En México a pesar de poseer una elevada diversidad biológica, aún son pocos los
estudios encaminados a valorar su potencial biotecnológico. La prospección de la riqueza fúngica nativa en la búsqueda de enzimas de importancia biotecnológica es una actividad prioritaria ante la constante pérdida de la biodiversidad de los ecosistemas locales. Asimismo, la búsqueda de enzimas ligninolíticas con aplicación en biotecnología ambiental, podría ser la plataforma para ofrecer soluciones a problemas como la contaminación del suelo y agua por herbicidas, en donde la contaminación por atrazina representa el problema principal en numerosas zonas agrícolas del país. Ante este escenario, el objetivo central de este trabajo fue evaluar el uso de co-cultivos fúngicos de especies nativas en la producción de enzimas con potencial para la biorremediación de un suelo contaminado con atrazina. El objetivo central se abordó en cuatro etapas experimentales sucesivas. En la primera se colectaron y aislaron hongos macroscópicos ligninolíticos (HML) de diversos ecosistemas del estado de Veracruz. En total se aislaron 47 cepas nativas; mediante pruebas cualitativas para la detección de actividad lacasa y manganeso peroxidasa (MnP), se efectuó una selección de las cepas para los ensayos subsecuentes. Los aislamientos se identificaron taxonómicamente mediante las características macro y microscópicas de sus basidiocarpos, solo se identificó a nivel
molecular la especie Trametes maxima, debido a su importancia en el desarrollo de la mayoría de los experimentos. Los hongos microscópicos de suelo (HMS) empleados para el desarrollo de los co-cultivos, se obtuvieron del Laboratorio de Micromicetos del Instituto de Ecología A. C. De todas las especies reactivadas y empleadas en este estudio, únicamente se corroboró la identidad de Paecilomyces carneus a través de biología molecular. En la segunda etapa se evaluó la tolerancia a la atrazina en HML y HMS a través de bioensayos dosis respuesta. Además, en los HML se cuantificó la actividad lacasa y MnP bajo condiciones de estrés por las concentraciones de atrazina. De acuerdo a la concentración efectiva media (CE50) calculada, Pleurotus sp. cepa 1 (CE50 = 2281.0 mg L-1) fue significativamente más tolerante a la atrazina en comparación con las otras cepas estudiadas, a pesar de que su actividad enzimática (lacasa = 1.4 U mg proteína-1 y MnP = no se detectó) fue significativamente menor (p< 0.05) al resto de los aislamientos evaluados. Para los subsecuentes experimentos en co-cultivos fueron seleccionadas las cepas con mediana tolerancia a la atrazina y alta actividad lacasa como Daedalea elegans (CE50 = 1088.0 mg L-1 y 29.3 U mg proteína-1), Pycnoporus sanguineus (CE50
= 1311.0 mg L-1 y 62.4 U mg proteína-1) y Trametes maxima (CE50 = 1532.0 mg L-1 y 120.6 U mg proteína-1). En cuanto a los HMS, las especies más tolerantes a la atrazina fueron Paecilomyces carneus, P. lilacinus y P. marquandii al presentar alta CE50 con 6820.0, 3633.0 y 4736.0 mg L-1 de atrazina, respectivamente. En la tercera etapa se estudiaron las interacciones fúngicas en 9 co-cultivos establecidos entre HML (Daedalea elegans, Pycnoporus sanguineus y Trametes maxima) y HMS (Paecilomyces carneus, P. lilacinus y Aspergillus tamarii) como estrategia para incrementar las actividades enzimáticas en los HML (lacasa y MnP). Los co-cultivos se desarrollaron en medio
de cultivo líquido Sivakumar modificado. Además, se evaluó el efecto del tiempo de inoculación de los HMS sobre los HML en la producción de lacasa y MnP. Posteriormente, para contribuir con la generación de conocimiento en el área de co-cultivos fúngicos, se seleccionó el co-cultivo T. maxima–P. carneus para evaluar los factores nutrimentales que influyen en la actividad enzimática del sistema, a través de un Diseño Experimental Plackett-Burman (DEPB) con 11 factores independientes, dos niveles cada uno y cuatro puntos centrales.
La inoculación del HMS sobre los HML a los 3 y 5 días después del establecimiento de
los HML en el medio de cultivo, mostró un incremento significativo en la producción de lacasa y MnP, cuando se comparó con el monocultivo (HML) y co-cultivo inoculado simultáneamente. Con 5 días de desfasamiento en su inoculación, Paecilomyces lilacinus incrementó la actividad lacasa de D. elegans, P. sanguineus y T. maxima en 0.3, 0.9 y 1.1 veces más, respecto a los monocultivos de cada hongo. Asimismo, Paecilomyces carneus incrementó la actividad lacasa en D. elegans y T. maxima en 0.5 y 0.78 veces más, respectivamente. En cuanto a la MnP, P. carneus y P. lilacinus incrementaron la actividad MnP en P. sanguineus y T. maxima en un intervalo de 0.3 a 3.6 veces más.
Los resultados del DEPB en el co-cultivo T. maxima - P. carneus indicaron que la
modificación del medio de cultivo incrementó la actividad lacasa y MnP en 1.8 y 2.8 veces más. Además de la cantidad de inóculo (2 discos de micelio-agar), los elementos que favorecieron significativamente (p < 0.05) a la actividad lacasa fueron: altas concentraciones de glucosa (30 g L-1), (NH4)2SO4 (0.075 g L-1) y MnSO4 (0.0015 g L-1), y bajas concentraciones de KH2PO4 (0.5 g L-1) y FeSO4 (0.005 g L-1). Mientras que la actividad MnP fue favorecida por altas concentraciones de extracto de levadura (3.75 g L-1), MgSO4 (0.75 g L-1), CaCl2 (0.015 g L-1) y MnSO4 (0.0015 g L-1).
La cuarta y última etapa consistió en evaluar, a nivel de microcosmos, la degradación de
atrazina en un suelo migajón-arcilloso mediante la adición de extractos enzimáticos de
monocultivos de T. maxima, P. carneus y A. tamarii, y de los co-cultivos T. maxima–P. carneus y T. maxima–A. tamarii. Además, se aplicó un diseño experimental factorial 24 para evaluar la influencia del tipo de extracto, esterilización del suelo, capacidad de campo y pH del suelo en la degradación de atrazina. Los principales resultados indicaron que el extracto de monocultivo de T. maxima y su co-cultivo con P. carneus degradaron la atrazina (5 μg g-1) al 100%. Sin embargo, se encontraron diferencias significativas (p < 0.05) en el tiempo medio de degradación (TD50), el cual fue más bajo para el monocultivo de T. maxima (0.3 h) respecto a su co-cultivo con P. carneus (1.2 h). El diseño factorial 24 indicó que la degradación de atrazina en los microcosmos fue influenciado significativamente por el tipo de extracto (p = 0.03) y el pH del suelo (p = 0.01), el extracto de monocultivo de T. maxima adicionado a un suelo con pH ácido (4.86) favoreció la degradación de la atrazina. Los resultados obtenidos permiten concluir que los sistemas de co-cultivos podrían ser empleados para potencializar la producción de enzimas, y en
la degradación de la atrazina en suelo. Asimismo, los diferentes aspectos involucrados en este estudio, muestran la complejidad de la investigación en micorremediación, el cual debe ser abordado de manera multidisciplinaria.