Content uploaded by Emma Zavaleta-Mejía
Author content
All content in this area was uploaded by Emma Zavaleta-Mejía on Feb 20, 2016
Content may be subject to copyright.
Content uploaded by Emma Zavaleta-Mejía
Author content
All content in this area was uploaded by Emma Zavaleta-Mejía on Oct 07, 2014
Content may be subject to copyright.
Artículo Científico Rev. Fitotec. Mex. Vol. 30 (3): 223 – 234, 2007
Recibido: 5 de Abril del 2006.
Aceptado: 9 de Enero del 2007.
VARIACIÓN PATOGÉNICA Y MOLECULAR D
DE
E
A
AI
IS
SL
LA
AM
MI
IE
EN
NT
TO
OS
S
D
DE
E
PUCCINIA HORIANA H
He
en
nn
n.
.
PATHOGENIC AND MOLECULAR VARIABILITY OF PUCCINIA HORIANA Henn. ISOLATES
Rómulo García Velasco5, Emma Zavaleta- Mejía1*, Reyna Isabel Rojas Martínez1,
Santos Gerardo Leyva Mir2, Guillermo Fuentes Dávila3 y June Simpson4
1Especialidad de Fitopatología, Instituto de Fitosanidad, Colegio de Postgraduados. Km 36.5 Carr. México-Texcoco 56230, Montecillo, Edo de México.
2Departamento de Parasitología Agrícola, Universidad Autónoma Chapingo. Km 38.5 Carr. México-Texcoco. 56230, Chapingo, Edo. de México 3Campo Ex-
perimental Valle del Yaqui, CIRNO, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Norman E. Borlaug, Apdo. Postal 515. Km 12
entre 800 y 900, Valle del Yaqui. 85000, Cd. Obregón, Sonora 4Departamento de Ingenieria Genética de Plantas, Centro de Investigación y Estudios Avanzados,
Instituto Politécnico Nacional-Unidad Irapuato. Apdo. Postal 629. Km 9.6 Libramiento Norte Carr. Irapuato-León. 36500, Irapuato, Guanajuato, México.
5Dirección actual: Centro Universitario Tenancingo, Universidad Autónoma del Estado de México. Km. 1.5 Carr. Tenancingo-Villaguerrero, Ex-Hacienda de
Santa Ana Tenancingo, 52400.
* Autor para correspondencia (zavaleta@colpos.mx)
RESUMEN
Se estudió la variación patogénica y molecular de 16 aislamientos
de Puccinia horiana colectados en los Estados de México, Morelos y
Puebla. Con los aislamientos se inocularon cinco variedades de crisan-
temo (Dendranthema grandiflara Tzveler.) (‘Indianápolis’, ‘Harman’,
‘Eleonora’, ‘Vikyngo’ y ‘Marble’). Los aislamientos del Estado de
México fueron más virulentos que los de Morelos y Puebla, cuyo pe-
riodo de incubación en ‘Indianápolis’ fue de 15 d en promedio, mien-
tras que los aislamientos de Morelos y Puebla requirieron 3 y 4 d más.
Para los aislamientos del Edo. de México la máxima incidencia en ‘In-
dianápolis’ se registró 4 d después de aparecer los primeros síntomas,
mientras que los provenientes de Morelos y Puebla requirieron 5 y 6 d
más. Del grupo del Edo. de México se capturaron 539 a 977 basidios-
poras en 0.25 cm2, mientras que del grupo de Morelos y Puebla se
atraparon 76 y 42 basidiosporas. En los aislamientos del Edo. de Méxi-
co la severidad varió de 23 a 36 %, mientras que en los provenientes de
Morelos y Puebla fue de 5.7 a 8.5 % y de 4.2 a 7.3 %. Con los análisis
de polimorfismo del ADN mediante RAPD, MP-PCR y RAMP, se iden-
tificaron tres grandes grupos (a, b y c) que correspondieron exacta-
mente con el origen geográfico de los aislamientos.
Palabras clave: Dendranthema grandiflara, virulencia, polimorfismo.
SUMMARY
The pathogenic and molecular variability of 16 isolates of Puccinia
horiana collected from the States of México, Morelos and Puebla were
studied. Five chrysanthemum Dendranthema grandiflara Tzveler culti-
vars (‘Indianápolis’, ‘Harman’, ‘Eleonora’, ‘Vikyngo’ y ‘Marble’)
were inoculated with the isolates. The isolates from the State of México
were the most virulent as compared to those collected from Morelos
and Puebla, since the incubation period in ‘Indianapolis’ took around
15 d whereas the isolates from Morelos and Puebla required 3 and 4
more d. For the isolates from the State of México the maximum inci-
dence in ‘Indianápolis’ was reached only 4 d after the first symptoms
appeared, whereas those from Morelos and Puebla needed 5 and 6
more d. Of the isolates coming from the State of México, 539 to 977
basidiospores were trapped in 0.25 cm2; in contrast, for those from
Morelos and Puebla only 76 and 42 basidiospores were trapped. In the
isolates from the State of México the severity fluctuated from 23 to 36
%, whereas in those coming from Morelos and Puebla varied from 5.7
to 8.5 % and from 4.2 to 7.3 %. Through the DNA polymorphism
analyses with RAPD, MP-PCR and RAMP, three groups were identi-
fied (a, b y c) which corresponded exactly to the geographical origin of
the isolates.
I
In
nd
de
ex
x
w
wo
or
rd
ds
s:
:
Dendranthema grandiflara, virulence, polimorphism.
INTRODUCCIÓN
La roya blanca causada por Puccinia horiana Henn.
afecta de manera importante la producción del crisantemo
(Dendranthema grandiflara Tzveler.), tanto para maceta
como para flor de corte, debido a que en México no se
cuenta con suficientes variedades resistentes a esta enfer-
medad. El establecimiento y desarrollo del patógeno es fa-
vorecido por temperaturas entre 17 y 24 °C y humedad rela-
tiva superior a 96 %; en estas condiciones la germinación de
esporas y penetración en los tejidos del hospedante ocurre
en 4 ó 5 h, y la manifestación de los primeros síntomas se
puede observar a los 7 d en cultivares susceptibles (Firman
y Martin, 1968).
Sin embargo, la temperatura para la germinación de las
teliosporas y basidiosporas de P. horiana varía entre pobla-
ciones; por ejemplo, en el Reino Unido ocurre entre 4 y 23
°C, mientras que en Japón el rango es de 6 a 36 °C. Aún así,
no está bien definido si tales diferencias pueden estar rela-
cionadas con propiedades particulares de diferentes razas
(Whipps, 1993). En Alemania, Krebs (1985) reportó la
VARIACIÓN PATOGÉNICA Y MOLECULAR DE PUCCINIA HORIANA Rev. Fitotec. Mex. Vol. 30 (3), 2007
224
presencia de las razas 83 y 84 de P. horia na que difieren en
su capacidad de infectar a un cultivar específico o a grupos
de cultivares.
En cuanto al ciclo biológico del hongo, P. horiana difie-
re del resto de royas en que es microcíclica autoica; durante
su reproducción sexual no lleva a cabo la plasmogamia
(unión entre micelio + y -) y sólo ocurre cariogamia (fusión
nuclear) en las teliosporas, seguida inmediatamente por la
meiosis que da origen a cuatro núcleos haploides que se dis-
tribuyen en dos basidiosporas; por tanto, cada basidiospora
tiene dos núcleos y al germinar origina un micelio dicarió-
tico que contiene dos núcleos hermanos (Hirasuka y Sato
1982; Alexopoulos y Mims, 1985). Dado que P. h or ian a es
una roya que se autofertiliza todas sus basidiosporas son
genéticamente uniformes, a menos que ocurra una mutación
o que haya un intercambio de núcleos de micelios genéti-
camente diferentes, mediante la anastomosis (fusión de
hifas) (Anikster y Wahl, 1979; Redemaker y de Jong, 1987);
a través de estos mecanismos se pueden generar nuevas ra-
zas en este tipo de royas (Anikster y Wahl, 1979).
En general, la tasa de mutación en poblaciones natura-
les de hongos es de 10-6 a 10-8, que incluyen individuos vi-
rulentos y avirulentos (Skylakakis, 1987). La variación ge-
nética del patógeno puede reflejarse en diferencias en capa-
cidad patogénica (Zhan et al., 1998; Lannou, 2001). Es po-
sible evidenciar tal diversidad mediante marcadores mole-
culares, como polimorfismos en la longitud de fragmentos
de restricción (RFLP), ADN polimórfico amplificado al azar
(Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD), polimor-
fismos en la longitud de fragmentos amplificados (Ampli-
fied Fragment Length Polymorphisms, AFLP) y polimor-
fismos en secuencias repetidas con mini o microsatélites
(RAMP), que detectan polimorfismo en tamaños de frag-
mentos a nivel de individuo o de población. La combinación
de estos métodos permite obtener información más precisa
de la variación genética y estructura de las poblaciones de
fitopatógenos (Kolmer et al., 1995).
México es un país productor de crisantemo cuyas prin-
cipales zonas productoras para corte y maceta se ubican en
los Estados de Morelos, Puebla y México, zonas que difie-
ren en clima, cultivares comerciales y en manejo del culti-
vo, variabilidad que puede contribuir a la generación de di-
versidad genética del patógeno. Con base en lo anterior, el
presente estudio tuvo como objetivo determinar la variación
patogénica y molecular de 16 aislamientos de P. horiana
procedentes de los estados mencionados.
MATERIALES Y MÉTODOS
Colecta de aislamientos, incremento de inóculo y de-
terminación de la virulencia de los aislamientos mono-
pustulares de P. horia na en crisantemo var. ‘Indianápo-
lis’. Se colectaron 16 aislamientos de P. horiana de planta-
ciones comerciales y viveros de crisantemo infectadas con
roya blanca en los Estados de Morelos, Puebla y México.
De cada estado se seleccionaron sitios representativos; en el
Estado de México se consideraron dos regiones: la Occiden-
te (Occ), con las localidades de La Lagunilla (Lag-Occ),
Zumpango (Zum-Occ) y Sta. Ana (SA-Occ) pertenecientes
al municipio de Tenancingo, Sta. María Aranzazú (Ara-Occ)
del municipio de Villa Guerrero, Porfirio Díaz (PD-Occ) y
Coatepec Harinas (CH-Occ) del municipio de Coatepec
Harinas; y la región Oriente (Ori) con San Miguel Tlaixpan
(SMT-Ori), San Pablo Izayoc (SPI-Ori), Sta. María Nativi-
tas (SMN-Ori), Tequexquinahuac (Teq-Ori), San Diego
(SD-Ori) y Boyeros (Boy-Ori), todos pertenecientes al mu-
nicipio de Texcoco. En el Estado de Morelos se colectó en
las localidades de Tepetzingo (Tep-Mor), Temixco (Tem-
Mor) y Jiutepec (Jiu-Mor) del municipio de Cuernavaca. En
el Estado de Puebla se obtuvo el material del municipio de
Atlixco (Atl-Pue). En el Cuadro 1 se muestran algunas ca-
racterísticas climatológicas de las localidades.
De cada localidad se tomaron pústulas de color miel a
café y se colocaron individualmente en tubos tipo eppendorf
etiquetados, que se mantuvieron a baja temperatura durante
el transporte al laboratorio, en donde se seleccionó una pús-
tula de cada localidad. Las teliosporas se obtuvieron me-
diante el raspado con un portaobjetos, luego se suspendie-
ron en 50 mL de agua destilada estéril con una gota de
Tween 20® para una mejor dispersión del inóculo. La sus-
pensión se asperjó a punto de goteo sobre el haz y envés de
las hojas en 10 plantas de crisantemo var. ‘Indianápolis’
susceptible a la roya, con el fin de incrementar el inóculo
monopostular.
Las plantas inoculadas se incubaron durante 48 h en una
cámara de polietileno a 100 % de humedad relativa (HR) y
temperatura de 12 a 14 °C. Luego se transfirieron a un in-
vernadero cuya temperatura varió entre 14 y 28 ºC y con
HR de 80 %. A los 13 d de la inoculación las plantas se so-
metieron nuevamente a una HR de 100 % durante 24 h
(Leyva-Mir et al., 2001). Cada grupo de plantas inoculadas
con diferente aislamiento se mantuvo separado en compar-
timientos de polietileno, para evitar la mezcla de aislamien-
tos.
En esta primera etapa se registró el inóculo inicial que se
obtuvo de la pústula colectada (teliosporas mL-1), la inci-
dencia final de plantas con pústulas, y las variables: periodo
de incubación (días posteriores a la inoculación “dpi”), nú-
mero de pústulas incipientes (manchas cloróticas en el en-
vés de la hoja) al inicio de la infección y número de pústulas
desarrolladas en toda la planta a los 50 d posteriores a la
inoculación. Estas tres últimas variables constituyeron los
criterios de comparación de virulencia entre aislamientos,
donde la virulencia se consideró como una medida relativa
de la patogenicidad y del grado de daño, de acuerdo con
Agrios (2005) y Shaner et al. (1992), respectivamente.
GARCÍA, ZAVALETA, ROJAS, LEYVA, FUENTES Y SIMPSON Rev. Fitotec. Mex. Vol. 30 (3), 2007
225
Cuadro 1. Ubicación geográfica, temperatura media en °C y precipitación anual en mm de los sitios de colecta de Puccinia horiana. Tomado de Enri-
queta García (1998).
Región Altitud
(m)
Ubicación
geográfica
(LN y LO)
Temperatura
(°C)
Precipitación
(mm)
Edo. de Méx. región Oriente
Tenancingo 1842 18° 58’
99° 36’
17.2 1253.9
Coatepec de Harinas 2240 18° 55’
99° 36’
16.2
1132.3
Edo. de Méx. región Occidente
Chapingo 2250 19° 29’
98° 53’
15.2
636.5
Texcoco 2353 19° 31’
98° 53’
15.9 691.5
Sn. Miguel Tlaixpan 2200 19° 32’
98° 49’
14.7 621.0
Sta. María Nativitas 2750 19 °35’
99° 37’
13.5 997.2
Edo. de Morelos
Temixco 1280 18° 51’
99° 14’
22.9 910.7
Cuernavaca 1529 18° 55’
99° 14’
20.7 1146.6
Edo. de Puebla
Atlixco (Izúcar de Matamoros) 1285 18° 36’
98° 27’
22.2 856.7
Comparación de la virulencia de los aislamientos de
P. hor iana. Esquejes de cinco variedades de crisantemo
con diferentes grados de susceptibilidad a P. horiana: ‘Indi-
anápolis’, ‘Harman’, ‘Eleonora’, ‘Vikyngo’ y ‘Marble’, se
plantaron en vasos de unicel de 250 mL que contenían sus-
trato Finnpeat®, y se mantuvieron en invernadero a 17-24
°C y HR mayor a 96 % (Leyva-Mir et al., 2001). Para su-
primir el desarrollo de roya que podría venir como contami-
nante del esqueje, a los 5 d después del trasplante se hizo
una aplicación de Azoxystrobin® a dosis de 0.5 g L-1, que
es un fungicida sistémico con propiedades preventivas y cu-
rativas (Wojdyla, 1999). A los 25 d después de la aplicación
del fungicida, las plantas se inocularon con P. horiana.
Ensayo 1. De plantas de la var. ‘Indianápolis’, que en la
primera etapa fueron inoculadas con los aislamientos mo-
nopustulares, se obtuvieron pústulas de color miel a café y
mediante raspado se desprendieron y se suspendieron en
200 mL de agua destilada estéril, se agregaron 2 gotas de
Tween 20® y se licuó para dispersar las teliosporas. Se
cuantificó el número de teliosporas con un hemacitómetro y
se preparó una suspensión de 106 teliosporas por mL. Cada
uno de los 16 aislamientos se inoculó en un grupo de 25
plantas, cinco de cada variedad, mediante asperjado de
hojas por el haz y envés hasta punto de goteo. Cada grupo
se mantuvo separado como se indicó anteriormente. Las
condiciones de temperatura y humedad y el manejo de las
plantas, fueron similares a las descritas en la primera etapa.
Se registró el número de pústulas incipientes por planta
y el periodo de incubación, esto es el número de días poste-
riores (dpi) a la inoculación en que aparecieron los primeros
síntomas. También se estimó el número de basidiosporas
liberadas por cada aislamiento a los 20, 30 y 40 dpi; para
esto se colocaron a la altura de la base del tallo cinco por-
taobjetos cubiertos por un lado con pegamento Bio-Tac®
(ECOGEN, Inc) y se expusieron por 24 h, al cabo de las
cuales se contabilizó el número de basidiosporas atrapadas
en tres segmentos de 0.25 cm2 (dos laterales y el centro) de
cada portaobjetos, y se calculó el promedio por portaobjeto.
Se registró el número de plantas con síntomas (incidencia) y
se evaluó el grado de daño (severidad); para esto último se
tomó solamente la hoja más dañada de cada planta inocula-
da con cada uno de los 16 aislamientos, la cual se digitalizó
y con los programas computacionales Adobe Photoshop 6.0
y UTHSCSA ImageTool (Wilcox et al., 2002) se obtuvo el
porcentaje de área foliar dañada por P. horiana.
Ensayo 2. Se estableció y evaluó de igual manera que el
Ensayo 1, excepto que sólo se inocularon las vars. ‘Vikyn-
go’(susceptible) y ‘Marble’ (resistente).
Análisis estadístico. Los resultados se analizaron con-
forme a un diseño completamente al azar. A menos que se
indique de otra manera, los datos se sometieron a análisis de
varianza y a comparación de tratamientos mediante la prue-
ba de Tukey (P ≤ 0.05), con el paquete estadístico SAS®
(SAS Institute, 1999).
Extracción y amplificación de ADN de los aislamien-
tos de P. horiana. Se colectaron pústulas de P. horiana de
las plantas de la var. ‘Indianápolis’, la cual se utilizó para
incrementar el inóculo de cada aislamiento, se eliminó la
mayor cantidad posible de tejido vegetal y las pústulas se
VARIACIÓN PATOGÉNICA Y MOLECULAR DE PUCCINIA HORIANA Rev. Fitotec. Mex. Vol. 30 (3), 2007
226
colocaron en tubos de plástico de 1.5 mL para su liofiliza-
ción. Dado que P. horiana es un parásito obligado que no se
puede cultivar in vitro, se utilizó tejido foliar sano de crisan-
temo como referencia para discriminar entre las bandas co-
rrespondientes al hongo y las del hospedante.
La extracción del ADN de los aislamientos de P. ho ri an a
y de la planta de crisantemo se realizó mediante el método
de CTAB 3 % descrito por Ahrens y Seemϋller (1992). Se
tomó 0.03 g de tejido liofilizado y se molió en morteros con
nitrógeno liquido. El polvo se pasó a tubos de plástico de
1.5 mL estériles que contenían 200 µL de CTAB (Tris-HCl
100 mM pH 8.0; Na2EDTA 2H2O 20 mM; CTAB 3 %;
NaCl 1.4M; β-mercaptoetanol 0.2 %) y que fueron previa-
mente calentados a 60 °C, se agitó vigorosamente y se adi-
cionaron y mezclaron 600 µL más, se incubó a 60 °C por 1
h con agitación ocasional. Una vez transcurrido ese tiempo,
se adicionaron 600 µL de cloroformo-alcohol isoamilíco
(24:1, v/v) y se mezcló. Se centrifugó a 14 000 rpm durante
8 min; se tomó la fase acuosa, se colocó en tubos estériles
de plástico de 1.5 mL y se adicionó 600 µL de isopropanol
frío; se mezcló suavemente por inversión siete veces, y en-
seguida se incubó a -20 °C por 1 h para precipitar el ADN.
Trancurrido este tiempo se centrifugó a 14 000 rpm durante
8 min, se eliminó el sobrenadante y se dejó secar la pastilla
a temperatura ambiente; posteriormente se disolvió en 50
µL de agua destilada estéril.
El estado físico del ADN se verificó mediante electrofo-
resis en gel de agarosa 1 %, y se visualizó en un transilumi-
nador marca Bio-Rad® modelo Gel-Doc 2000. El ADN ob-
tenido fue cuantificado en un espectrofotómetro Perkin El-
mer® modelo Lambda Bio 10 y se diluyó en agua desioni-
zada estéril hasta obtener una concentración de 20 ng µL-1.
La reacción de RAPD (Random Amplified Polymorphic
DNA) se llevó a cabo con cuatro iniciadores decámeros de
secuencias aleatorias (Operon Tecnologies Inc.; Alameda,
CA, EE. UU.). Los iniciadores fueron: OPA-05 (5’-
AGGGGTCTTG-3’), OPA-08 (5’-GTGACGTAGG-3’),
OPA-13 (5’-CAGCACCCAC-3’) y OPA-19 (5’-
CAAACGTCGG-3’). Para la técnica de microsatélites (MP-
PCR) se utilizaron los iniciadores (GATA)4 y (GACA)4, y
para la técnica RAMP (Random Amplified Microsatellite
Polymorphic) se utilizaron los iniciadores decámeros más
los iniciadores de los microsatélite, y quedaron las siguien-
tes combinaciones: OPA-05 + (GATA)4, OPA-08 + (GA-
TA) 4, OPA-13 + (GATA)4, OPA-19 + (GATA)4; OPA-05 +
(GACA)4, OPA-08 + (GACA)4, OPA-13 + (GACA)4, OPA-
19 + (GACA)4. Las concentraciones finales y reactivos para
preparar las mezclas de reacción se muestran en el Cuadro
2.
Se mezclaron todos los reactivos en el orden y concen-
tración indicada, y al final se agregó el ADN, de manera que
el volumen final de la reacción fue de 25 µL; para evitar la
evaporación a cada tubo se le adicionó 2 µL de aceite mine-
ral estéril. La reacción de amplificación se llevó a cabo en
un termociclador Perkin-Elmer® (CETUR, Norwalk CT,
EE. UU. modelo 2400) bajo las siguientes condiciones:
RAPD (A05, A08 y A19) 2 min a 95 °C, seguido de 35 ci-
clos de 1 min a 94 °C, 2 min a 50 °C, 3 min a 72 °C y el
último ciclo de 10 min a 72 °C seguido de 30 s a 4 °C. Mi-
crosatélites: (GATA)4 2 min a 95 °C, seguido de 40 ciclos
de 1 min a 95 °C, 30 s a 40 °C y 2 min a 72 °C, seguido de
10 min a 72 °C; (GACA)4 2 min a 95 °C, seguido de 40 ci-
clos de 1 min a 95 °C, 30 s a 48 °C y 2 min a 72 °C seguido
de 10 min a 72 °C. Para RAMP se utilizaron los mismos
programas de los microsatélites. Los productos amplifica-
dos fueron colocados en un gel de agarosa 1.8 %, junto con
un marcador de 1 kb (Invitrogen®) como referencia, y fue-
ron separados por electroforesis durante 1 h a 85 V. El gel
fue teñido con bromuro de etidio (0.5 µg mL-1) y se visuali-
zó bajo luz ultravioleta en un fotodocumentador Bio-Rad®
modelo Gel-Doc 2000. Los resultados se documentaron a
través de impresos para su análisis posterior.
Cuadro 2. Condiciones de reacción para RAPD, Microsatélites y
RAMP.
Compuesto Concentración
RAPD
Amortiguador de reacción 1X
MgCl2 1.5 mM
dNTP’s 200 µM
Iniciador aleatorio 20 pmol
ADN polimerasa 1.5 Uŧ
ADN genómico de P. horiana 80 ng
Agua -
Microsatélites
Amortiguador de reacción 1X
MgCl2 3 mM
dNTP’s 200 µM
Iniciador (microsatélite) 30 pmol
ADN polimerasa 1.5 U
ADN genómico de P. horiana 50 ng
Agua -
RAMP
Amortiguador de reacción 1X
MgCl2 3 mM
dNTP’s 200 µM
Iniciador de microsatélite 20 pmol
Iniciador aleatorio 20 pmol
ADN polimerasa 1.5 U
ADN genómico de P. horiana 80 ng
Agua -
ŧUnidades de actividad.
Las bandas obtenidas en cada aislamiento se enumeraron
en orden descendente a partir de la de mayor peso molecu-
lar. A cada banda se le asignó un valor numérico, 1 para de-
notar presencia y 0 para ausencia, con lo que se generó una
matriz binaria de disimilaridad genética mediante el coefi-
ciente de apareamiento simple (SM). El dendrograma fue
derivado de la matriz de disimilaridad con el programa
GARCÍA, ZAVALETA, ROJAS, LEYVA, FUENTES Y SIMPSON Rev. Fitotec. Mex. Vol. 30 (3), 2007
227
SAHN del sistema taxonómico numérico para computadora
personal (NTSYSpc) Versión 2.10pc, por el método del
promedio UPGMA (Adams et al., 2000). La robustez del
dendrograma, es decir la estabilidad estadística del agrupa-
miento de las ramas o nodos del dendrograma, se estimó por
el análisis “bootstrap” con 2000 remuestreos, con el pro-
grama computacional “Winboot” (Nelson et al., 1994).
RESULTADOS
Incremento de inóculo y patogencidad de los aisla-
mientos monopustulares de P. ho riana en crisantemo
var. ‘Indianápolis’. Dado que las pústulas colectadas en
cada localidad fueron de varios tamaños, la cantidad de te-
liosporas por mL obtenidas varió entre aislamientos. En los
aislamientos de La Lagunilla, Sta. Ana y Boyeros se estima-
ron “cero” teliosporas ya que en el área de conteo del hema-
citómetro no se observaron esporas (aunque fuera del área
de conteo ocasionalmente se observaron algunas, lo que in-
dicó que el nivel de inóculo fue extremadamente bajo, al
que de manera convencional se consideró como “cero”). En
contraste, en los aislamientos de Sn. Miguel Tlaixpan y Te-
petzingo el nivel de inóculo fue de hasta 14 000 teliosporas
por mL (Cuadro 3).
No hubo una relación directa entre el nivel de inóculo y
el periodo de incubación. Así, en aislamientos con bajos ni-
veles de inóculo inicial (de 0 a 320 teliosporas por mL, co-
mo fue el caso de La Lagunilla y Porfirio Díaz) se registra-
ron periodos de incubación relativamente cortos (19 d),
mientras que en aislamientos con niveles altos de inóculo
inicial (de 4000 a 8600 teliosporas por mL), los periodos de
incubación fueron más largos (39 a 44 d, para Coatepec de
Harinas y San Diego, por ejemplo).
Los primeros síntomas de infección (pústulas incipien-
tes, que consistieron en una mancha circular de color blanco
amarillento con una depresión o hundimiento) se manifesta-
ron a los 14 dpi en el aislamiento Sn. Miguel Tlaixpan, cuyo
inóculo inicial fue alto. Con los aislamientos Boyeros, La
Lagunilla y Porfirio Díaz, los primeros síntomas aparecie-
ron a los 19 dpi, a pesar de que el nivel de inóculo inicial
fue extremadamente bajo (“cero”) en los dos primeros, y en
Porfirio Díaz fue de sólo 320 teliosporas/mL, en compara-
ción con el resto de aislamientos del Estado de México. El
máximo contraste se observó entre aislamientos en los que
la manifestación de síntomas ocurrió entre los 39 y 49 dpi,
aún cuando el nivel de inóculo inicial fue muy superior, en
comparación con aquéllos en los que el estimado inicial-
mente fue de “cero” teliosporas (Cuadro 3).
Cuadro 3. Comportamiento patogénico de 16 aislamientos monopustulares de Puccinia horiana en plantas de crisantemo var. ‘Indianápolis’ crecida en
condiciones de invernadero.
Localidad y
Aislamiento
Inóculo inicial
(teliosporas/mL)£
Periodo de
incubación
(días)¥
Pústulas
incipientes€
Promedio de pústu-
las/planta§
Incidencia
final (%)ŧ
Región Occidente†
La Lagunilla 0Ψ 19 1 5.2 dce 100
Porfirio Díaz 320 19 1 3.7 dfe 90.9
Zumpango 660 44 1 1.6 gf 90.9
Sta. Ana 0 49 4 2.8 gfe 81.8
Coatepec Harinas 4000 39 2 19.9 a 100
Sta. Ma. Aranzazú 660 44 16 2.9 dgfe 90.9
Región Oriente†
Nativitas 6600 44 13 3.6 dfe 90.9
Sn. Diego 8600 44 15 8.2 c 100
SP. Isayo 6000 44 9 5.6 dc 100
Tequexquinahua 1320 39 5 7.9 c 100
Sn. M. Tlaixpan 14000 14 1 13.4 b 100
Boyeros 0 19 1 19.4 a 100
Morelos
Tepetzingo 14000 39 2 2.3 gf 90.9
Jiutepec 7320 44 2 1.1 g 81.8
Temixco 7200 39 1 3.1 dgfe 90.9
Puebla
Atlixco 1320 49 4 2.6 dgfe 100
†Regiones pertenecientes al Edo. de México. ΨNo se registraron teliosporas en el área de conteo del hemacitómetro, aunque estuvieron presentes en la suspen-
sión en muy baja densidad. £Teliosporas por mL obtenidas a partir de una pústula. ¥Número de días posteriores a la inoculación en que aparecieron las primeras
pústulas incipientes. €Número de pústulas incipientes (manchas cloróticas) como primer síntoma de infección. §Promedio de pústulas desarrolladas a los 49 d
posteriores a la inoculación (dpi). ŧIncidencia máxima alcanzada a los 49 dpi. Valores con la misma letra en cada columna no difieren significativamente (Tu-
key, 0.05).
VARIACIÓN PATOGÉNICA Y MOLECULAR DE PUCCINIA HORIANA Rev. Fitotec. Mex. Vol. 30 (3), 2007
228
Tampoco se observó una relación directa entre inóculo
inicial y número de pústulas desarrolladas por planta a los
49 dpi. Por ejemplo, el aislamiento Tepetzingo de Morelos
cuyo inóculo inicial fue tan alto como el de Sn. M. Tlaixpan
de Texcoco (14 000 teliosporas/mL), sólo presentó 2.3 pús-
tulas por planta, mientras que en las inoculadas con el ais-
lamiento de Sn. Miguel Tlaixpan en promedio se desarrolla-
ron 13.4 pústulas por planta (Cuadro 3). El máximo contras-
te se observó con el aislamiento Boyeros de Texcoco, el
cual con un nivel de inóculo inicial de “cero” indujo el de-
sarrollo de 19.4 pústulas/planta.
La incidencia final de plantas enfermas inducida por los
diferentes aislamientos de P. horiana, tampoco estuvo di-
rectamente relacionada con el nivel de inóculo inicial. Los
tres aislamientos (Boyeros, La Lagunilla y Sta. Ana) en los
que se estimó un nivel de inóculo inicial de “cero” teliospo-
ras/mL, presentaron 100, 100 y 81.8 % de incidencia. En
contraste, el aislamiento Jiutepec con un nivel alto de inócu-
lo inicial (7320 teliosporas/mL) indujo una incidencia simi-
lar a la de Sta. Ana (Cuadro 3).
Ensayo 1. Al comparar la virulencia de los aislamientos
por regiones y estados, se detectó que los provenientes del
Occidente y del Oriente del Estado de México fueron mu-
cho más virulentos que los colectados en los Estados de
Morelos y Puebla. El periodo de incubación promedio de
los dos primeros grupos de aislamientos en plantas de la var.
‘Indianápolis’ fue de 15 d, mientras que Morelos y Puebla
requirieron de 3 y 4 días más para que indujeran las pústulas
incipientes. La tendencia en los tres cultivares restantes fue
similar; los dos primeros grupos de aislamientos se compor-
taron como los más virulentos (Cuadro 4). El tiempo reque-
rido para alcanzar la máxima incidencia (100 % de plantas
enfermas) en la var. ‘Indianápolis’ fue de sólo 4 d después
de aparecer los primeros síntomas, para los aislamientos de
las regiones Occidente y Oriente del Estado de México. En
cambio, para los aislamientos de los Estados de Morelos y
Puebla se requirieron 5 y 6 d más (Cuadro 4). Los cuatro
grupos de aislamientos alcanzaron 100 % de incidencia en
las vars. ‘Indianápolis’ y ‘Harman’, mientras que en la var.
‘Vikyngo’ sólo el grupo de la región Occidente alcanzó 100
% de incidencia; en la var. ‘Eleonora’ el grupo de aislamien-
tos con el mayor grado de incidencia fue el de la región
Oriente, con 93.3 % (Cuadro 4). Las plantas de la var.
‘Marble’ no presentaron síntomas con ninguno de los cuatro
grupos de aislamientos.
Se detectaron diferencias significativas en la producción
de basidiosporas entre los grupos de aislamientos prove-
nientes de las distintas regiones; la mayor liberación se re-
gistró a los 40 dpi (Cuadro 5). Los grupos del Occidente y
Oriente del Edo. de México se comportaron de manera simi-
lar y fueron los que más basidiosporas liberaron (539 y 977
basidiosporas/0.25 cm2, respectivamente), en comparación
con los grupos de Morelos y de Puebla; entre los primeros,
solamente a los 20 dpi hubo diferencia en el conteo realiza-
do. En contraste, los aislamientos de Morelos y de Puebla
liberaron un número significativamente bajo de basidiospo-
ras (76 y 47 basidiosporas/0.25 cm2, respectivamente), sin
diferencia entre ellos.
En general, se observó que el grupo de aislamientos de
Occidente y de Oriente fueron los que indujeron la mayor
severidad en las cuatro variedades que presentaron daño
(‘Indianápolis’, ‘Harman’, ‘Vikyngo’ y ‘Eleonora’), con un
rango de severidad que varió de 22.8 a 37.1 %, y entre ellos
no hubo diferencias (Cuadro 5). En cambio, el grupo de ais-
lamientos provenientes de los Estados de Morelos y Puebla,
causaron un daño significativamente menor en dichas varie-
dades (5.7 a 8.5 % y 4.2 a 7.3 %) y fueron similares entre
ellos. En las condiciones en las que se hizo el ensayo, la var.
‘Marble’ no mostró síntomas de infección ni de coloniza-
ción con ninguno de los aislamientos de P. horiana (Cuadro
5).
En las vars. ‘Indianápolis’ y ‘Vikyngo’ el periodo pro-
medio de incubación fue 16 d para los diferentes aislamien-
tos de P. Horiana, mientras que en ‘Eleonora’ requirió 3 d
más (19.4 d). En la var. ‘Harman’ fue de hasta 21.2 d, y la
var. ‘Marble’ no mostró síntomas de la enfermedad durante
la evaluación (Cuadro 6). Aunque en el número de pústulas
incipientes no hubo diferencia estadística entre cultivares,
‘Indianápolis’ tuvo menor número (cinco) que ‘Harman’
(seis). ‘Indianápolis’ y ‘Harman’ alcanzaron 100 % de inci-
dencia a los 4.4 y 7.6 d, respectivamente, después de apare-
cer los primeros síntomas, mientras que en ‘Vikyngo’ y
‘Eleonora’ la incidencia máxima fue del 96 y 81 % a los 8.6
y 8.7 d, respectivamente. La severidad mostrada por ‘Indi-
anápolis’, ‘Vikyngo’, ‘Harman’ y ‘Eleonora’ fue estadísti-
camente similar, aunque ‘Indianápolis’ presentó mayor daño
(29 %) que ‘Eleonora’ (18.9 %).
Ensayo 2. En’Vikyngo’ los aislamientos de las regiones
Occidente y Oriente tuvieron el menor tiempo de incuba-
ción, con una diferencia de 2.5 d entre ellos, y tuvieron el
mayor número de pústulas incipientes. El grupo del Occi-
dente fue el que a los 26 dpi indujo 100 % de incidencia,
seguido del grupo de la región oriente (Cuadro 7). Los gru-
pos del Estado de Morelos y de Puebla tuvieron un compor-
tamiento similar en periodo de incubación y número de pús-
tulas incipientes, pero el de Morelos alcanzó más rápida-
mente (38 d) la máxima incidencia (86.6 %) que el de Pue-
bla (40 d y 60 %). El desarrollo de la enfermedad en ‘Mar-
ble’ fue más lento; a todos los aislamientos les llevó mayor
tiempo inducir la expresión de síntomas (de 29 a 31 d); el
número de pústulas incipientes varió de 3 a 7 y la máxima
incidencia (60 a 70 %) se alcanzó a los 40 dpi en todos los
casos. Con la excepción del grupo de Puebla que no causó
infección en ‘Marble’, los tres grupos restantes tuvieron un
comportamiento similar.
GARCÍA, ZAVALETA, ROJAS, LEYVA, FUENTES Y SIMPSON Rev. Fitotec. Mex. Vol. 30 (3), 2007
229
Basidiosporas capturadas y severidad. Al igual que en
el Ensayo 1, la producción de basidiosporas varió significa-
tivamente entre los grupos de aislamientos provenientes de
las distintas regiones. La mayor liberación se registró a los
40 dpi (Cuadro 8). Los grupos de Oriente y Occidente fue-
ron los que más basidiosporas liberaron (54.4 y 40.6 basi-
diosporas/0.25 cm2, respectivamente), en comparación con
los grupos de Morelos y Puebla. Los aislamientos de Occi-
dente y Oriente del Estado de México también fueron los
más virulentos en las vars. ‘Vikyngo’ y ‘Marble’, con un
rango de severidad que varió de 0.2 a 19 %, pero sin dife-
rencias entre ellos. En contraste, los aislamientos provenien-
tes de Morelos y Puebla causaron menor daño en ‘Vikyngo’
y el aislamiento de Puebla fue incapaz de infectar a ‘Mar-
ble’. La var. ‘Vikyngo’ mostró mayor severidad e incidencia
final de la enfermedad que ‘Marble’ (Cuadro 9), lo que
confirma su alta susceptibilidad a la roya blanca.
Polimorfismo del ADN. Mediante el análisis de RAPD
con los iniciadores aleatorios OPA-05, OPA-08, OPA-13 y
OPA-19, y el análisis con MP-PCR con los iniciadores
(GATA)4 y (GACA), se obtuvieron polimorfismos. Al com-
binar estas dos técnicas (RAMP) se obtuvo un mayor núme-
ro de polimorfimos que con cada técnica por separado. El
tamaño de los productos amplificados en general fue menor
a 1000 pb. El dendrograma generado por el coeficiente SM
y el método UPGMA basado en 76 bandas obtenidas de los
16 aislamientos (Figura 1) identificó tres grupos (a, b y c) a
una distancia génica entre 0.7 y 0.8. Tales grupos corres-
pondieron exactamente al origen de los aislamientos; así el
grupo a correspondiente al Estado de Puebla se separó
completamente del resto de aislamientos con una robustez
de 100 %. El grupo b se conformó con los aislamientos pro-
venientes de Morelos (Tep-Mor, Tem-Mor y Jiu-Mor) con
una robustez de 48 %, donde los dos primeros mostraron
mayor cercanía. En el grupo c quedaron incluidos los aisla-
mientos del Estado de México de la región Occidente (CH,
Ara, SA, PD, Zum y Lag) y de la Oriente (Boy, Nat, SMT,
SD, Teq y SPI). El rango de temperatura media que prevale-
ce en las localidades del Edo. de México es más bajo (13.5 a
17.2 ºC), que en Morelos (20.7 y 22.9 ºC) y Puebla (22.2
ºC), como se muestra en el Cuadro 1.
Cuadro 4. Comportamiento patogénico de Puccinia horiana en plantas de cinco variedades de crisantemo crecidas en condiciones de invernadero.
Cultivar Origen de los
aislamientos por región y estado
Periodo de
incubación
(días)£
Número de pústulas
incipientes§
Días a la
máxima
incidencia€
Incidencia
final (%)¥
Región Occidente 15 4.8 19 100
Región Orientev 15.5 7.1 19.5 100
Morelos 18 3.6 23 100
‘Indianápolis’
Puebla 19 3 25 100
Región Occidente 22 6 32.3 100
Región Oriente 19 3.5 28.2 100
Morelos 23 2 32 100
‘Harman’
Puebla 25 2 37 100
Región Occidente 15 7.1 22.5 100
Región Oriente 15.5 4.5 23.5 96.6
Morelos 19 2.6 29 93.3
‘Vikyngo’
Puebla 19 3 34 80
Región Occidente 19.6 5.2 30 73.3
Región Oriente 17.5 7.2 23 93.3
Morelos 21 3 31 73.3
‘Eleonora’
Puebla 25 3 40 80
Región Occidente 0 0 0 0
Región Oriente 0 0 0 0
Morelos 0 0 0 0
‘Marble’
Puebla 0 0 0 0
†Regiones pertenecientes al Estado de México. £Tiempo promedio en días posteriores a la inoculación (dpi) en los que aparecieron las pústulas incipientes.
§Número de pústulas incipientes promedio por planta en cada grupo de aislamientos. €Número de dpi en alcanzar la máxima incidencia por origen de aislamien-
tos. ¥Incidencia final alcanzada por grupo.
VARIACIÓN PATOGÉNICA Y MOLECULAR DE PUCCINIA HORIANA Rev. Fitotec. Mex. Vol. 30 (3), 2007
230
Cuadro 5. Severidad y basidiosporas liberadas en plantas de cinco variedades de crisantemo, por 16 aislamientos de Puccinia horiana provenientes de
los Estados de México, Morelos y Puebla.
Basidiosporas capturadas£ en 0.25 cm2 Severidad (%) Contrastes por grupos¥
de acuerdo a su origen 20 30 40 ‘Indianápolis’ ‘Harman’ ‘Vikyngo’ ‘Eleonora’ ‘Marble’
1) Reg. Occ.€ vs. Reg. Ori. € 3.2 vs 2.6ŧ* 64.2 vs 73.4 539.5 vs 977.4 35.7 vs 37.1 28.9 vs 30.4 35.5 vs 34.1 22.9 vs 24.2 0 vs 0
2) Reg. Occ. vs. Morelos 3.2 vs 2.0* 64.2 vs 5.3** 539.5 vs 76.5** 35.7 vs 7.7** 28.9 vs 7.0** 35.5 vs 8.5** 22.9 vs 5.7** 0 vs 0
3) Reg. Occ. vs .Puebla 3.2 vs 1.2* 64.2 vs 1.6** 539.5 vs 47.2** 35.7 vs 5.7** 28.9 vs 6.7* 35.5 vs 7.3* 22.9 vs 4.2** 0 vs 0
4) Reg. Ori. vs. Morelos 2.6 vs 2.0 73.4 vs 5.3** 977.4 vs 76.5** 37.1 vs 7.7** 30.4 vs 7.0** 34.1 vs 8.5** 24.2 vs 5.7** 0 vs 0
5) Reg. Ori. vs. Puebla 2.6 vs 1.2 73.4 vs 1.6** 977.4 vs 47.2** 37.1 vs 5.7** 30.4 vs 6.7* 34.1 vs 7.3* 24.2 vs 4.2** 0 vs 0
6) Puebla vs. Morelos 1.2 vs 2.0 1.6 vs 5.3 47.2 vs 76.5 5.7 vs 7.7 6.7 vs 7.0 7.3 vs 8.5 4.2 vs 5.7 0 vs 0
¥Aislamientos agrupados por región y Estado para contrastes. €Región Occidente y Oriente pertenecientes al Estado de México.
£Basidiosporas capturadas a los 20, 30 y 40 d posteriores a la inoculación. ŧDiferencia significativa (*); diferencia altamente significativa (**) entre las medias
del contraste (P ≤ 0.05).
Cuadro 6. Respuesta de plantas de cinco variedades de crisantemo a 16 aislamientos de Puccinia horiana en condiciones de invernadero.
Variedad Periodo de incubación
(días)£
Número de pústulas
incipientes€
Días a máxima incidenciaΨ Incidencia final
(%)¥
Severidad
(%)
‘Harman’ 21.2 a 6.2 a 28.8 a 100 a 23.9 a
‘Eleonora’ 19.4 a 5.4 a 28.2 a 81.2 b 18.9 a
‘Vikyngo’ 16.2 b 5.4 a 24.8 ab 96.2 a 28.1 a
‘Indianápolis’ 16.0 b 5.1 a 20.4 b 100 a 29.1 a
‘Marble’ 0 c 0 b 0 c 0 c 0 b
£Número de días posteriores a la inoculación (dpi) en que se manifestaron las primeras pústulas incipientes. €Pústulas incipientes al primer registro de evalua-
ción. ΨNúmero de dpi en alcanzar la máxima incidencia. ¥Incidencia alcanzada 40 dpi. Valores con la misma letra en cada columna no difieren significativa-
mente (Tukey, 0.05).
Cuadro 7. Comportamiento patogénico de los grupos de aislamientos de Puccinia horiana en cada variedad de crisantemo con plantas crecidas en
condiciones de invernadero.
Variedad
Origen de los aislamientos por re-
gión y estado
Periodo de incubación
(días)€
Número de pústulas
incipientesΨ
Días a máxima
incidencia¥
Incidencia
final (%)§
Región Occidente£ 17 10.2 26 100
Región Oriente 19.5 8.3 28.5 100
Morelos 25 2.3 38 86.6
‘Vikyngo’
Puebla 25 2 40 60
Región Occidente 30.4 7.4 40 60
Región Oriente 29.5 5 40 70
Morelos 31.2 3 40 60
‘Marble’
Puebla 0 0 0 0
£Regiones pertenecientes al Estado de México. €Número de días posteriores a la inoculación (dpi) en los que se manifestaron las primeras pústulas incipientes.
ΨNúmero de pústulas incipientes promedio por planta. ¥Número promedio de dpi en alcanzar la máxima incidencia. §Incidencia final alcanzada.
GARCÍA, ZAVALETA, ROJAS, LEYVA, FUENTES Y SIMPSON Rev. Fitotec. Mex. Vol. 30 (3), 2007
231
Cuadro 8. Producción de inóculo y severidad inducida por 16 aislamientos de Puccinia horiana (agrupados por estado y región) en dos variedades de
crisantemo crecidas en condiciones de invernadero.
Contrastes por grupos£
de acuerdo a su origen
Basidiosporas capturadasΨ
en 0.25 cm2
Severidad (%)
20 30 40 ‘Vikyngo’ ‘Marble’
1) Reg. Occ. € vs. Reg. Ori. € 0 vs. 3.2*ŧ 20 vs. 27.4 40.6 vs. 54.4* 19 vs. 15.9 0.2 vs. 0.2
2) Reg. Occ. vs. Morelos 0 vs. 0.3 20 vs. 1.5* 40.6 vs. 10.5* 19 vs. 6* 0.2 vs. 0.1
3) Reg. Occ. vs. Puebla 0 vs. 1 20 vs. 0.8* 40.6 vs. 13.4* 19 vs. 0.82* 0.2 vs. 0
4) Reg. Ori. vs. Morelos 3.2 vs. 0.3* 27.4 vs. 1.5**ŧ 54.4 vs. 10.5** 15.9 vs. 6* 0.2 vs. 0.1
5) Reg. Ori. vs. Puebla 3.2 vs. 1.0 27.4 vs. 0.8* 54.4 vs. 13.4* 15.9 vs. 0.8* 0.2 vs. 0
6) Puebla vs. Morelos 1 vs. 0.3 1.5 vs. 0.8 10.5 vs. 13.4 6 vs. 0.8 0 vs. 0.1
£Aislamientos agrupados por región y estado para contrastes. €Región Occidente y Oriente pertenecientes al Estado de México. ΨBasidiosporas capturadas a los
20, 30 y 40 d posteriores a la inoculación. ŧDiferencia significativa (* P ≤ 0.05) y altamente significativa (**P ≤ 0.01) entre las medias del contraste.
Cuadro 9. Respuesta de dos variedades de crisantemo a 16 aislamientos de Puccinia horiana en condiciones de invernadero.
Variedad Periodo de incu-
bación (días)£
Número de pústulas
incipientes€
Días a máxima incidenciaΨ Incidencia
final¥
(%)
Severidad
(%)
‘Vikyngo’ 19.9 b§ 13.2 a 29.0 b 95.0 a 14.7 a
‘Marble’ 30.2 a 5.8 b 40.0 a 62.5 b 0.5 b
£Número de días posteriores a la inoculación (dpi) en los que se manifestaron las primeras pústulas incipientes. €Pústulas incipientes al primer registro de eva-
luación. ΨNúmero de dpi en alcanzar la máxima incidencia. ¥Incidencia alcanzada a 40 dpi. §Valores con la misma letra en cada columna no difieren significati-
vamente (Tukey, 0.05).
Figura 1. Dendrograma que muestra la disimilaridad de 16 aislamientos de Puccinia horiana colectados en el Estado de México región Occidente: La
Lagunilla (Lag-Occ), Porfirio Díaz (PD-Occ), Coatepec Harinas (CH-Occ), Zumpango (Zum-Occ), Sta. Ma. Aranzazú (Ara-Occ), Sta. Ana (SA-Occ) y
región Oriente: Nativitas (Nat-Ori), Tequexquinahua (Teq-Ori), Sn. Miguel Tlaixpan (SMT-Ori), Sn. Diego (SD-Ori), Sn. Pablo Izayo (SPI-Ori), Boye-
ros (Boy-Ori); Estado de Morelos: Tepetzingo (Tep-Mor), Jiutepec (Jiu-Mor) y Temixco (Tem-Mor); y el Estado de Puebla: Atlixco (Atl-Pue).
Test=Planta de crisantemo sin P. h or ian a
0.49 0.61 0.74 0.86 0.99
Tes t
CH-Occ
Boy-Ori
Ara-Occ
SA-Occ
Nat-Ori
SMT-Ori
SD-Ori
PD-Occ
Zum-Occ
Teq -Ori
Lag-Occ
SPI-Ori
Tep -Mor
Tem- Mor
Jiu-Mor
Atl-Pue
Coeficiente de disimilaridad
VARIACIÓN PATOGÉNICA Y MOLECULAR DE PUCCINIA HORIANA Rev. Fitotec. Mex. Vol. 30 (3), 2007
232
DISCUSIÓN
Durante de incremento de inóculo en plantas de la var.
‘Indianápolis’ no se detectó relación directa entre el nivel de
inóculo aplicado y el desarrollo de la enfermedad inducida
por cada aislamiento de P. horiana. Así, los aislamientos
con bajos niveles de inóculo inicial (de escasa presencia de
esporas, convencionalmente denominada “cero”, a 320 te-
liosporas por mL), presentaron periodos de incubación rela-
tivamente cortos (19 d), con alto número de pústulas por
planta a los 49 dpi, e incidencias finales de 82 a 100 %. Esto
sugiere que las diferencias en el desarrollo de la roya blanca
en plantas del crisantemo ‘Indianápolis’ inducido por los
aislamientos, se podrían deber a diferencias en patogenici-
dad inherentes a cada aislamiento con base en su origen
geográfico. Según Firman y Martin (1968), las diferencias
en agresividad y virulencia de P. horiana se explican por
diferencias en su origen geográfico.
Los aislamientos colectados en el Estado de México
fueron los más virulentos, sobre todo los de Coatepec Hari-
nas, Boyeros y Sn. Miguel Tlaixpan, pues requirieron pe-
riodos de incubación más cortos, indujeron mayor número
de pústulas por planta (19.9, 19.4 y 13.4, respectivamente) y
produjeron 100 % de incidencia (Cuadro 3). Así mismo, la
mayor capacidad reproductiva, inferida por el número de
basidiosporas capturadas, la presentaron los aislamientos
colectados en el Estado de México. El número de basidios-
poras liberadas estuvo directamente relacionado con la se-
veridad, pues a mayor cantidad de basidiosporas capturadas
fue mayor la severidad de la roya blanca en las variedades
de crisantemo (Cuadros 5 y 8). Estas diferencias de poten-
cial reproductivo entre aislamientos son otra evidencia de la
variación genética entre ellos; el potencial reproductivo
puede influir en la habilidad competitiva del patógeno (Mar-
tens y Dyck, 1989; Shaner et al., 1992). La estrecha relación
entre el nivel inóculo de P. horiana y la severidad, también
fue reportada por Rodríguez-Navarro et al. (1996) en la var.
‘Spider’, con un coeficiente de determinación (R2) de 0.95.
Estos mismos autores capturaron 63 basidiosporas en 0.25
cm2 en 24 h de exposición de la trampa en campo; en cam-
bio, García et al. (2005), en invernadero contabilizaron has-
ta 1086 basidiosporas en la misma superficie de conteo y
con en el mismo tiempo de exposición. Por tanto, se infiere
que el potencial reproductivo de P. horiana varía entre ais-
lamientos en función de su origen, de la variedad hospedan-
te y de las condiciones ambientales prevalecientes durante
el desarrollo de la enfermedad.
También se evidenció variación en la susceptibilidad a la
roya blanca entre las variedades de crisantemo. Al conside-
rar las variables periodo de incubación, tiempo a máxima
incidencia final, incidencia y severidad, se deduce que ‘In-
dianápolis’ fue la variedad más susceptible, seguida por
‘Vikyngo’, ‘Harman’ y ‘Eleonora’ (Cuadro 6). En ‘Marble’
el desarrollo de la enfermedad fue mucho más lento y la in-
cidencia final fue la más baja (Cuadro 7), además de ser la
única variedad en la que el aislamiento menos virulento
(Atl-Pue) no indujo síntomas visibles de infección.
El hecho de que en el primer ensayo no hubo evidencia
de la infección en ‘Marble’ por P. horiana (Cuadro 4), po-
dría deberse a las condiciones de temperatura (14-26 °C) y
humedad (91.8 al 100 %) que prevalecieron durante este
ensayo. En el segundo ensayo, donde ‘Marble’ fue afectado
por la roya blanca, la temperatura varió de 19 a 28 °C y la
HR fluctuó de 70 a 100 %; en estas condiciones, los aisla-
mientos del Estado de México y de Morelos indujeron sín-
tomas prácticamente imperceptibles en la var. ‘Marble’, que
presentó valores de severidad de 0.25 y 0.10 respectivamen-
te (Cuadro 8). Según Whipps (1993), las diferencias en los
rangos de temperatura en los que germinan los aislamientos
de P. horiana, podrían relacionarse con requerimientos es-
pecíficos de algunas razas.
Redemaker y de Jong (1987) consideran que las varie-
dades de crisantemo con resistencia completa no desarrollan
ningún síntoma macroscópico visible, y que tal resistencia
es controlada por un sólo gen dominante, por lo que existe
el riesgo de rompimiento de la resistencia por nuevos genes
virulentos del patógeno. Sin embargo, este tipo de resisten-
cia se ha conservado por 12 años en Holanda. En cultivares
con resistencia incompleta, el desarrollo de P. horiana tiene
lugar sólo bajo fuerte presión de inóculo, y esta resistencia
parece estar conferida por varios genes. Las vars. ‘Guyana’
y ‘Taffeta’ presentan resistencia incompleta (Firman y Mar-
tin 1968), mientras que ‘Ozenda white’, ‘Pesaro white’, ‘Pi-
doul’, ‘Tasman’, ‘Tom Pearse’ y ‘Veria Dark’ son conside-
radas inmunes (Wojdyla, 1999).
Las diferencias en tiempo de incubación de Uromyces
appendiculatus (Pers.:Pers.) Unger en variedades de frijol
(Phaseolus vulgaris L.), se ha relacionado con la resistencia
propia de cada variedad (Edington et al., 1994). También
Patterson et al. (1957) señalan que el periodo de incubación,
frecuencia y tamaño de pústulas, así como el tipo de reac-
ción a Puccinia graminis f. sp. tritici es una respuesta de la
resistencia inherente a la variedad de planta y no por efecto
de las razas. Cuando diversas variedades son inoculadas con
un mismo aislamiento, las diferencias varietales en la res-
puesta a la inoculación puedan atribuirse a diferencias en
susceptibilidad entre ellas. Sin embargo, cuando una varie-
dad responde de manera diferente a la inoculación con ais-
lamientos provenientes de diferentes regiones, las diferen-
cias en periodo de incubación y frecuencia de pústulas pue-
den más bien atribuirse a variaciones en patogenicidad in-
herentes a los aislamientos de P. h ori an a. En resumen, el
desarrollo de la enfermedad estará determinado tanto por las
características inherentes del patógeno y del hospedante,
como por las condiciones ambientales.
GARCÍA, ZAVALETA, ROJAS, LEYVA, FUENTES Y SIMPSON Rev. Fitotec. Mex. Vol. 30 (3), 2007
233
En el análisis polimórfico del ADN de los aislamientos,
los grupos resultantes se conformaron de acuerdo con el lu-
gar de procedencia de los mismos. Los aislamientos del Oc-
cidente y Oriente del Estado de México formaron un solo
grupo (c), que correspondió al de mayor virulencia (Cua-
dros 5 y 8, Figura 1). La estrecha relación entre los aisla-
mientos de la región Oriente y Occidente podría en parte
explicarse por el constante movimiento de material vegeta-
tivo de crisantemo entre ambas regiones. El grupo b se con-
formó por los aislamientos Tep-Mor, Tem-Mor y Jiu-Mor,
originarios del Estado de Morelos; pero el de Jiu-Mor se
separó de los otros dos, lo que coincide con su menor grado
de virulencia, ya que tan solo presentó 1.1 pústulas en pro-
medio y la máxima incidencia que indujo fue de 81.8 %. El
grupo a lo conformó el aislamiento de Puebla (Atl-Pue), se-
parado completamente del resto y se caracterizó por poseer
una virulencia extremadamente baja.
La relación entre virulencia y similaridad genética de
aislamientos se ha demostrado en múltiples trabajos, tanto
de royas como de otros hongos fitopatógenos. No obstante,
debe hacerse hincapié en que las variaciones detectadas en
el ADN de los aislamientos, no necesariamente son las res-
ponsables de los cambios en virulencia. Por ejemplo, Chen
et al. (1995) encontraron una relación baja entre virulencia
y polimorfismo del ADN de aislamientos de Puccinia estrii-
formis Westend. Burdon y Roelfs (1985) tampoco encontra-
ron asociación entre virulencia y polimorfismo en poblacio-
nes de reproducción sexual de P. graminis Pers.:Pers. tritici
Eriks. y E. Henn. En cambio, al evaluar , la severidad de la
infección por Magnaporthe grisea (T. T. Hebert) M. E. Barr
en arroz (Oryza sativa L.), se encontró una alta relación en-
tre la virulencia de aislamientos y la variación a nivel de
ADN (Levy et al., 1993).
Los presentes resultados con P. horiana claramente indi-
caron que el agrupamiento en el dendrograma por origen
geográfico (Figura 1), correspondió exactamente al agru-
pamiento de aislamientos con base en su virulencia (Cua-
dros 5 y 8). La agrupación por origen geográfico ha sido
reportada por varios autores en diferentes patógenos (Tus-
kan et al., 1990; Guthie et al., 1992; González-Chavira et
al., 1998). Esto puede deberse a que más de un gen, posi-
blemente muchos, estén involucrados en las reacciones de
adaptación a diversas condiciones climáticas (Miles y Len-
né, 1984). En P. hor ia na, la agrupación de los aislamientos
por área geográfica con base en los análisis de ADN fue
evidente en este estudio, lo que sugiere que las condiciones
geográficas, manejo del cultivo y variedades de crisantemo
en cada región influyen en la variabilidad de P. h or ia na.
Los aislamientos del hongo Colletotrichun lindemut-
hianum (Sacc. y Magnus) Lams.-Scrib. en frijol analizados
por RAPD y AFLP también se agruparon en función de su
origen geográfico (González-Chavira et al., 1998). En ais-
lamientos de Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz.
y Sacc. obtenidos tanto de papaya (Carica papaya L.) como
de aguacate (Persea americana Mill.) y analizados por
RAPD, se agruparon en primera instancia en función del
área geográfica, y luego por el tipo de síntomas que produ-
cían (Casarrubias–Carrillo et al., 2003).
CONCLUSIONES
Los aislamientos de Puccinia horiana del Estado de
México, tanto de la región Occidente como la del Oriente,
fueron más virulentos que los de los Estados de Morelos y
Puebla. Destacan los aislamientos de Coatepec Harinas y
Boyeros de las regiones Occidente y Oriente, respectiva-
mente, los cuales formaron un nodo separado en el dendo-
grama. En contraste, los aislamientos Jiutepec de Morelos y
Atlixco de Puebla fueron los menos virulentos y formaron
un nodo diferente en el dendrograma. Las diferencias en vi-
rulencia entre los 16 aislamientos se reflejaron en el análisis
de ADN.
BIBLIOGRAFÍA
Agrios G N (2005) Plant Pathology. Academic Press, New York, USA.
992 p.
Adams D, J Kim, R Jensen, M Les, E D Slice, J Walker (2000)
NTSYSpc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis Sys-
tem Version 2.10p. Exeter Software, New York, USA.
(http://www.ExeterSoftware.com) (Enero, 2005).
Ahrens U, E Seemϋller (1992) Detection of ADN of plant pathogenic my-
coplasmalike organisms by a polymerase chain reaction that am-
plifies a sequence of the 16S rRNA gene. Phytopathology 82:828-
832.
Alexopoulos C J, C W Mims (1985) Introducción a la Micología. Ed.
Omega, S.A. Barcelona, España. 638 p.
Anikster Y, I Wahl (1979) Coevolution of the rust fungi on graminea and
Liliaceae and their hosts. Annu. Rev. Phytopathol. 17:367-403.
Burdon J J, A P Roelfs (1985) The effect of sexual and asexual reproduc-
tion on the isozyme structure of populations of Puccinia graminis.
Phytopathology 75:1068-1073.
Casarrubias-Carrillo U, M M González-Chavira, A Cruz-Hernández,
E Cárdenas-Soriano, D Nieto-Ángel, R G Guevara-González
(2003) Variabilidad genética de Colletotrichum gloeosporioides
(Penz.) Penz. y Sacc. aislado de frutos de papayo (Carica papaya
L.) mediante el uso de marcadores moleculares RAPD. Rev. Mex.
Fitopatol. 21:338-345.
Chen X M, R F Line, H Leung (1995) Virulence and polymorphyc DNA
relationships of Puccinia striiformis f. sp. hordei to other rusts.
Phytopathology 85:1335-1342.
Edington B R, P E Shanahan, F H J Rijkenberg (1994) Breeding for
partial resistence in dry beans (Phaseolus vulgaris) to bean rust
(Uromyces appendiculatus). Ann. Appl. Biol. 125:601-605.
Firman I D, P H Martin (1968) White rust of chrysanthemums. Ann.
Appl. Biol. 62:429-442.
García V R, E Zavaleta-Mejía, R I Rojas Martínez, S G Leyva Mir, J
Simpson, G Fuentes Davila (2005) Antagonismo de Cladospo-
rium sp. contra Puccinia horiana Heen. causante de la roya blanca
del crisantemo (Dendranthema grandiflora Tz ve lev. ). R ev. M ex.
Fitopatol. 23:79-86.
González-Chavira M, R Rodríguez, M E Zavala, J L Jacobo, F Her-
nández , J Acosta, O Martínez, J Simpsom (1998) Characteriza-
tion of mexican isolates of Colletotrichum lindemuthianum by
using differential cultivars and molecular markers. Phytopathol-
ogy 88:292-299.
Guthie P A I, C W Magill, R A Frederiksen, G N Odvody (1992) Ran-
dom amplified polymorphic DNA markers: A system for
VARIACIÓN PATOGÉNICA Y MOLECULAR DE PUCCINIA HORIANA Rev. Fitotec. Mex. Vol. 30 (3), 2007
234
identifying and differentiating isolates of Colletotrichum gramini-
cola. Phytopathology 82:832-835.
Hiratsuka Y, S Sato (1982) Morphology and Taxonomy of rust fungi. In:
The Rust Fungi. K J Scout, A K Chakravorty (eds). Academic
Press, London. pp:1-35.
Kolmer J A, J Q Liu, M Seis (1995) Virulence and molecular polimor-
phism in Puccinia recondita f. sp. tritici in Canada. Phytopathol-
ogy 85:276-285.
Krebs K E (1985) Chrysanthemum white rust can be controlled. Gartner-
börse und Gartenwelt 3:69-73.
Lannou C (2001) Intrapathotype diversity for aggressiveness and pathogen
evolution in cultivar mixtures. Phytopathology 91:1851-1857.
Levy M, F J Correa-Victoria, R S Zeigler, S Xu, J E Hamer (1993) Ge-
netic diversity of the rice blast fungus in a disease nursery in Co-
lombia. Phytopathology 83:1427-1433.
Leyva-Mir S G, I Lora Trejo, E Cárdenas Soriano, G Valdovinos Ponce
(2001) Pathogenesis of white rust Puccinia horiana Henn. on a
chrysanthemum [Chrysanthemum morifolium (Ramat.) Hemsl.
susceptible variety]. Rev. Mex. Fitopatol. 29:191-196.
Martens J W, L P Dyck (1989) Genetics of resistance to rust in cereals
from a Canadian perspective. Can. J. Plant Pathol. 11:78-85.
Miles J W, M J Lenne (1984) Genetic variation within a natural Stylosan-
thes guinensis, Colletotrichum gloeosporioides host-pathogen
population. Austr. J. Agric. Res. 35:211-218.
Nelson R J, M R Baraoidan, C M Vera Cruz, I V Yap, J E Leach , T W
Mew, H Leung (1994) Relation between phylogeny and patho-
type for the bacterial blight pathogen of rice. Appl. Env. Micro-
biol. 60:3275-3283.
Patterson F L, R G Shands, J G Dickson (1957) Temperature and sea-
sonal effects on seedling reactions of barley varieties to three
races of Puccinia graminis f. sp. tritici. Phytopathology 47:395-
402.
Redemaker W, J de Jong (1987) Types of resistence to Puccinia horiana
in chrysanthemum. Acta Hort. 197:85-88.
Rodríguez-Navarro J A, E Zavaleta-Mejía, R Alatorre-Rosas (1996)
Epidemiología y manejo de la roya blanca (Puccinia horiana P.
Heen.) del crisantemo (Dendranthema grandiflora Tzvelev). Fito-
patología 31:122-132.
SAS Institute (1999) SAS user´s guide, version 8. SAS Institute. Cary,
NC, USA.
Shaner G, E L Stromberg, G H Lacy, K R Barker, T P Pirone (1992)
Nomenclature and concepts of pathogenicity and virulence. Annu.
Rev. Phytopathol. 30:47-66.
Skylakakis G (1987) Changes in the composition of pathogen populations
caused by resistance to fungicides. In: Populations of Plant Patho-
gens, Their Dynamics and Genetics. S M Wolfe, E C Caten (eds).
Blackwell Scientific Publications. London, England pp: 227-237
Tuskan G A, J A Walla, J E Lundquist (1990) Genetic geographic varia-
tion in Peridermium harknessii in the north-central United Sates.
Phytopathology 80:857-861.
Whipps J M (1993) A review of white rust (Puccinia horiana Henn.) dis-
ease on chrysanthemum and the potencial for its biological control
with Verticillium lecanii (Zimm.) Viégas. Ann. Appl. Biol.
122:173-187.
Wilcox D, B Dove, D McDavid, D Greer (2002) ImageTool for Windows
version 3.0. The University of Texas Health Science Center in San
Antonio. San Antonio, Texas, USA.
Wojdyla A T (1999) Susceptibility of chrysanthemum cultivars to Puccinia
horiana. Folia Hort. 11:115-122.
Zhan J, C C Mundt, B A MacDonal (1998) Measuring immigration and
sexual reproduction in field populations of Mycosphaerella
graminicola. Phytopathology 88:1330-1337.
