitro.
Ainda em astrócitos, demonstrou-se que a
metilprednisolona e a DX aumentaram os níveis de
cálcio citossólico, bem como de glutamina sintetase
e glutamina desidrogenase, ambas importantes
no metabolismo do glutamato em tais células
(MELCANGI et al., 2001), assim demonstrando que
a expressão de muitas outras proteínas astrocitárias,
além da GFAP, pode ser modulada pela administração
de corticoides. Este fato sinaliza que os corticoides
podem exercer amplos efeitos morfológicos
e funcionais não só em células da linhagem
astrocitária, mas também, de forma indireta, sobre
a atividade neuronal via modulação da ação de
neurotransmissores, como o glutamato, o qual é
normalmente captado e removido do microambiente
neuronal pela ação astrocitária (SOFRONIEW &
VINTERS, 2010).
O´CALLAGHAN et al. (1991) observaram
que a administração de corticosterona por cinco dias
a quatro meses reduziu em 20 a 40% a expressão de
GFAP no hipocampo, mesencéfalo e córtex cerebral
de ratos. A adrenalectomia, por sua vez, resultou
num aumento da expressão dessa proteína a partir
do 12o dia pós-cirurgia e persistindo por até quatro
meses, elevação esta revertida pela subsequente
administração de corticosterona nos ratos previamente
adrenalectomizados.
Segundo ALONSO (2000), os
glicocorticoides foram capazes de inibir a proliferação
de células progenitoras de oligodendrócitos (células
NG2+) em várias regiões da substância branca e
cinzenta do SNC de ratos adultos. Uma vez que a
proliferação de tais células desempenha um papel
fundamental no processo de remielinização, esses
resultados levantam a possibilidade de efeitos
deletérios no reparo do tecido nervoso a partir de
tratamentos terapêuticos de traumas do SNC baseados
na administração de glicocorticoides. Atraso na
≤

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Ciência Rural, v.43, n.3, mar, 2013.
remielinização oligodendroglial após injeção de
droga gliotóxica foi igualmente observado no tronco
encefálico de ratos tratados com DX (BONDAN et
al., 2004). Ao mesmo tempo, a regulação negativa de
GFAP exercida pelos esteroides adrenais sugere que
os aumentos de GFAP encontrados na cicatriz glial
após injúria podem ser atenuados pela administração
de glicocorticoides. Entretanto, O´CALLAGHAN et
al. (1991) encontraram que a administração crônica de
corticosterona em ratos não foi capaz de reverter ou
diminuir os grandes aumentos de expressão de GFAP
causados por dano encefálico induzido por trauma
ou intoxicação. Dessa forma, os autores sugerem que
glicocorticoides e injúria parecem regular a expressão
de GFAP por mecanismos distintos.
A maior expressão de GFAP na medula
espinhal em relação à ponte, independentemente do
uso de DX ou não, refl ete as notáveis diferenças de
densidade astrocitária encontradas em distintas áreas
do SNC (EMSLEY & MACKLIS, 2006).
Uma vez que ainda permanece indefi nido
o exato papel do aumento da expressão astrocitária de
GFAP após agressão nervosa e discute-se se a própria
formação da cicatriz glial no SNC representaria uma
infl uência benéfi ca ou deletéria no reparo tecidual
(SOFRONIEW & VINTERS, 2010), a redução do
conteúdo de GFAP demonstrada neste estudo pelo
uso da DX em cães não permite generalizar e inferir,
de forma precisa, as reais implicações do uso de
corticoides na prática clínica no âmbito da recuperação
morfológica e funcional do SNC após situações de
agressão. Apesar das complexas e não inteiramente
elucidadas interações celulares envolvidas na
manutenção da homeostasia no microambiente
neural, o que se pode constatar neste estudo é que o
emprego de DX em cães esteve ligado a uma redução
da expressão de GFAP, o principal marcador da
população astrocitária no SNC, à semelhança do já
constatado em alguns estudos in vitro, bem como
realizados experimentalmente em roedores.
COMITÊ DE ÉTICA E BIOSSEGURANÇA
Protocolo número 23/2011
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