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Rev. Protección Veg. Vol. 23 No. 1 (2008): 43-47
INTRODUCCIÓN
El cultivo del arroz (Oryza sativa L.) es afectado
por numerosas enfermedades, entre las que se des-
tacan las de origen fungoso. Algunos hongos se pue-
den encontrar asociados a varias enfermedades en
diferentes etapas del ciclo del cultivo. Tal es el caso de
Bipolaris oryzae (B. de Haan) Shoem., agente causal
de la mancha parda de la hoja y uno de los principales
patógenos involucrados en el síndrome del manchado
del grano, debido a su alta incidencia en la mayoría de
las regiones donde se siembra el cereal (4).
El hongo causa daños en el follaje de las plantas
adultas, lo que ha desencadenado pérdidas severas
como la que produjo la hambruna de 1943, debido a
la reducción del rendimiento del cultivo entre el 40 y
el 90% en 1942 (3). Puede transmitirse por semillas y
causa pudriciones en las mismas, tizones, mar-
chitez y amarillamiento en semilleros, manchas en
las glumas, lesiones sobre la raíz, marchitez de la
panícula, coloración oscura y manchado del gra-
no (11). Este agente fitopatógeno produjo una
epifitia en la India, que redujo el número de hijos
de las plantas e inhibió el crecimiento de la raíz y
ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA in vitro DE LAS QUITOSANAS K1 Y SIGMA
FRENTE A Bipolaris oryzae (B. DE HAAN) SHOEM.
Deyanira Rivero*, A. Cruz*, B. Martínez**, Aida T. Rodríguez* y M.A. Ramírez*
*Estación Experimental de Arroz “Los Palacios”, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas.
Carretera a Sierra Maestra, Km. 1 ½, Los Palacios, Pinar del Río, Cuba. **Grupo de Fitopatología,
Dirección de Protección de Plantas, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10,
San José de las Lajas, La Habana, Cuba. Correo electrónico: deyanira@inca.edu.cu
RESUMEN: Con el objetivo de determinar la actividad antifúngica de la quitosana sobre Bipolaris oryzae,
patógeno de mayor incidencia en el síndrome del manchado del grano de arroz y agente causal de la
enfermedad de la mancha parda de la hoja, se estudió el efecto in vitro de diferentes concentraciones
(300, 500, 700 y 1000 mg/L) de las quitosanas K1 (INCA) y SIGMA sobre el crecimiento micelial del
hongo. Para ello se midió el diámetro de las colonias a los 3, 4, 5, 6 y 7 días, y se calculó el porcentaje de
inhibición del crecimiento del hongo, con respecto al control no tratado. Para los tratamientos que
mostraron total inhibición se determinó el efecto fungicida. Los resultados indicaron que ambos
productos tienen un efecto inhibidor del crecimiento del hongo a las concentraciones evaluadas. Se obtuvo
una inhibición total a la concentración de 1000 mg/L de quitosana SIGMA, para la cual se mostró,
además, un efecto fungicida.
(Palabras clave: quitosana; Bipolaris oryzae; actividad antifúngica)
In vitro ANTIFUNGAL ACTIVITY OF K1 AND SIGMA CHITOSANS AGAINST Bipolaris
oryzae (B. DE HAAN) SHOEM
ABSTRACT: To determine the antifungal activity of chitosan against Bipolaris oryzae, which is a pathogen
with the highest incidence in the rice spotted grain disease and the causal agent of brown leaf spot, the
in vitro effect of different concentrations (300, 500, 700 and 1000 mg/L) of K1 (INCA) and SIGMA
chitosans on fungal mycelial growth was studied. The colony diameter was measured after 3, 4, 5, 6
and 7 days, and the inhibition percentage of fungal mycelial growth compared with the non-treated
control was calculated. The fungicide effect of the product for the treatment that totally inhibited the
fungus was determined. The results indicated that both products had an inhibitory effect on fungal
growth at all evaluated concentrations. SIGMA chitosan showed a total inhibition at 1000 mg/L, besides
its fungicide effect.
(Key words: chitosan; Bipolaris oryzae; antifungal activity)
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del tallo, con lo que el rendimiento decreció entre
el 20 y 40% (3).
En Cuba existe una estrategia para el manejo del
síndrome del manchado del grano y de la mancha
parda (9); no obstante, esta se fundamenta en la apli-
cación repetida de fungicidas químicos en varias eta-
pas del ciclo del cultivo, lo que incrementa la conta-
minación en los ecosistemas arroceros, y la enfer-
medad persiste en las áreas de producción. De ahí
que resulte apremiante la búsqueda de productos
naturales, como la quitosana, que es un polisacárido
natural, biodegradable e inocuo, eficiente en el con-
trol de algunos agentes fitopatógenos (8); y de esta
forma se contribuya a disminuir la incidencia del pa-
tógeno y la carga contaminante debido a la aplica-
ción de químicos nocivos. En este sentido, el objeti-
vo del presente estudio consistió en evaluar la acti-
vidad antifúngica de las quitosanas K1 y SIGMA so-
bre el crecimiento micelial del patógeno B. oryzae.
MATERIALES Y MÉTODOS
En los diferentes ensayos se utilizó el aislamien-
to 2-01-05 de B. oryzae correspondiente al cepario
del Laboratorio de Micología Vegetal del Centro Na-
cional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), obtenido
a partir de granos de arroz manchados de la varie-
dad INCA LP-5. La quitosana K1 se obtuvo, a partir
de quitina de langosta en el Laboratorio de
Oligosacarinas del Instituto Nacional de Ciencias
Agrícolas (INCA) (15) y presentó un 88 % de
desacetilación. Se empleó, además, quitosana
SIGMA, con 90,5 % de desacetilación.
Efecto de las quitosanas K1 y SIGMA sobre el cre-
cimiento micelial de B. oryzae
Se empleó el método de envenenamiento del me-
dio, para lo cual se adicionaron iguales volúmenes de
medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA) (BIOCEN)
y soluciones madres de quitosanas K1 y SIGMA, de
forma independiente, a las concentraciones de 600,
1000, 1400 y 2000 mg/L, de manera que se obtuvie-
ron concentraciones efectivas de 300, 500, 700 y 1000
mg/L de ambos compuestos.
Posteriormente se sembraron discos de micelio
de 0,5 cm de diámetro de B. oryzae en el centro de
placas Petri con medio envenenado, ajustado a pH
5,2, a razón de un disco por placa (4 repeticiones).
Los discos miceliales se obtuvieron de la periferia
de las colonias, a partir de cultivos fungosos puros
de 5 días de edad, en medio PDA, incubado en os-
curidad, a una temperatura de 26±2ºC. Se utilizó
como control un tratamiento donde se añadió agua
destilada estéril en lugar de quitosana a igual volu-
men de medio PDA.
Se midió diariamente el diámetro de las colonias
(cm) desde los 3 y hasta los 7 días, se restó el diáme-
tro del disco sembrado y se determinó el porcentaje
de inhibición del crecimiento micelial mediante la fór-
mula:
% Inhibición= (1- [diámetro de la colonia tratada / diáme-
tro de la colonia control]) x 100.
Se determinó, además, la velocidad de crecimien-
to del hongo (cm/h) a los 3, 4, 5, 6 y 7 días en todos
los tratamientos, mediante la razón del crecimiento
fúngico relativo (incremento del diámetro de la colo-
nia en un intervalo de tiempo) sobre el intervalo de
tiempo transcurrido.
Actividad fungicida de las quitosanas
En las variantes donde se obtuvo 100 % de inhibi-
ción del crecimiento, se verificó la actividad fungicida
de los compuestos, para lo cual se sembraron en
medio PDA sin quitosana, de manera invertida, los
discos de micelio sin crecimiento, y se incubaron bajo
las condiciones descritas anteriormente. Se midió dia-
riamente el diámetro de cada colonia (cm) desde los
3 hasta los 7 días, se utilizó como control un cultivo
del hongo crecido a partir de un disco de micelio no
tratado con quitosana, sembrado e incubado en las
mismas condiciones que los tratados.
Para el desarrollo de este trabajo se empleó un
diseño completamente aleatorizado. Los datos de
porcentajes de inhibición del crecimiento micelial,
obtenidos en el primer ensayo, se transformaron
mediante la expresión 2 arcsen√% y se realizó un
ANOVA bifactorial, donde los factores fueron pro-
ducto y concentración. La velocidad de crecimien-
to se analizó mediante un ANOVA simple. Las
medias se compararon mediante la Prueba de
Rangos Múltiples de Duncan (p < 0,05). Los datos
correspondientes al diámetro de las colonias, en
el ensayo de actividad fungicida, se analizaron a
través de la Prueba t de Student para muestras
independientes.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto de las quitosanas K1 y SIGMA sobre el cre-
cimiento micelial de B. oryzae
En todos los tratamientos se obtuvo una reduc-
ción del crecimiento micelial del patógeno con res-
pecto al control, en todos los momentos evaluados
(Tabla 1). El efecto inhibitorio tanto de la quitosana K1
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como de SIGMA se incrementó a medida que aumen-
tó la concentración de ambos compuestos, excepto
para las concentraciones de 700 y 1000 mg/L de K1
que no difierieron significativamente entre sí a partir
del quinto día. Se alcanzó una alta inhibición a la con-
centración de 700 mg/L de quitosana SIGMA, y fue
total (100% de inhibición) a 1000 mg/L del compuesto.
En algunos tratamientos hubo una ligera reducción del
porcentaje de inhibición final, pero estos siguieron la
misma tendencia de incremento con respecto a la con-
centración y mostraron la potencialidad de ambos com-
puestos de inhibir el crecimiento micelial del patógeno.
Resultados similares se han obtenido contra los hon-
gos patógenos del arroz Rhizoctonia solani Kuhn y
Pyricularia grisea Sacc, cuando se trataron con quitosana
a la concentración de 1000 mg/L, con un 100 % de inhi-
bición del crecimiento (12, 16). Sin embargo, se ha ob-
servado un comportamiento diferente para otros hon-
gos fitopatógenos, como Sarocladium oryzae (Sawada)
donde solo se logró una inhibición de un 30%, mediante
el empleo de un método donde el hongo se expone
menos tiempo al producto (5); así como en ensayos de
inhibición in vitro del hongo Phytophthora parasitica
Dastur, mediante el empleo de quitosana y sus
hidrolizados enzimáticos, donde se alcanzaron niveles
inferiores al 90 % de inhibición (6). Para las especies
Rhizopus stolonifer Ehremberg ex Fr., Phytophthora
infestans Mont. y Fusarium oxysporum Schlechtend., se
requirieron elevadas concentraciones (hasta 4000 mg/
L) para lograr una alta inhibición (14).
Por otra parte, en un estudio de actividad
antimicrobiana de siete derivados de quitosana
(hidroxipropil quitosana soluble en agua), se obtuvie-
ron concentraciones mínimas inhibitorias de 310 y 550
mg/L con dos de estos compuestos contra los hon-
gos patógenos de frutos Coniella diplodiella (Speg.)
Petrak y Sydow y F. oxysporum. Los restantes com-
puestos tuvieron efecto inhibitorio sobre C. diplodiella
a las concentraciones mínimas de 1100, 5000 y 7500
mg/L y sobre F. oxysporum a 1100, 3800 y 10 000 mg/
L. Sin embargo, no lograron inhibición de los hongos
Rhizopus nigricans Ehrenberg. y Gloeosporium
fructigenum Berk. a las concentraciones evaluadas (13).
De forma general, las velocidades de crecimiento
de B. oryzae en los tratamientos con quitosana, para
cada día, son menores que las del tratamiento con-
trol (Tablas 2 y 3).
En los tratamientos con quitosana K1, a pesar de
mostrar diferencias estadísticas significativas respecto
al control, excepto para las concentraciones de
quitosana de 300 mg/L a los 3 y 4 días, y de 500 mg/
L a los 4 y 6 días (Tabla 2), no existe una reducción
marcada de la velocidad del crecimiento. Sin embar-
go, en los tratamientos con quitosana SIGMA (Tabla
3) se alcanzó la mitad, tercera y quinta parte de la
velocidad de crecimiento del hongo en el control, y un
valor nulo de velocidad para la mayor concentración.
Esto evidencia que, al parecer, la reducción final en
el crecimiento de B. oryzae se debe a la acción de am-
bos productos (y más marcadamente de la quitosana
SIGMA) sobre la velocidad de crecimiento del hongo.
Estos resultados son alentadores si se comparan
con los obtenidos en ensayos donde se determinó el
efecto de la quitosana sobre la levadura de uso in-
dustrial Saccharomyces cerevisiae Hansen, en los que
se observó una disminución de la velocidad de creci-
miento directamente proporcional a la concentración
del polímero, con una reducción de la mitad respecto
al testigo a la concentración de 6000 mg/L (7).
TABLA 1.
Efecto de las quitosanas K1 y SIGMA sobre el crecimiento micelial de
Bipolaris oryzae
./
Effect of K1 and
SIGMA chitosans on Bipolaris oryzae mycelial growth
Porcentaje de inhibición del crecimiento micelial por día Tratamientos 3 4 5 6 7
Control 0 h 0 h 0 g 0 f 0 g
K1-300 mg/L 5 g 4 g 10 f 13 e 13 f
K1-500 mg/L 18 f 16 f 16 e 14 e 15 e
K1-700 mg/L 50 e 44 e 47 d 45 d 46 d
K1-1000 mg/L 61 d 51 d 50 d 48 d 47 d
SIGMA-300 mg/L 58 de 46 de 51 d 46 d 44 d
SIGMA-500 mg/L 89 c 78 c 76 c 71 c 64 c
SIGMA-700 mg/L 98 b 91 b 89 b 85 b 80 b
SIGMA-1000 mg/L 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a
ESx 0.063 0.042 0.024 0.024 0.020
Medias con letras iguales, en la columna, no difieren significativamente (p<0,05).
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La actividad antifúngica de la quitosana y sus deri-
vados se asocia a su porcentaje de desacetilación,
pues se ha encontrado relación entre la naturaleza
catiónica y la acción efectiva contra los agentes
fitopatógenos; así como también se potencia dicha
actividad en función del grado de sustitución del com-
puesto (17, 18).
Actividad fungicida de las quitosanas
El aislamiento de B. oryzae no presentó viabilidad
al encontrar las condiciones óptimas de cultivo, mien-
tras que el tratamiento control mostró un rápido creci-
miento (7,4 cm de diámetro a los 7 días). Esto demues-
tra que la quitosana SIGMA, a la concentración de 1000
mg/L tuvo un efecto fungicida sobre el mismo; es decir,
que las estructuras vegetativas y reproductivas del hon-
go pudieron haber sufrido cambios irreversibles que le
impidieron al mismo sobrevivir y adaptarse a las condi-
ciones en el medio no envenenado.
También se ha encontrado actividad fungicida de
quitosana y diferentes derivados sobre algunos hon-
gos fitopatógenos. Tal es el caso de una quitosana
con 63 % de desacetilación y su hidrolizado, que mos-
traron actividad fungicida a las concentraciones de
1000 mg/L, y 500 y 1000 mg/L, respectivamente, frente
a P. grisea (16). Por otra parte, distintos derivados
hidroxipropilados de quitosana lograron actividad
biocida contra C. diplodiella y F. oxysporum en un ran-
go de concentración entre 1100 y 10 000 mg/L (13).
No obstante, existen otros hongos que han respondi-
do ante la quitosana sin mostrar afectación de la
ultraestructura de sus células hifales, por lo que no
se afecta su normal desarrollo (5).
Se han propuesto diferentes mecanismos, por los
que la quitosana puede actuar sobre los
microorganismos e inhibir su crecimiento y desarrollo.
Se plantea que la afectación puede ser sobre la per-
meabilidad de la membrana citoplasmática, mediante la
interacción de sus grupos NH3+ con componentes
fosfolipídicos cargados negativamente en las membra-
nas bacterianas, con lo que se altera el intercambio con
el medio, además de la formación de quelatos con los
metales de transición y la inhibición de algunas enzimas
(1, 10). El biopolímero puede actuar a nivel molecular,
sobre los ácidos nucleicos y alterar sus funciones, me-
diante cambios transcripcionales específicos (19), o in-
ducir alteraciones estructurales de las células fungosas
como la presencia de vesículas en el micelio, células sin
contenido citoplasmático, otras desorganizaciones ce-
lulares que abarcan la excesiva ramificación y ensan-
chamiento de la pared celular, la pérdida de la misma y
hasta la desintegración del citoplasma (2).
TABLA 2.
Velocidad de crecimiento de
B. oryzae
frente a la quitosana K1./
Bipolaris oryzae
growth velocity against
K1 chitosan
Velocidad de crecimiento de B. oryzae (cm/h) por día Tratamientos
3 4 5 6 7
Control 0.056 a 0.047 a 0.050 a 0.047 a 0.047 a
300 mg/L 0.053 a 0.047 a 0.032 c 0.033 b 0.042 b
500 mg/L 0.046 b 0.043 ab 0.042 b 0.046 a 0.035 c
700 mg/L 0.028 c 0.036 c 0.021 d 0.031 b 0.024 e
1000 mg/L 0.022 d 0.039 bc 0.028 cd 0.029 b 0.029 d
ESX 0.001 0.002 0.002 0.002 0.002
Medias con letras iguales, en la columna, no difieren significativamente (p<0,05).
TABLA 3. Velocidad de crecimiento de B. oryzae frente a la quitosana SIGMA./ Bipolaris oryzae growth velocity
against SIGMA chitosan
Velocidad de crecimiento de B. oryzae (cm/h) por día Tratamientos
3 4 5 6 7
Control 0.056 a 0.047 a 0.050 a 0.047 a 0.047 a
300 mg/L 0.024 b 0.044 a 0.015 b 0.036 b 0.035 b
500 mg/L 0.006 c 0.029 b 0.015 b 0.028 c 0.039 b
700 mg/L 0.001 d 0.015 b 0.010 b 0.018 d 0.026 c
1000 mg/L 0.000 d 0.000 c 0.000 b 0.000 e 0.000 d
ESX 0.001 0.005 0.005 0.002 0.002
Medias con letras iguales, en la columna, no difieren significativamente (p<0,05).
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De los resultados obtenidos puede concluirse que
las quitosanas K1 y SIGMA ejercen un efecto inhibidor
del crecimiento micelial de B. oryzae, que fue total a
la mayor concentración (1000 mg/L) en la quitosana
SIGMA y con efecto fungicida, lo que convierte a am-
bos compuestos en polisacáridos promisorios para el
control de este patógeno.
REFERENCIAS
1. Balicka-Ramisz, Aleksandra; Wojtasz, Anna;
Pilarczyk, Bogumila; Ramisz, A. y Laurans, L.
(2005): Antibacterial and antifungal activity of
chitosan. ISAH CAB Abstracts, Warsaw, Poland. 2:
406-408.
2. Barka, E.A.; Eullaffroy, P.; Clément, C. y Vernet, G.
(2004): Chitosan improves development, and protects
Vitis vinifera L. against Botrytis cinerea. Plant Cell
Reports. 22(8): 608-614.
3. CAB Internacional (2004): Crop Protection
Compendium (CD). Londres, Edition. Wallingford,
UK.
4. Cordero, V. y Rivero, L.E. (2001): Principales
enfermedades fungosas que inciden en el cultivo del
arroz en Cuba. Instituto de Investigaciones del Arroz.
MINAGRI. p: 29-32.
5. Cruz, A.; Rivero, Deyanira.; Martínez, B.; Ramírez,
M.A. y Rodríguez, Aida. T. (2004): Efecto de la
quitosana sobre el crecimiento y desarrollo in vitro
de Sarocladium oryzae Sawada. Rev. Protección Veg.
19(2): 133-136.
6. Falcón, A.; Díaz, D. y Ramírez, M.A. (2004):
Hidrólisis enzimática de quitosana. Actividad
biológica del polímero y sus hidrolizados. Cultivos
Tropicales. 25(2): 81-86.
7. Gómez-Rivas, Leticia; Escudero-Abarca, Blanca I.;
Aguilar-Uscanga, Guadalupe; Hayward-Jones,
Patricia M.; Mendoza, Patricia y Ramírez, M. (2004):
Selective antimicrobial action of chitosan against
spoilage yeasts in mixed culture fermentations. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 31(1): 16-22.
8. Hernández, I. (2004): La quitosana: un producto
bioactivo de diversas aplicaciones. Cultivos
Tropicales. 25(3): 97-110.
9. IIA. (2006): Instructivo Técnico del Cultivo de Arroz.
Instituto de Investigaciones del Arroz, Centro
Nacional de Sanidad Vegetal, Ministerio de la
Agricultura, 80 p.
10.Liu, H.; Du, Y.; Wang, X. y Sun, L. (2004): Chitosan
kills bacteria through cell membrane damage. Int. J.
Food Microbiol. 95: 147-155.
11.Neninger, L.H.; Hidalgo, E.; Barrios, L.M. y Puedo,
M. (2003): Hongos presentes en semillas de arroz
(Oryza sativa L.) en Cuba. Fitosanidad. 7(3): 7-11.
12.Parra, Yanet y Ramírez, M.A. (2002): Efecto de
diferentes derivados de la quitina sobre el crecimiento
in vitro del hongo Rhizoctonia solani Kuhn. Cultivos
Tropicales. 23(2): 73-75.
13.Peng, Y.; Han, B.; Wanshun, L. y Xiaojuan, X. (2005):
Preparation and antimicrobial activity of
hydroxypropyl chitosan. Carbohydrate Research.
340(11): 1846-1851.
14.Pombo, R. (1996): Relación estructura-actividad de
la quitosana y sus hidrolizados solubles sobre algunos
hongos fitopatógenos. Tesis presentada en opción
al grado académico de Master en Química Agrícola.
UNAH.
15.Ramírez, M.A.; Cabrera, G.; Gutierrez, A. y
Rodríguez, Aida T. (2000): Metodología para la
obtención de quitosana a bajas temperaturas a partir
de quitina de langosta. Cultivos Tropicales. 21(1):
81-84.
16.Rodríguez, Aida T.; Ramírez, M.A.; Nápoles, María
C.; Márquez, Ramona y Cárdenas, Regla M. (2003):
Antifungal activity of chitosan and one of its
hydrolysates on Pyricularia grisea Sacc. fungus.
Cultivos Tropicales. 24(2): 85-88.
17.Stepnova, E.A.; Tikhonov, V.E.; Babak, V.G.;
Krayukhina, M.A.; Babiebskii, K.K. y Yamskov, I.A.
(2005): Biologically Active Amphiphilic derivatives
of chitosan. Fibre Chemistry. 37(6): 483-484.
18.Torr, K.M.; Chittenden, Colleen; Franich, R.A. y
Kreber, B. (2005): Advances in understanding
bioactivity of chitosan and chitosan oligomers against
selected wood-inhabiting fungi. International
Journal of Biology, Chemistry, Physics, and
Technology of Wood. 59(5): 559-567.
19.Zakrzewska, Anna; Boorsma, A.; Brul, S.;
Hellingwerf, K.J. y Klis, F.M. (2005): Transcriptional
Response of Saccharomyces cerevisiae to the Plasma
Membrane-Perturbing Compound Chitosan.
Eukaryotic Cell. 4(4): 703-715.
(Recibido 27-3-2007; Aceptado 24-7-2007)
