Fermentasyon Süresinin Kombu Çayı Mikrobiyotası ve Canlılık Oranları Üzerine Etkileri

Abstract

Kombucha is a symbiotic system including synergistic effects of yeasts and acetic acid bacteria, produced by the fermentation of tea leaves and the incorporation of kombucha cultures under aerobic conditions. In this study, kombucha samples were produced using different tea leaves (white, green, oolong, black and pu-erh), and the number of lactic acid bacteria (LAB), total yeast (TM), total acetic acid (TAA) and total gluconobacter (TGB) were determined in these samples during the fermentation of 21 days (30°C, dark conditions). Moreover, the survival rates of the present microbiota were investigated by using the in vitro artificial gastrointestinal model depending on the various fermentation periods. On the 12th day of fermentation, the highest vitality rates were obtained for acetic acid bacteria (91.16-99.61%) and gluconobacteria (90.84-99.37%) in artificial gastrointestinal model. At the end of the fermentation period, TAA and TGB counts were 7.77-10.66 and 7.68-9.68 log cfu/mL, respectively. LAB counts increased first, followed by a reduction of 60% due to high acidity (11.17 g/L, as acetic acid) and a decrease in pH (2.82). In terms of antibacterial activity; E. coli was the most sensitive microorganism and Lactobacillus acidophilus was the most resistant microorganism to the elevated acidity. The Kombucha tea produced by Pu-erh tea leaves had the highest antibacterial effect on the microorganisms investigated (p<0.05). In terms of the industrial production of Kombucha tea and the viability of the probiotics, it was concluded that the ideal fermentation period should be 2 weeks, and the fermentation conditions should be standardized in order to maintain its functional properties.

Full text

200
Akademik Gıda®
ISSN Online: 2148-015X
http://www.academicfoodjournal.com
http://dergipark.gov.tr/akademik-gida
Akademik Gıda 17(2) (2019) 200-211, DOI: 10.24323/akademik-gida.613567
Araştırma Makalesi / Research Paper
Fermentasyon Süresinin Kombu Çayı Mikrobiyotası ve Canlılık Oranları
Üzerine Etkileri
Nurcan Değirmencioğlu1 , Elif Yıldız2 , Yasemin Şahan3 , Metin Güldaş4 , Ozan Gürbüz3
1Bandırma Onyedi Eylül Üniversitesi Bandırma Meslek Yüksekokulu Gıda İşleme Bölümü, Bandırma-Balıkesir
2University of the District of Columbia The College of Agriculture Urban Sustainability and Environmental Sciences,
Washington DC, USA
3Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü, Bursa
4Uludağ Üniversitesi Sağlık Bilimleri Fakültesi Beslenme ve Diyetetik Bölümü, Bursa
Geliş Tarihi (Received): 15.04.2019, Kabul Tarihi (Accepted): 29.07.2019
Yazışmalardan Sorumlu Yazar (Corresponding author): nurcan.degirmencioglu@gmail.com (N. Değirmencioğlu)
0 266 714 93 02 0 266 714 93 04
ÖZ
Kombu çayı kültürü ilavesiyle aerobik koşullarda çay yapraklarının fermentasyonuyla elde edilen Kombu çayı, maya
ve asetik asit bakterilerinin birlikte çalıştığı simbiyotik bir sistemdir. Bu çalışmada, farklı çay (beyaz, yeşil, oolong,
siyah ve pu-erh) yaprakları kullanılarak üretilen kombu çaylarının, 21 gün (30°C, karanlık koşullarda) fermentasyon
süresince laktik asit bakterisi (LAB), toplam maya (TM), toplam asetik asit (TAA) ve toplam glukonobakter (TGB)
sayımları yapılmış ve in vitro yapay statik gastrointestinal model kullanılarak mevcut mikrobiyotanın canlı kalma
oranları ile fermentasyon süresine bağlı olarak değişimi incelenmiştir. Yapay mide-barsak ortamında en yüksek
canlılık oranının fermentasyonun 12. gününde asetik asit bakterileri ve glukonobakterlerde (%91.16-99.61 ve %90.84-
99.37) olduğu, fermentasyon sonunda, TAA ve TGB sayılarının 7.77-10.66 ve 7.68-9.68 log kob/mL arasında
değiştiği, LAB sayılarında ise önce artış ardından yüksek asitlik (11.17 g/L, asetik asit cinsinden) ve düşen pH (2.82)
nedeniyle inhibisyon sonucu %60 oranında azalma olduğu belirlenmiştir. Kombu çaylarının antibakteriyel etkisinin
belirlenmesine yönelik incelemede ise artan asitliğe en hassas mikroorganizmanın Escherichia coli ve en dirençli
mikroorganizmanın da Lactobacillus acidophilus olduğu belirlenmiştir. Pu-erh çay yapraklarıyla üretilen kombu
çaylarının ise mikroorganizmalar üzerinde en fazla antibakteriyel etki gösteren çay yaprağı olduğu tespit edilmiştir
(p<0.05). Sonuç olarak, ticari Kombu çayı üretiminde probiyotiklerin canlılık özellikleri göz önünde bulundurularak
ideal fermentasyon süresi olarak 2 haftanın önerilebileceği, fonksiyonel özelliklerin korunabilmesi için de
fermentasyon koşullarının standardize edilmesi gerektiği sonucuna varılmıştır.
Anahtar Kelimeler: Kombu çayı, Mikrobiyota, İn vitro, Yapay statik gastrointestinal sistemde canlılık
Effect of Fermentation Time on Bio-Viability of Kombucha Tea
ABSTRACT
Kombucha is a symbiotic system including synergistic effects of yeasts and acetic acid bacteria, produced by the
fermentation of tea leaves and the incorporation of kombucha cultures under aerobic conditions. In this study,
kombucha samples were produced using different tea leaves (white, green, oolong, black and pu-erh), and the
number of lactic acid bacteria (LAB), total yeast (TM), total acetic acid (TAA) and total gluconobacter (TGB) were
determined in these samples during the fermentation of 21 days (30°C, dark conditions). Moreover, the survival rates
of the present microbiota were investigated by using the in vitro artificial gastrointestinal model depending on the
various fermentation periods. On the 12th day of fermentation, the highest vitality rates were obtained for acetic acid
bacteria (91.16-99.61%) and gluconobacteria (90.84-99.37%) in artificial gastrointestinal model. At the end of the

N. Değirmencioğlu, E. Yıldız, Y. Şahan, M. Güldaş, O. Gürbüz Akademik Gıda 17(2) (2019) 200-211
201
fermentation period, TAA and TGB counts were 7.77-10.66 and 7.68-9.68 log cfu/mL, respectively. LAB counts
increased first, followed by a reduction of 60% due to high acidity (11.17 g/L, as acetic acid) and a decrease in pH
(2.82). In terms of antibacterial activity; E. coli was the most sensitive microorganism and Lactobacillus acidophilus
was the most resistant microorganism to the elevated acidity. The Kombucha tea produced by Pu-erh tea leaves had
the highest antibacterial effect on the microorganisms investigated (p<0.05). In terms of the industrial production of
Kombucha tea and the viability of the probiotics, it was concluded that the ideal fermentation period should be 2
weeks, and the fermentation conditions should be standardized in order to maintain its functional properties.
Keywords: Kombucha, Microbiota, In vitro, Artificial static gastrointestinal model
GİRİŞ
Bakteri (Acetobacter ve Gluconobacter) ve mayaların
birlikte çalıştığı simbiyotik bir sistem olan Kombu çayı,
şeker ve çay yapraklarının (siyah, yeşil, beyaz veya
oolong) fermentasyonuyla üretilen, hafif tatlı, asidik ve
gazlı bir içecektir [1, 2]. M.Ö. 221’de Çin, Kore ve
Japonya’da enerji verici ve detoksifiye edici olarak
tüketilen Kombu çayı, Japon İmparatoru’nun sindirim
rahatsızlıklarını düzeltmek amacıyla Dr. Kombu
tarafından ilk kez Kore’den Japonya’ya götürülmüş ve
oradan da dünya’ya yayılmıştır [2]. Kombu çayı kelimesi,
Japonca’da geniş yapraklı deniz yosunu (Laminaria
japonica)’na verilen “Kombu”, çay anlamına gelen “Cha”
kelimelerinin birleşiminden oluşmaktadır. Farklı
kaynaklarda kökeninin Rusya’ya dayanmakta olduğuna
dair bilgiler bulunmakta olup, Rusya’da “Kargasok” çayı
olarak bilinen Kombu çayı, “Red Tea Fungus, Haipao
Manchurian Mushroom, Chainii kvass, Kocha kinoko”
gibi isimlerle de anılmaktadır [3].
Yapılan çalışmalarda, “bakteri ve mayaların simbiyotik
kültürü” (SCOBY, Symbiotic Culture of Bacteria and
Yeast) olarak adlandırılan selülozik biyofilm tabakasında
(zooglea biyofilm) Acetobacteraceae familyasına dahil
Gram negatif aerob basiller (Acetobacter xylinum, A.
xylinoides, A. aceti, A. pasteurianus, Bacterium
gluconicum ve Gluconobacter oxydans) ile mayalar
(Saccharomyces cerevisiae, S. ludwigii,
Zygosaccharomyces bailii, Z. rouxii, Z. kombuchaensis
sp.nov., Schizosaccharomyces pombe, Torulaspora
delbrueckii, Brettanomyces bruxellensis, B. lambicus, B.
custerii, Candida krusei, C. albicans, Kluyveromyces
africanus, Pichia membranaefaciens, Kloeckera
apiculata, Torulopsis sp., Dekkera sp.) ve laktik asit
bakterilerinin (Lactobacillus sp., Lactococcus sp.,
Leuconostoc sp., Bifidobacterium sp.) simbiyotik olarak
birlikteliği tespit edilmiştir [1-2, 4-18]. Yapılan son
çalışmalarda; Actinobacteria, Bacteroidetes,
Deinococcus-Thermus, Firmicutes ve Proteobacteria
sınıflarına dahil mikroorganizmaların da bulunduğu
belirlenmiş olup, Firmicutes sınıfına dahil Lactobacillus
ve Lactococcus cinslerine bakteri ve mayaların
simbiyotik kültüründe yoğun olarak rastlanıldığı,
Leuconostoc, Enterococcus ve Allobaculum (kilo
kaybında etkili) cinslerinin ilk kez kombu çayı
örneklerinde tespit edildiği, Propionibacterium ve
Bifidobacterium cinslerinin ise Kombu çayı
fermentasyonunun erken dönemlerinde belirlendiği ifade
edilmektedir [14, 19].
Bakteri ve mayaların simbiyotik kültüründe bulunan
mayalar, invertaz enzimleriyle sakkarozu kullanarak etil
alkol ve CO2 oluştururken; Acetobacter cinsi bakteriler,
mayaların oluşturduğu etil alkolü alkol ve aldehit
dehidrogenaz enzimleriyle asetik aside dönüştürmekte,
Gluconobacter’ler ise süksinat ve α-ketoglutarat
enzimlerinin bulunmaması nedeniyle de asetik asidi
okside edemediklerinden glukonat oluşturmaktadırlar.
Ayrıca, Gluconobacter ve Acetobacterlerin glukonik asit
üretimi için glikozu; asetik asit üretimi için de fruktoz ve
etanolu kullanma yetenekleri de bulunmaktadır [1, 10,
20, 21].
Kombu çayında bulunan mikroorganizmalar; çay
yaprakları ve zenginleştirmek için eklenilen diğer bitkisel
materyallerdeki (oğul otu, nane, enginar, kekik, adaçayı,
dut, vişne vb.) fenolik bileşikleri kullanarak, bağlı
formlarından serbest fenolikleri oluşturmakta, hem son
ürünün duyusal özelliklerine katkıda bulunmakta hem de
sağlık üzerinde olumlu etki gösteren fermentasyon
ürünleri (asetik asit, glukonik asit, glukuronik asit, malik
asit, CO2, etil alkol, çeşitli vitaminler, amino asitler,
mineraller vb.) meydana getirmektedirler. Maya ve
bakterilerin meydana getirdikleri diğer metabolitler
arasında, suda çözünebilir vitaminler (C, B1, B2, B3, B6,
B12) ile asetik asidin yanı sıra önemli ölçüde glukonik,
glukuronik, sitrik, malik, tartarik, folik, laktik, okzalik,
süksinik, pürivik asit gibi diğer organik asitler, mineral
maddeler (Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Co, Cr vb.) ve fenolik
bileşikler de yer almaktadır. Oluşan metabolitlerin
çeşitliliği; bakteri ve mayaların simbiyotik kültüründe
bulunan mikroorganizmaların çeşitliliğine, fermentasyon
koşullarına (süre, sıcaklık vb.), kullanılan şeker ve çay
miktarına, çay yaprağının çeşidine ve eklenen diğer
bitkisel materyallere göre değişiklik göstermekle
beraber; iklim, coğrafi koşullar, üretim sırasındaki
hijyenik koşullar da bu konuda etkili olabilmektedir [1, 5,
10-12, 17, 22-25].
Kombu çayının pekçok metabolik hastalığı iyileştirici ve
destekleyici etkisinin olduğu belirlenmiş (diabet, kronik
yorgunluk, romatizmal hastalıklar, gut, hemoroid,
yaşlılık, atheroskleroz, kolesterol ve kan basıncının
düzenlenmesi, kanser ve AIDS gibi hastalıklarda
görülen kilo kayıplarının kontrolü, bağışıklık ve sindirim
sistemleriyle karaciğer fonksiyonlarını destekleme,
yangısal durumları azaltma, gastrointestinal sistemin
çalışmasını iyileştirme) olup, fenolik bileşik içeriğinden
dolayı serbest radikalleri etkisiz kılıcı ve antioksidan
aktivitesinin yanısıra, organik asit içeriğiyle de patojen
bakterilere (Salmonella typhimurium, S.enteritidis,
Staphylococcus aureus, Helicobacter pylori, Shigella
sonnei, E.coli) karşı antibakteriyel etkisi bulunmaktadır
[1, 8-9, 24-31].

N. Değirmencioğlu, E. Yıldız, Y. Şahan, M. Güldaş, O. Gürbüz Akademik Gıda 17(2) (2019) 200-211
202
Çay mantarı olarak bilinen Medusomyces gisevii’nin
gelişebilmesi osmofilik mayalar ve bakterilerin
çoğalmasına bağlı olup; sakkarozu kullanan asetik asit
bakterileri (Acetobacter xylinum) fermentasyon
sırasında, selülozik yapıda-kalın “zooglea biyofilm”
tabakasını oluşturarak simbiyotik bakteri ve maya
topluluğunun bir arada kalmasını sağlamaktadır [10, 11,
26]. Bakteri ve mayaların oluşturduğu simbiyoz
konsorsiyum geliştikçe oluşan selüloz yapı, yüzeydeki
mikroorganizmaları hem UV ışınlarından korumakta
hem de gelişmeleri için gerekli olan oksijeni
sağlamaktadır [1].
Probiyotik mikroorganizmaların insan sağlığı üzerindeki
olumlu etkilerini ortaya koymaya yönelik pek çok
araştırma yürütülmekte olup, bu mikroorganizmaların
sindirim sisteminden geçerken canlı kalabilmeleri büyük
önem taşımaktadır. İn-vitro gastrointestinal modeller,
statik ve dinamik olmak üzere ikiye ayrılmakta; statik
modellerde gıda maddesi sindirim sistemindeki işlemlere
maruz bırakılarak sindirim sırasında zamana bağlı
olarak değişen parametreler (pH, enzim düzeyi, örnek
miktarı vb.) dikkate alınmamakta, dinamik modellerde
ise fiziksel ve mekaniksel işlemlerle zamana bağlı olarak
değişen parametreler sindirim sırasında stimüle
edilmektedir [27].
Taze kaynatılmış su kullanılarak (1 litre) ve 50-200 g/L
oranında sakkaroz (çay şekeri) ile tatlandırıldıktan
sonra, çoğunlukla siyah çay yapraklarıyla (1.5-5.0 g/L)
demlenen Kombu çayı (10 dakika); yapraklar
uzaklaştırıldıktan sonra, oda sıcaklığına soğutulmakta
ve ardından bakteri ve mayaların simbiyotik kültürü
(SCOBY, Kombu çayı mantarı) ve daha önce fermente
edilmiş çaydan (100-150 mL/L) eklenerek, üzeri temiz
bir bezle örtüldükten sonra fermentasyona
bırakılmaktadır (7-60 gün) [5, 7, 11, 20, 24-25, 32]. Süre
ve sıcaklık artışına bağlı olarak artan asetik asidin
olumsuz etki yaratmaması için fermentasyonun; pH
4.2’ye ulaştığında sonlandırılması, alkol ve CO2
oluşumunu kontrol edebilmek için ise ürünün pastörize
edilmesi veya koruyucu (%0.1 sodyum benzoat ve %0.1
potasyum sorbat) ilave edilip soğukta muhafaza
edilmesi önerilebilmektedir [24, 25, 34].
Bu çalışmada, beyaz, yeşil, oolong, siyah ve pu-erh çay
yaprakları kullanılarak üretilen Kombu çayı örneklerinin;
21 günlük (30oC, karanlık koşullarda) fermentasyon
süresince, mevcut mikrobiyotasını (laktik asit bakterisi-
LAB, toplam maya-TM, toplam asetik asit-TAA ve
toplam glukonobakter-TGB) ve bu mikrobiyotanın in vitro
statik gastrointestinal model ortamında fermentasyon
süresine bağlı olarak canlı kalma oranlarının tespit
edilerek ideal fermentasyon süresinin ve antimikrobiyal
özeliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.
MATERYAL ve METOT
Kombu Çayı Üretimi
Kombu çayı örneklerinin hazırlanmasında Chado
firmasından temin edilen beyaz (Yin Zhen Silver Needle,
Camellia sinensis var. sinensis, Çin), yeşil (Matcha
Koicha, Camellia sinensis var. assemica, Japonya), milk
oolong (Camellia sinensis var. sinensis, Tayvan), siyah
(Keemun black, Camellia sinensis var. sinensis, Qimen
bölgesi Çin) ve Golden pu-erh (Camellia sinensis var.
sinensis, Pu-erh bölgesi Çin) çay yaprağı örnekleri
kullanılarak Greenwalt ve ark. [28] tarafından önerilen
yöntem adapte edilmiştir. Sterilize edilmiş 1 litre damıtık
suya, şeker (100 g/L) ilave edilerek kaynatılmış,
ardından çay yaprakları (6 g/L) ayrı ayrı eklendikten
sonra 15 dakika süreyle demlenmiş ve soğutulmuş çay
örneklerine bakteri ve mayaların simbiyotik kültürü ve
fermente Kombu çayı (100 mL/L) ilave edilerek 21 gün
süreyle, 30±2C’de karanlıkta, fermente edilmiştir.
Denemeler sırasında; bakteri ve mayaların simbiyotik
kültürü, piyasada satılan ticari bir Kombu çay örneğinin
(Mavili kapı firmasına ait) üç kez ard arda yukarıda
belirtilen koşullarda fermente edilmesiyle elde edilmiş ve
çay örneğinin üst yüzeyinde gelişen selülozik tabaka
SCOBY olarak kullanılmıştır.
Fizikokimyasal ve Kimyasal Analizler
Fermentasyon süresince Kombu çay örneklerinin pH
değerleri Hanna pH 211 model (Hanna Instruments
S.R.L., ABD) pH metreyle ölçülerek belirlenmiş; toplam
asitlik değerleri, CO2’i uçurulmuş 10 mL Kombu çayı
örneğinin 0.1 N NaOH eşliğinde titrasyonuyla tespit
edilmiş ve sonuçlar asetik asit cinsinden g/L olarak ifade
edilmiştir [35].
Mikrobiyolojik Analizler
Kombu çayı örneklerinden aseptik koşullarda 10'ar mL
alınarak 90 mL steril %0.1 pepton (Merck 107214) ve
%0.85 iyotsuz NaCl içeren dilüsyon sıvısı içinde
homojenize edilmiş ve ileri dilüsyonlar için aynı dilüsyon
çözeltisi kullanılmıştır. LAB sayımı için De Man Rogosa
Sharpe (MRS) Agar (Merck 1.10660, 30±2C, 48 saat),
toplam maya sayımı için Rose Bengal Chloramphenicol
Agar (Merck 1.00467, 22±2C, 5 gün) kullanılmış [36]
olup, toplam asetik asit bakterisi ve toplam
Gluconobacter sayımları için ise Asai ve ark. [37]
tarafından önerilen yöntem uygulanmıştır. Toplam asetik
asit bakterisi sayımı için 30 g/L glikoz monohidrat
(Merck 108342), 5 g/L maya ekstraktı (Merck 103753), 3
g/L pepton (Merck 107214), 20 g/L agar (Merck 101614)
içeren besiyeri hazırlanarak sterilize edildikten sonra
içerisine %3 etanol (Merck 100983) ve 10 g CaCO3
(Merck 10207) eklenmiş, 25±2C’de 3 gün inkübe
edilmiştir. Toplam Gluconobacter sayımları için ise, 25
g/L D(-)-mannitol (Merck 105982), 5 g maya ekstraktı
(Merck 103753), 3 g/L pepton (Merck 107214), 20 g/L
agar (Merck 101614) içeren besiyeri hazırlanarak,
30±2C’de 3 gün süreyle inkübasyona bırakılmıştır.
İnkübasyon sonunda tüm mikroorganizmalar için
koloniler değerlendirilmiş ve sonuçlar “log kob/mL”
şeklinde ifade edilmiştir.
In-vitro Yapay Statik Gastrointestinal Modelde
Canlılık
Fermentasyon süresince, Kombu çayında bulunan
mikroorganizmaların in-vitro yapay statik gastrointestinal
modelde canlı kalma oranlarının tespitinde Nazzaro ve

N. Değirmencioğlu, E. Yıldız, Y. Şahan, M. Güldaş, O. Gürbüz Akademik Gıda 17(2) (2019) 200-211
203
ark. [38] ve Valero-Cases ve Frutos [39] tarafından
belirtilen yöntemler kullanılmıştır. Yapay mide ve barsak
ortamı; her mikroorganizma grubu için 9 mL uygun sıvı
besiyeri kullanılarak oluşturulmuş ve hazırlanan
besiyerleri kullanılmadan önce 0.22 μm (Minisart 16534,
Sartorios Biotech GmbH 37070 Goettingen, Almanya)
gözenek çapına sahip filtreden geçirilerek sterilize
edilmiştir. In-vitro yapay statik gastrointestinal model
ortamında canlı kalan mikroorganizma sayıları, her
mikroorganizma grubu için uygun besiyerine ekim
yapılarak tespit edilmiş ve sonuçlar “log kob/mL” olarak
bildirilmiştir. Kombu çayı örneklerindeki
mikroorganizmaların canlı kalma yüzdeleri ise; in-vitro
yapay statik gastrointestinal model ortamı öncesindeki
her mikroorganizma grubuna ait toplam canlı hücre
sayısının, in-vitro yapay statik gastrointestinal model
ortamı sonrasındaki toplam canlı hücre sayısına
bölünerek, 100 ile çarpılmasıyla belirlenmiştir.
Antimikrobiyal Aktivite
Kombu çay örneklerinin antimikrobiyal etkilerinin
belirlenmesinde disk difüzyon yöntemi [40] uygulanmış
olup, fermentasyonun 12. gününde alınan örnekler, 0.2
μm gözenek çapına sahip steril filtreden geçirilmiş,
Tablo 1‘de isimleri ve gelişme koşulları belirtilen
mikroorganizmalar üzerinden antimikrobiyal etkileri
belirlenmiştir. 18-24 saatlik kültürlerden 100 μL alınarak
patojen mikroorganizmalar (8.44-8.98 log kob/mL) için
TS agar besiyerine; laktik asit bakterileri (7.20-7.62 log
kob/mL) için ise MRS agar besiyerine yüzey sürme
yöntemiyle ekim yapılmış ve 4C’de 2 saat süreyle
bekletilerek kültürlerin besiyerine difüzyonu
sağlanmıştır. Süre sonunda 6 mm çapındaki kağıt
diskler (Oxoid CT0998B), besiyeri yüzeye yerleştirilerek
her kombu çayı örneğinden 20 μL alınarak kağıt disklere
emdirilmiştir. Pozitif kontrol olarak 20 μL kloramfenikol
(0.1 g/L, Oxoid SR0078E), negatif kontrol olarak ise 20
μL saf su (0.2 μm gözenek çapına sahip filtreden
geçirilmiş) kullanılmıştır. İnkübasyon sonrasında
petrilerdeki zon çapları ölçülerek (-: inhibe edici etki yok;
+: <10 mm; ++: 10-15 mm; +++: 15-20 mm), test edilen
mikroorganizmalar üzerine Kombu çayı örneklerinin
antimikrobiyal etkileri değerlendirilmiştir. Çalışmada
yapılan fizikokimyasal, kimyasal ve mikrobiyolojik
analizler üç kez tekrarlanmış ve sonuçlar bu üç değerin
ortalaması olarak verilmiştir.
Tablo 1. Antimikrobiyal aktivite belirlenmesinde kullanılan mikroorganizmalar ve gelişme koşulları
Mikroorganizma adı
Temin edildiği yer
Kullanılan besiyeri ve Gelişme
koşulları
Salmonella enteritidis (ATCC 13076)
Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi
Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Tryptic Soy Broth (TSB)/ Tryptic Soy
Agar (TSA), (Oxoid CM0129)/
(Oxoid CM0131)
37C’de 24 saat
Escherichia coli (ATCC 25922)
Staphylococcus aureus ssp. aureus
(ATCC 29213)
Enterobacter aerogenes (ATCC
13048)
Listeria monocytogenes serotype1/2b
Erciyes Üniversitesi Veteriner
Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Salmonella enterica serovars.
Typhimurium
Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus NRRL B 548
USDA’s Agricultural Research
Services Culture Collection (Birleşik
Devletler Tarım Bölümü’nün Tarımsal
Araştırma Servisi Kütür Koleksiyonu)
De man Rogosa Sharp Broth/ De
man Rogosa Sharp Agar (Merck
1.10661)/(Merck 1.10660)
37C’de 2 gün
Lactobacillus casei NRRL B 1922
Lactobacillus acidophilus NRRL B
4495
Duyusal Değerlendirme
Kombu çayı örneklerinde duyusal değerlendirme; 1-5
hedonik skala (5 puan: Çok iyi, 4 Puan: iyi, 3 Puan:
Kabul edilebilir, 2 Puan: Yeterli değil, 1 Puan: Kötü)
kullanılarak, 18-48 yaş aralığında 25 kişi ile; örneklerin;
lezzet, koku, ekşilik, renk ve genel kabul edilebilirlik
açısından değerlendirilmesiyle gerçekleştirilmiştir [41].
İstatistiksel Analizler
Analizler sonucu elde edilen veriler istatistiksel olarak
SPSS 16.0 programı kullanılarak değerlendirilmiştir.
Elde edilen ortalama değerler arasındaki istatistikî
farklılıkların belirlenmesinde p<0.05 olasılık düzeyinde
LSD (Least Significant Difference) testi kullanılmıştır.
BULGULAR ve TARTIŞMA
Kombu çayı örneklerinin fizikokimyasal analiz sonuçları
Şekil 1’de verilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre
örneklerin pH değerleri fermentasyonun başında 4.63-
5.58 arasında değişiklik gösterirken, fermentasyonun
21. gününde ise 2.50-2.53’e düşmüştür. Kombu çayı
üretiminde hammadde olarak farklı çay yaprakları
kullanımının, örneklerin pH değerlerinde belirgin
farklılığa (p>0.05) yol açmadığı gözlenmekle birlikte, tüm
çay örneklerinde düzenli bir azalmanın olduğu tespit
edilmiştir. Kombu çayı ile ilgili olarak daha önce yapılmış
çalışmalarda fermentasyon sonu pH değerleri olarak
1.80 [12], 3.00-3.50 [14], 4.60-4.70 [18], 3.91-4.19 [21],
2.50 [42], 2.50 [43], 3.08 [44], 2.76-3.15 [45], 2.60 [46],
2.50-3.00 [47], 2.90 [48], 2.90 [49], 3.00 [50], 1.95-2.89
[51], 3.11-3.22 [52], 3.60 [53], 2.57-3.05 [54] değerleri
elde edilmiş ve pH değerlerinin diğer çalışmalarda 1.80-
4.70 arasında değiştiği gözlenmiştir. Bu değerlerle
karşılaştırıldığında çalışmamızdaki fermentasyon sonu
pH değer aralığının, bu pH değişim bandı içinde kalarak
genel ortalamayla uyumlu olduğu belirlenmiştir. Pek çok
araştırmacı tarafından da belirtildiği gibi [10, 12, 51, 55,
56] tüm çay örneklerine aynı oranda ilave edilen
sakaroz; fermentasyonda kullanılarak farklı organik

N. Değirmencioğlu, E. Yıldız, Y. Şahan, M. Güldaş, O. Gürbüz Akademik Gıda 17(2) (2019) 200-211
204
asitlere dönüşmekte ve bunun doğal sonucu olarak da
pH değerinde azalma gözlenmektedir. Fermentasyonun
3. gününden sonra gözlenen pH değerindeki azalmada
ve pH düşüşünün tüm denemelerde yavaş
seyretmesinde, Malbaša ve ark. [32], Sun ve ark. [48] ile
Jayabalan ve ark. [50] tarafından da ifade edildiği gibi;
çay yapraklarındaki mineral maddelerle, fermentasyon
sırasında oluşan zayıf asitlerin etkileşiminin etkili olduğu
düşünülmektedir. Çay örnekleri arasında fermentasyon
başlangıç ve sonu pH değerleri açısından diğer
örneklere göre en düşük değerlere sahip olan Kombu
çayı tipi; pu-erh çay yaprakları kullanılarak üretilen
örneklerdir (p<0.05). pH değerlerindeki değişimin pu-erh
çayının üretim tekniğinden ve çay yapraklarının
bileşimindeki farklılıklardan (fenolik madde ve kateşin
içeriğinden) kaynakladığı düşünülmekle beraber;
fermentasyon sonunda tüm farklı çay örneklerinden
yapılan denemelerde benzer pH değerlerine ulaşılmış
olup, istatistiki olarak önemli bir farklılık bulunmamıştır
(p>0.05). Diğer çalışmalarla da [48, 52, 54, 57] uyumlu
sonuçlar elde edilmesi sonucunda, farklı çay yaprakları
kullanımının Kombu çayı fermentasyonu üzerinde pH
değeri ve fermentasyon asitliği açısından önemli bir
olumsuz etki yaratmadığı kanısına varılmıştır.
Kombu çayı örneklerinin toplam asitlik değerlerinin,
fermentasyon başlangıcında 0.12-0.24 g/L (asetik asit
cinsinden) arasında iken, 21. günün sonunda 11.77-
16.69 g/L aralığına yükselmiştir. Yapılan farklı
çalışmalarda; sıcaklık, ilave edilen şeker miktarı,
kullanılan çay yaprağının çeşidi ve miktarı,
fermentasyon süresi ve sıcaklığı vb. koşullar neden
gösterilerek daha düşük asitlik değerleri elde edildiği
görülmüştür [18, 22, 32, 48, 52, 54, 57, 58]. En hızlı
asitlik artışı pH değerindeki değişime paralel olarak, pu-
erh çay yaprakları kullanılarak üretilen Kombu çayı
örneklerinde belirlenmiştir (p<0.05). Essawelt ve ark.
[57] ile Lv ve ark. [58] tarafından da bildirildiği gibi pu-
erh çay yapraklarının suda çözünür kurumadde oranı ve
içeriği, fermentasyon sırasında CO2 ve dolayısıyla suda
çözünen hem asit hem de baz karakterine sahip
hidrokarbonat (HCO3-) anyonu oluşumuna yol
açmaktadır. Bu anyonun, zayıf asitlerin
iyonizasyonundan açığa çıkan serbest hidrojen
iyonlarına bağlanarak pH’daki düşüşü, tamponlama
etkisiyle sayesinde, kısmen kontrol altında tuttuğu
düşünülmektedir. pH değerlerinin fermentasyonun 3.
gününden sonra ani değişimler göstermemesine karşın,
toplam asitlik değerlerinde görülen artışlara benzer
çalışmalarda da rastlanılmış olup, fermentasyon
süresinin bitimine; pH değerlerindeki değişimin yanı sıra
toplam asitlik değerlerine bakılarak da karar verilmesi
önerilmektedir. Bu farklılıkta, muhtemelen pH değeri
ölçümünde sadece suda iyonlaşan H+ iyonu
konsantrasyonunun ölçülmesi, titrasyon asitliğinde ise
suda iyonlaşan ve asitlik veren diğer atom grubu, kök ve
bileşiklerin de etkili olması rol oynamaktadır. Diğer
yandan, fermentasyon sonunda ulaşılan pH değerleri,
fermentasyonda etkili olan mayaların çalışabileceği pH
değerinin çok altında olmasına karşın, simbiyotik
kültürde bulunan bakteri ve mayaların faaliyetlerine
devam edebildiğini göstermiştir (p<0.05).
Şekil 1. Fermentasyon süresince pH ve toplam asitlik değişimi (log kob/mL, a-e: farklı harfler gruplar arasındaki
farklılıkları (p<0.05) ifade etmektedir)
Fermentasyon süresince belirlenen LAB, TM, TAA ve
TGB sayıları Şekil 2’de gösterilmiştir. Fermentasyonun
3. gününde tüm mikroorganizma gruplarında hızlı bir
artış olmuş, bu artış LAB ve TM sayılarında 12. güne
kadar devam etmiştir. En yüksek değerler, LAB
sayılarında yeşil çayda (5.80 log kob/mL) ve TM sayısı
bakımından ise beyaz çayda (6.11 log kob/mL) tespit
edilmiştir (p<0.05). Oolong çayı kullanılarak üretilen
kombu çayı örnekleri ise, LAB sayılarında 3. günden
itibaren 21. güne kadar düzenli artış (p<0.05)
gözlenmiştir.

205
Şekil 2. Fermentasyon süresince laktik asit bakterisi (LAB), toplam maya (TM), toplam asetik asit bakterisi (TAA) ve
toplam glukonobakter (TGB) sayılarındaki değişimler (log kob/mL, a-e: farklı harfler gruplar arasındaki farklılıkları
(p<0.05) ifade etmektedir)
Fermentasyon sırasında maya sayılarındaki artışın 12.
günden sonra azalma seyri içerisinde olmasında;
fermentasyonun 3. ve 12. günleri arasında görülen pH
değerindeki azalma ve toplam asitlik değerlerindeki
artışın rol oynadığı, Teoh ve ark. [9] ile Essewelt ve ark.
[57] tarafından yapılan çalışmalarda da vurgulandığı
gibi, aynı dönemde toplam asetik asit ve glukonabakter
sayılarında görülen artışa bağlı olarak da mayaların bu
iki grup mikroorganizma ile besin maddesi içeriği ve pH
azalışından dolayı rekabet edemediği sonucuna
varılmıştır. En yüksek değerine sırasıyla 10.66 ve 9.68
log kob/mL ile 21. günde ulaşan toplam asetik asit ve
glukonabakter sayılarında, 3. günden itibaren düzenli
artış olduğu ve 3. günde ulaşılan değerden daha düşük
seviyeye inmedikleri belirlenmiştir (p<0.05). Gladysheva
ve ark. [59] tarafından vurgulandığı üzere, asetik asit
bakterileri 25-30°C aralığında en iyi gelişimi göstermekte
olup, bizim çalışmamızda da Kombu çayı denemeleri
30C’de ve karanlıkta gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, bakteri
ve mayaların simbiyotik kültürünün yanı sıra
fermentasyonunun başlangıcında, fermentasyonunu
henüz tamamlamış Kombu çayı örneklerinden başlatıcı
kültür olarak ortama ilave edilmesi ve kullanılan çay
yapraklarının kafein ve fenolik içeriklerinin de toplam
asetik asit ve glukonabakter sayılarındaki düzenli artış
üzerinde etkili olduğu düşünülmektedir.
Laktik asit bakterilerinin en yüksek seviyede (5.99 log
kob/mL) olduğu 12. günde yapılan in vitro statik
gastrointestinal sistemde canlılık analizi sonuçlarına
göre (Şekil 3); yapay mide barsak ortamı sonrasında
1.51-1.63 log kob/mL düzeylerinde belirlenen LAB, in
vitro statik gastrointestinal sistem koşullarında en düşük
canlı kalma oranına (%25.95-29.85) sahip
mikroorganizma grubu olmuş, bunu sırasıyla toplam
maya (%92.99-96.02), toplam glukonobakter (%90.84-

N. Değirmencioğlu, E. Yıldız, Y. Şahan, M. Güldaş, O. Gürbüz Akademik Gıda 17(2) (2019) 200-211
206
99.37) ve toplam asetik asit bakterileri (%91.16-99.61)
takip etmiştir (p<0.05). Kullanılan çay yaprakları
açısından değerlendirildiğinde ise, pu-erh çay yaprakları
ilave edilen Kombu çayı denemeleri (p<0.05) LAB
dışında en yüksek canlılık oranına sahip denemeler
olarak belirlenmiştir.
Şekil 3. Yapay statik gastrointestinal (YSGI) sistem öncesi ve sonrası canlı kalma (12. gün) (log kob/mL, a-e: farklı
harfler gruplar arasındaki farklılıkları (p<0.05) ifade etmektedir)
Kateşin gibi fenoller E.coli, Bordetella bronchiseptica,
Serratia marcescens, Klebsiella pneumonie,
S.choleraesuis, Pseudomonas aerogenosa, S.aureus ve
Bacillus subtilis gibi bakteri türlerine karşı hidrojen
peroksit oluşturmak, hücre membranının geçirgenliğini
değiştirmek, DNA, RNA, proteinler ve polisakkaritlerin
sentezini inhibe etmek ve bakterilerin exponansiyel
büyüme aşamasını düzenleyen küçük sinyal
moleküllerinin oluşumunu ve bakteriler arasındaki
iletişimi (quarum sensing) engellemek suretiyle
antimikrobiyal etki göstermektedir [60-63]. Aynı
zamanda fenolik bileşikler oksidasyonla yapraklardaki
renk değişiminden sorumlu olan yeni bileşiklere
dönüşmektedir [64]. Bazı araştırmacılar ise,
antimikrobiyal etkinin sodyum glutamat ve riboz gibi intra
selülar maddelerin salınımından ve hücre duvarı ile
hücre membranının geçirgenliğine zarar vermelerinden
kaynaklandığını; ayrıca Cu, Mg, Zn ve Fe gibi
minerallerin oluşumunun hızlanmasıyla da
antimikrobiyal etkinin arttığını bildirmektedirler [65]. Çay
yapraklarında bulunan fenolik bileşikler (kateşinler ve
metil-ksantin alkaloidler), kafein, teabromin, ve teofilin
antibakteriyel etkiye sahip bileşikler olup, bu etki çay
yapraklarının oksidasyon-fermentasyon süresinin
uzamasına bağlı olarak azalmaktadır. Bu açıdan
değerlendirildiğinde yeşil çayın, siyah çaya göre daha
güçlü antibakteriyel etkisi bulunmakta [62, 66-67], ancak
siyah çay yapraklarındaki tanen ve flavonoidler bu etkiyi
bazı durumlarda arttırabilmektedirler [64]. En yüksek
antimikrobiyal etkiyi göstermesi beklenen fermente-
okside olmamış beyaz çay yapraklarında, yaprakların
soldurulması esnasında enzimatik inaktivasyon
gerçekleşmediğinden polifenoller daha az düzeyde
okside olmakta ve renk değişimi için oksidasyon
enzimleri aktif biçimde çalışmaya devam etmektedir [64,
68-69]. Fermente siyah çayda, çay yapraklarında
bulunan fenolik bileşiklerin oksidasyonu polifenoloksidaz
enzimiyle biyokimyasal süreç kapsamında
gerçekleşirken, pu-erh çay yapraklarındaki fenoliklerin
oksidasyonunda mikroorganizmalar etkili olmaktadır
[70]. Yapılan çalışmalarda, önemli miktarda suda
çözünür nitelikte flavonoid içeren pu-erh çay
ekstraktlarının hem Gram (+) hem de Gram (-)
mikroorganizmalar üzerine, ATP, DNA ve RNA gibi
protein yapısındaki intraselülar moleküllerin kaybına
sebep olan mikrobiyal hücre geçirgenliğini değiştirerek
yüksek düzeyde antimikrobiyal aktivite gösterdiği ifade
edilmektedir [63, 71]. Yeşil çayda bulunan kateşinlerin
ise (özellikle de kateşin, epigallokateşin ve
epigallokateşin gallat), metisiline ve ciprofloksasin’e
dirençli Stafilokoklar, vankomisine dirençli Enterokoklar,
ciprofloksasin’e dirençli P. aerogenosa, S. aureus, B.
stearothermophilus, Clostridium botulinum gibi Gram (+)
ve Gram (-) bakterilere karşı siyah çayla
karşılaştırıldığında daha fazla antibakteriyel etkiye sahip
olduğu [62-63, 67, 72-77] belirlenmiş, bir diğer
çalışmada ise, yeşil ve pu-erh çay ekstraktlarının S.
aureus’a karşı orta düzeyde, oolong ve siyah çay
ekstraktlarının ise düşük düzeyde antimikrobiyal etki
gösterdiği, E. coli’ye karşı ise çay ekstraktlarının hiç etki
göstermediği tespit edilmiştir [78]. Michalczyk ve
Zawislak [79] tarafından yapılan bir çalışmada ise, siyah
çay ekstraktlarının pu-erh ve yeşil çay ekstraktlarıyla
karşılaştırıldığında barsak kökenli bakterilere daha güçlü
inhibe edici etki gösterdiği, S. enteritidis’in ise yeşil çaya

N. Değirmencioğlu, E. Yıldız, Y. Şahan, M. Güldaş, O. Gürbüz Akademik Gıda 17(2) (2019) 200-211
207
kıyasla siyah çayla daha yüksek düzeyde inhibe
edilebildiği bildirilmiştir.
Yapılan çalışmada, farklı çay yaprakları kullanılarak
üretilen tüm Kombu çaylarının antimikrobiyal etkisinin
belirlenmesinde disk difüzyon yöntemi ve pozitif kontrol
olarak da Staphylococcus spp., Salmonella spp., Listeria
monocytogenes, E.coli gibi mikroorganizmalar üzerinde
etki gösteren geniş spektrumlu antibiyotik, kloramfenikol
kullanılmıştır. Kloramfenikol, Avrupa Klinik Mikrobiyoloji
ve Enfeksiyon Hastalıkları Birliği (EUROCAST)
tarafından yayınlanan antimikrobiyal duyarlılık testine
yönelik disk difüzyon yöntemi kılavuzunda 30 μg’lık
dozlar ile önerilen antibiyotikler arasında yer almakta
olup, Escherichia coli ATCC 25922 ve Staphylococcus
aureus ssp. aureus (ATCC 29213) için hedef zon çapı
24 mm olarak bildirilmektedir [80]. Araştırmada
uygulanan pozitif kontrol dozu 20 μL uygulanmış ve
patojenlerin tamamı 15-20 mm zon çapı ile hassasiyet
göstermiştir. Kombu çaylarına karşı en hassas
mikroorganizmanın E. coli (p<0.05), en dirençli
mikroorganizmanın ise Lac. acidophilus (p<0.05) olduğu
(Tablo 2), pu-erh çay yaprakları kullanılarak üretilen
Kombu çay örneklerinin (p<0.05) ise Lac. acidophilus
dışında diğer mikroorganizmalar üzerine antimikrobiyal
etki gösterdiği tespit edilmiştir. Hu ve ark. [63] tarafından
yapılan bir çalışmada, Listeria monocytogenes’in çay
yapraklarından elde edilen ekstraktlara karşı en hassas
mikroorganizma olduğu, sırasıyla S. typhimurium, S.
aureus, E. coli’nin takip ettiği belirlenmiştir. Yapılan bu
çalışmada ise, L.monocytogenes, S. aureus ve S.
Typhimurium’un, oolong ve pu-erh çay yapraklarıyla
üretilen kombu çaylarından etkilendiği tespit edilmiştir.
Greenwalt ve ark. [7, 28] ile Sreeramulu ve ark. [81]
tarafından yapılan çalışmalarda, kombu çayının
antimikrobiyal etkisinin asetik asit içeriğinin bir sonucu
olduğu, %0.7 düzeyinde asetik asit içeren Kombu çay
örneklerinin S. aureus, E. coli, S. cholerasuis serotype
Typhimurium, B. cereus ve Agrobacterium tumefaciens
‘e karşı antimikrobiyal etki gösterdiği belirlenmiştir [28].
Sreeramulu ve ark. [8] ise S. aureus, Shigella sonnei, E.
coli, Aeromonas hydrophila, Yersinia enterocolitica, P.
aeruginosa, Enterobacter cloacae, S. epidermidis,
Campylobacter jejuni, S. enteritidis, S. typhimurium, B.
cereus, Helicobacter pylori ve L. monocytogenes’in
kombu çayına hassasiyet gösterdiğini, nötr pH ve termal
denatürasyondan sonra bile E. coli, S. sonnei, S.
typhimurium, S. enteritidis ve C. jejuni’ye karşı
antimikrobiyal etkisinin devam ettiğini ifade etmişlerdir.
Tablo 2. Farklı çay yaprakları kullanılarak üretilen Kombu çay örneklerinin antimikrobiyal aktivite zon çapları
(mm)
Mikroorganizmalar
Beyaz
(mm)
Yeşil
(mm)
Oolong
(mm)
Siyah
(mm)
Pu-erh
(mm)
Pozitif
kontrol
(mm)1
Negatif
kontrol
(mm)2
Salmonella enteritidis
14±0.51Aa
15±0.49Aa
-
13±0.21Bb
14±0.32Ab
19±0.52
-
Escherichia coli
14±0.63Aa
14±0.36Aa
14±0.63Aa
15±0.36Aa
14±0.20Ab
20±0.89
-
Staphylococcus aureus
-
-
15±0.52Aa
-
15±0.50Aa
20±0.74
-
Enterobacter aerogenes
-
-
15±0.55Aa
-
15±0.26Aa
19±0.63
-
Listeria monocytogenes
-
-
14±0.42Aa
-
14±0.38Ab
20±0.52
-
Salmonella typhimurium
-
-
14±0.78Aa
15±0.45Aa
15±0.41Aa
20±0.74
-
Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus
-
-
-
9±0.12Ac
8±0.20Ac
14±0.32
-
Lactobacillus casei
-
15±0.22Aa
-
-
14±0.48Ab
18±0.47
-
Lactobacillus acidophilus
-
-
-
-
-
20±0.88
-
1 Kloramfenikol, 2 Steril su, -: inhibe edici etki yok; +: <10 mm; ++: 10-15 mm; +++: 15-20 mm, Değerler; ortalama ± standart
sapma A,B: Aynı satırdaki farklı harfler gruplar arasındaki farklılıkları (p<0.05), a-c: Aynı sütündaki farklı harfler gruplar
arasındaki farklılıklar (p<0.05) ifade etmektedir.
Kombu çay örneklerinin toplam asitlik değerlerinin
11.77-16.99 g/L arasında değiştiği (Şekil 1) göz önünde
bulundurulacak olursa, antimikrobiyal etkinin
oluşmasında fenolik bileşiklerle birlikte asetik asidin de
katkısının olduğu düşünülmekte olup, Mo ve ark. [26],
Greenwalt ve ark. [28], Sreeramulu ve ark. [8, 81], Kim
ve ark. [39], Mani-Lopez ve ark. [82], Ayed ve ark. [83]
ve Battikh ve ark. [84]’nın da ifade ettiği gibi sadece
asitlik veya asetik asit ve glukonik asit gibi organik
asitler değil aynı zamanda ısıya duyarlı biyoaktif
bileşikler (proteinler, antibiyotikler, enzimler vb.), çay
yapraklarındaki kateşinlerin ısı nedeniyle
epimerizasyonu sonucu değişen kimyasal bileşikler,
sitoplazmik asidifikasyon, toksik düzeyde çözünmüş asit
anyon konsantrasyonunun artması ve asetik asit
dışındaki diğer metabolitlerin varlığı da antimikrobiyal
etkinin oluşmasını desteklemektedir.
Duyusal değerlendirme sonuçları incelendiğinde (Şekil
4), panelistler beyaz, yeşil ve oolong çay yapraklarıyla
üretilen Kombu çayları arasında tüm değerlendirme
kriterleri açısından farklılık olmadığını (p>0.05), siyah
çay yapraklarından üretilen Kombu çaylarının daha koyu
renkte olduğunu, pu-erh çay yapraklarından elde edilen
çaylarda ise çay yapraklarının üretim şartlarındaki
farklılığa bağlı olarak keskin bir kokusunun olduğunu
ancak genel kabul edilebilirlik açısından örnekler
arasında farklılık bulunmadığını ifade etmişlerdir.

208
Şekil 4. Kombuçay örneklerine ait duyusal değerlendirme sonuçları
SONUÇ
Elde edilen sonuçlara göre; çay yapraklarında bulunan
serbest ve bağlı fenolik bileşikler ile fermentasyon
sırasında oluşan metabolitlerin Kombuçay florasında
bulunan mikroorganizmaların canlı kalma oranlarına,
laktik asit bakterileri dışında, olumlu yönde etki ettiği; pu-
erh çay yaprakları ilavesinin canlı kalma yüzdelerinde
artışa neden olduğu; Kombuçay örneklerinden en fazla
etkilenen mikroorganizmanın E.coli, en dirençli
mikroorganizmanın ise Lactobacillus acidophilus olduğu;
farklı çay yaprakları kullanımının duyusal olarak
olumsuzluk yaratmadığı; üretimde standardizasyon
yaratarak geleneksel çay tüketim alışkanlıklarına
alternatif, sağlık üzerindeki etkisi geliştirilmiş probiyotik
karakterli kombu çayı üzerinde kapsamlı araştırmalar
gerçekleştirilmesi gerektiği sonucuna varılmıştır.
TEŞEKKÜR
Bu çalışma, Bandırma Onyedi Eylül Üniversitesi Bilimsel
Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından
BAP-18-BMYO-1009-091 nolu projeyle desteklenmiştir.
KAYNAKLAR
[1] Leal, J.M., Suárez, L.V., Jayabalan, R., Oros, J.H.,
Escalante-Aburto, A. (2018). A review on health
benefits of kombucha nutritional compounds and
metabolites. CyTA - Journal of Food, 16(1), 390-
399.
[2] Goh, W.N.A., Rosma, A., Kaur, B., Fazilah, B.,
Karim, A.A., Bhat, R. (2012). Fermentation of black
tea broth (Kombucha): I. Effects of sucrose
concentration and fermentation time on yield of
microbial cellulose. International Food Research
Journal, 19(1), 109-117.
[3] Jarrell, J., Cal, T., Bennett, J.W. (2000). The
Kombucha consortia of yeasts and bacteria.
Mycologist, 14(4), 166-170.
[4] Kurtzman, C.P., Robnett, C.J., Basehoar-Powers,
E. (2001). Zygosaccharomyces kombuchaensis, a
new ascosporogenous yeast from Kombucha tea.
FEMS Yeast Research, 1(2), 133-138.
[5] İleri-Büyükoğlu, T., Taşçı, F., Şahindokuyucu, F.
(2010). Kombucha ve sağlık üzerine etkileri.
Uludag University Journal of the Faculty of
Veterinary Medicine, 29(1), 69-76.
[6] Kreutzmann, S., Christensen, L.P., Edelenbos, M.
(2008). Investigation of bitterness in carrots
(Daucus carota L.) based on quantitative chemical
and sensory analyses. LWT – Food Science and
Technology, 41(2), 193-205.
[7] Greenwalt, C.J., Steinkraus, K.H., Ledford, R.A.
(2000). Kombucha, the fermented tea:
Microbiology, composition, and claimed health
effects. Journal of Food Protection, 63(7), 976-981.
[8] Sreeramulu, G., Zhu, Y., Knol, W. (2000).
Kombucha fermentation and its antimicrobial
activity. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 48(6), 2589-2594.
[9] Teoh, A.L., Heard, G., Cox, J. (2004). Yeast
ecology of kombucha fermentation. International
Journal of Food Microbiology, 95(2), 119-126.
[10] Jayabalan, R., Malbaša, R.V., Lončar, E.S., Vitas,
J.S., Sathishkumar, M. (2014). A review on
kombucha tea—Microbiology, composition,
fermentation, beneficial effects, toxicity, and tea
fungus. Comprehensive Reviews in Food Science
and Food Safety, 13(4), 538-550.
[11] Jayabalan, R., Malini, K., Sathishkumar, M.,
Swaminathan, K., Yun, S.E. (2010). Biochemical
characteristics of tea fungus produced during
Kombucha fermentation. Food Science and
Biotechnology, 19(3), 843-847.
[12] Chakravorty, S., Bhattacharya, S., Chatzinotas, A.,
Chakraborty, W., Bhattacharya, D., Gachhui, R.
(2016). Kombucha tea fermentation: Microbial and
biochemical dynamics. International Journal of
Food Microbiology, 220, 63-72.
[13] Coton, M., Pawtowski, A., Taminiau, B., Burgaud,
G., Deniel, F., Coulloumme-Labarthe, L., Coton, E.
(2017). Unraveling microbial ecology of industrial-
scale Kombucha fermentations by metabarcoding
and culture-based methods. FEMS Microbiology
Ecology, 93(5), 1-16.
[14] Marsh, A.J., O’Sullivan, O., Hill, C., Ross, R.P.,
Cotter, P.D. (2014). Sequence-based analysis of
the bacterial and fungal compositions of multiple
Kombucha (tea fungus) samples. Food
Microbiology, 38, 171-178.
[15] İleri-Büyükoğlu, T., Taşçı, F., Şahindokuyucu, F.
(2010). Kombucha ve sağlık üzerine etkileri.
Uludag University Journal of the Faculty of
Veterinary Medicine, 29(1), 69-76.

N. Değirmencioğlu, E. Yıldız, Y. Şahan, M. Güldaş, O. Gürbüz Akademik Gıda 17(2) (2019) 200-211
209
[16] Watawana, M.I., Jayawardena, N., Gunawardhana,
C.B., Waisundara, V.Y. (2016). Enhancement of
the antioxidant and starch hydrolase inhibitory
activities of king coconut water (Cocos nucifera var.
aurantiaca) by fermentation with Kombucha “tea
fungus.” International Journal of Food Science and
Technology, 51(2), 490-498.
[17] Villarreal-Soto, S.A., Beaufort, S., Bouajila, J.,
Souchard, J.P., Taillandier, P. (2018).
Understanding kombucha tea fermentation: A
Review. Journal of Food Science, 83(3), 580-588.
[18] Velićanski, A.S., Dragoljub, D., Markov, C.S.L.,
Tumbas Šaponjac, V.T., Vulić, J.J. (2014).
Antioxidant and antibacterial activity of the
beverage obtained by fermentation of sweetened
lemon balm (Melissa officinalis L.) tea with
symbiotic consortium of bacteria and yeasts. Food
Technology and Biotechnology, 52(4), 420-429.
[19] Baschali, A., Tsakalidou, E., Kyriacou, A.,
Karavasiloğlu, N., Matalas, A.L. (2017). Traditional
low-alcoholic and non-alcoholic fermented
beverages consumed in European countries: a
neglected food group. Nutrition Research Reviews,
30(1), 1-24.
[20] Reiss J. (1994). Influence of different sugars on the
metabolism of the tea fungus. Zeitschrift für
Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung,
198(3), 258-261.
[21] Loncar, E., Djuric, M., Malbasa, R., Kolarov, L.J.,
Klasnja, M. (2006). Influence of working conditions
upon Kombucha conducted fermentation of black
tea. Food and Bioproducts Processing, 84(3), 186-
192.
[22] Jayabalan, R., Marimuthu, S., Swaminathan, K.
(2007). Changes in content of organic acids and
tea polyphenols during kombucha tea fermentation.
Food Chemistry, 102(1), 392-398.
[23] Wang, Y., Ji, B., Wu, W., Wang, R., Yang, Z.,
Zhang, D., Tian, W. (2013). Hepatoprotective
effects of Kombucha tea: Identification of functional
strains and quantification of functional components.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 94(2),
265-272.
[24] Watawana, M.I., Jayawardena, N., Waisundara,
V.Y. (2015a). Enhancement of the functional
properties of coffee through fermentation by “tea
fungus” (Kombucha). Journal of Food Processing
and Preservation, 39(6), 2596-2603.
[25] Watawana, M.I., Jayawardena, N., Gunawardhana,
C.B., Waisundara, V.Y. (2015b). Health, wellness,
and safety aspects of the consumption of
kombucha. Journal of Chemistry, 1, 1-11.
[26] Mo, H., Zhu, Y., Chen, Z. (2008). Microbial
fermented tea- a potential source of natural food
preservatives. Trends in Food Science &
Technology, 19(3), 124-130.
[27] Göçer E.M.Ç., Ergin, F., Küçükçetin, A. (2016).
Sindirim sistemi modellerinde probiyotik
mikroorganizmaların canlılığı. Akademik Gıda,
14(2), 158-165
[28] Greenwalt, C.J., Ledford, R. A., Steinkraus, K.
(1998). Determination and characterization of the
antimicrobial activity of the fermented tea
Kombucha. LWT-Food Science Technology, 31(3),
291-296.
[29] Bhattacharya, S., Manna, P., Gachhui, R., Sil, P.C.
(2011a). Protective effect of Kombucha tea against
tertiary butyl hydroperoxide induced cytotoxicity
and cell death in murine hepatocytes. Indian
Journal of Experimental Biology, 49(7), 511-524.
[30] Bhattacharya, S., Gachhui, R., Sil, P.C. (2011b).
Hepatoprotective properties of Kombucha tea
against TBHP-induced oxidative stress via
suppression of mitochondria dependent apoptosis.
Pathophysiology, 18(3), 221-234.
[31] Bhattacharya, D., Bhattacharya, S., Patra, M.M.,
Chakravorty, S., Sarkar, S., Chakraborty, W.,
Koley, H., Gachhui, R. (2016). Antibacterial activity
of polyphenolic fraction of Kombucha against
enteric bacterial pathogens. Current Microbiology,
73(6), 885-896.
[32] Malbaša, R.V., Lončar, E.S., Vitas, J.S.,
Čanadanović-Brunet, J.M. (2011). Influence of
starter cultures on the antioxidant activity of
kombucha beverage. Food Chemistry, 127(4),
1727-1731.
[33] Vina, I., Semjonovs, P., Linde, R., Patetko, A.
(2013). Glucuronic acid containing fermented
functional beverages produced by natural yeasts
and bacteria associations. International Journal of
Recent Research and Applied Studies, 14(1), 17-
25.
[34] Kovacevic, Z., Davidovic, G., Vuckovic-Filipovic, J.,
Janicijevic-Petrovic, M., Janicijevic, K., Popovic, A.
(2014). A toxic hepatitis caused the kombucha tea
– Case report. Macedonian Journal of Medical
Sciences, 2(1), 128-131.
[35] AOAC, (2005). Official methods of analysis of the
AOAC.(18th ed.). Washington: Association of
Official Analytical Chemists.
[36] Harrigan, W.F, McCance, M.E. (1990). Laboratory
methods in food and dairy microbiology. Academic
Press, London.
[37] Asai, T., Lizuka, H., Komagata, K. (1964). The
flagellation and taxonomy of genera Gluconobacter
and Acetobacter with reference to the existence of
intermediate strains. The Journal of General and
Applied Microbiology, 10(2), 95-126.
[38] Nazzaro, F., Fratianni, F., Nicolaus, B., Poli, A.,
Orlando, P. (2012). The prebiotic source influences
the growth biochemical features and survival under
simulated gastrointestinal conditions of the
probiotic Lactobacillus acidophilus. Anaerobe,
18(3), 280-285.
[39] Valero-Cases, E., Frutos, M.J. (2017). Effect of
inulin on the viability of Lactobacillus plantarum
during storage and in vitro digestion and on
composition parameters of vegetable fermented
juices. Plant Foods for Human Nutrition, 72(2),
161-167.
[40] Kim, E.S., Liang, Y.R., Jin, J., Sun, Q.F., Lu, J.L.,
Du, Y.Y., Lin, C. (2007). Impact of heating on
chemical compositions of green tea liquor. Food
Chemistry, 103(4), 1263-1267.
[41] Meilgaard, M. C., Giville, G. V., & Carr, B. T.
(1999). The spectrum descriptive analysis method
in sensory evaluation techniques. In: Sensory

N. Değirmencioğlu, E. Yıldız, Y. Şahan, M. Güldaş, O. Gürbüz Akademik Gıda 17(2) (2019) 200-211
210
Evaluation of Techniques (3rd ed., Chapter 11),
p:189-254, Boca Raton, FL: CRC Press.
http://dx.doi.org/10.1201/9781439832271
[42] Liu C. H., Hsu W.H., Lee F.L., Liao C.C. (1996).
The isolation and identification of microbes from a
fermented tea beverage, Haipao, and their
interactions during Haipao fermentation. Food
Microbiology, 13(6), 407-415.
[43] Chen C., Liu B.Y. (2000). Changes in major
components of tea fungus metabolites during
prolonged fermentation. Journal of Applied
Microbiology, 89(5), 834-839.
[44] Zubaidaha, E., Afgani, C.A., Kalsum, U., Sriantac,
I., Blanc, P. (2019). Comparison of in vivo
antidiabetes activity of snake fruit Kombucha, black
tea Kombucha and metformin. Biocatalysis and
Agricultural Biotechnology, 17, 465–469.
[45] Zubaidah, E., Apriyadi, T.E., Kalsum, U.,
Widyastuti, E., Estiasih, T., Srianta, I., Blanc, P.J.
(2018). In vivo evaluation of snake fruit Kombucha
as hyperglycemia therapeutic agent. International
Food Research Journal, 25(1), 453-457.
[46] Neffe-Skocińska, K., Sionek, B., Ścibisz, I.,
Kołożyn-Krajewska, D. (2017). Acid contents and
the effect of fermentation condition of Kombucha
tea beverages on physicochemical, microbiological
and sensory properties. CyTA - Journal of Food,
15(4), 601-607.
[47] Yang, Z., Zhou, F., Ji, B., Li, B., Luo, Y., Yang, L.,
Li, T. (2010). Symbiosis between microorganisms
from Kombucha and Kefir: potential significance to
the enhancement of Kombucha function. Applied
Biochemistry and Biotechnology, 160(2), 446-455.
[48] Sun, T.Z., Li, J.S., Chen, C. (2015). Effects of
blending wheatgrass juice on enhancing phenolic
compounds and antioxidant activities of traditional
kombucha beverage. Journal of Food and Drug
Analysis, 23(4), 709-718.
[49] Gramza-Michałowska, A., Kulczyński, B., Xindi, Y.,
Gumienna, M. (2016). Research on the effect of
culture time on the kombucha tea beverage’s
antiradical capacity and sensory value. Acta
Scientiarum Polonorum Technologia Alimentaria,
15(4), 447-457.
[50] Jayabalan, R., Subathradevi, P., Marimuthu, S.,
Satishkumar, M., -Swaminathan, K. (2008).
Changes in free-radical scavenging ability of
kombucha tea during fermentation. Food
Chemistry, 109(1), 227-234.
[51] Pure, A.E., Pure, M.E. (2016). Antioxidant and
antibacterial activity of kombucha beverages
prepared using banana peel, common nettles and
black tea infusions. Applied Food Biotechnology,
3(2),125-130.
[52] Güldane, M., Bayram, M., Topuz, S., Kaya, C.,
Gök, H.B., Bülbül, M., Koç, M. (2017). Beyaz, siyah
ve yeşil çay kullanılarak üretilen kombuchaların
bazı özelliklerinin belirlenmesi. Journal of
Agricultural Faculty of Gaziosmanpasa University
(JAFAG), 34(1), 46-56.
[53] Amarasinghe, H., Weerakkody, N.S., Waisundara,
V.Y. (2018). Evaluation of physicochemical
properties and antioxidant activities of kombucha
“Tea Fungus” during extended periods of
fermentation. Food Science and Nutrition, 6(3),
659-665.
[54] Primiani, N., Pujiati, M.M., Ardhi, I.S. (2018).
Kombucha fermentation test used for various types
of herbal Teas. Journal of Physics: Conference
Series,1025, 012073, 9p.
[55] Dufresne, C., Farnworth, E. (2000). Tea,
Kombucha, and health: a review. Food Research
International, 33(6), 409-421.
[56] Battikh, H., Chaieb, K., Bakhrouf, A., Ammar, E.
(2013). Antibacterial and antifungal activities of
black and green kombucha teas. Journal of Food
Biochemistry, 37(2), 231-236.
[57] Essawet, N.A., Cvetkovic, D., Velicanski, A.,
Canadanovic-Brunet, J., Vulic, J., Maksimovic, V.,
Markov, S. (2015). Polyphenols and antioxidant
activities of Kombucha beverage enriched with
Coffeberry extract. Chemical Industry and
Chemical Engineering Quarterly, 21(3), 399-409.
[58] Lv, H.P., Zhang, Y.J., Lin, Z., Liang, Y.R. (2013).
Processing and chemical constituents of Pu-erh
tea: A review. Food Research International, 53(2),
608-618.
[59] Gladysheva, E.K., Skiba, E.A., Zolotukhin, V.N.,
Sakovich, G.V. (2018). Study of the conditions for
the biosynthesis of bacterial cellulose by the
producer Medusomyces gisevii Sa-12. Applied
Biochemistry and Microbiology, 54(2), 179-187.
[60] Hubert, B., Eberl, L., Feucht, W. Polster, J. (2003).
Influence of polyphenols on bacterial biofilm
formation and quorum-sensing. Zeitschrift für
Naturforschung A, 58(11-12), 879-884.
[61] Ferrazzano, G.F., Amato, I., Ingenito, A., Zarrelli,
A., Pinto, G., Pollio, A. (2011). Plant polyphenols
and their anti-cariogenic properties: A review.
Molecules, 16(2), 1486-1507.
[62] Siddiqui, Md. W., Sharangi, A.B., Singh, J.P.,
Thakur, P.K., Ayala-Zaala, J. F., Singh, A., Dhua,
R.S. (2016). Antimicrobial properties of teas and
their extracts in vitro. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, 56(9), 1428-1439.
[63] Hu, Y., Jia, J., Qiao, J., Ge, C., Cao, Z. (2010).
Antimicrobial activity of pu-erh tea extracts in vitro
and its effects on the preservation of cooled
mutton. Journal of Food Safety, 30(1), 177-195.
[64] Hazra, A., Saha, J., Dasgupta, N., Sengupta, C.,
Kumar, P.M., Das, S. (2017). Health-benefit assets
of different Indian processed teas: a comparative
approach. American Journal of Plant Sciences,
8(7),1607-1623.
[65] Padmini, E., Valarmathi, A. Rani, M.U. (2010).
Comparative analysis of chemical composition and
antibacterial activities of Mentha spicata and
Camellia sinensis. Asian Journal of Experimental
Biological Sciences, 1(4), 772-781.
[66] Chan, E.W.C., Soh, E.Y., Tie, P.P. Law, Y.P.
(2011). Antioxidant and antibacterial properties of
green, black, and herbal teas of Camellia sinensis.
Pharmacognosy Research, 3(4), 266-272.
[67] Ansari, F., Pourjafar, H., Esmailpour, S. (2017).
Study on citric acid production and antibacterial
activity of kombucha green tea beverage during
production and storage. Annual Research and
Review in Biology, 16(3), 1-8.

N. Değirmencioğlu, E. Yıldız, Y. Şahan, M. Güldaş, O. Gürbüz Akademik Gıda 17(2) (2019) 200-211
211
[68] Jiang, H.Y. (2009) White tea: its manufacture,
chemistry, and health effects. In: Chemistry and
Health-Promoting Properties, Edited by Chi-Tang
Ho, Jen-Kun Lin, Fereidoon Shahidi, CRC Press,
Boca Raton-Florida, USA pp.17-29.
[69] Carloni, P., Tiano, L., Padella, L., Bacchetti, T.,
Customu, C., Kay, A. Damiani, E. (2013).
Antioxidant activity of white, green and black tea
obtained from the same tea cultivar. Food
Research International, 53(2), 900-908.
[70] Chen, M., Zhu, Y., Zhang, H., Wang, J., Liu, X.,
Chen, Z., Zheng, M., Liu, B. (2017). Phenolic
compounds and the biological effects of Puerh teas
with long-term storage, International Journal of
Food Properties, 20(8), 1715-1728.
[71] Duh, P.D., Yen, G.C., Yen, W.J., Wang, B.S.
Chang, L.W. (2004). Effects of pu-erh tea on
oxidative damage and nitric oxide scavenging.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(26),
8169-8176.
[72] Bancirova, M. (2010). Comparison of the
antioxidant capacity and the anti-microbial activity
of black and green tea. Food Research
International, 43(5),1379-82.
[73] Toda, M., Okubo, S., Hiyoshi, R., Shimamura, T.
(1989). The bactericidal activity of tea and coffee.
Letters in Applied Microbiology, 8(4), 123–125.
[74] Lee, Y.L., Cesario, T., Wang, Y., Shanbrom, E.,
Thrupp, L. (2003). Antibacterial activity of
vegetables and juices. Nutrition, 19(11-12), 994-
996.
[75] Yam, T.S., Shah, S., Hamilton-Miller, J.M.T.
(1997). Microbiology activity of whole and
fractionated crude extracts of tea (Camellia
sinensis), and of tea components. FEMS
Microbiology Letters, 152(1), 169-174.
[76] Sakanaka, S., Juneja, L.R., Tanigachi, M. (2000).
Antimicrobial effects of green tea polyphenols on
thermophilic spore-forming bacteria. Journal of
Bioscience and Bioengineering, 90(1), 81-85.
[77] Yokihiko, H., Watanabe, M. (1989). Antibacterial
activity of tea polyphenols against Clostridium
botulinum. Journal of Japanese Society of Food
Science Technology, 36(12), 951-955.
[78] Wu, S.C., Yen, G.C., Wang, B.S., Chiu, C.K., Yen,
W.J., Chang, L.W. Duh, P.D. (2007). Antimutagenic
and antimicrobial activities of pu-erh tea. LWT -
Food Science and Technology, 40(3), 506-512.
[79] Michalczyk, M. Zawislak, A. (2008). The effect of
tea infusions on the proliferation of selected
bacteria important for the human intestinal tract.
ACTA Scientiarum Polonorum Technologia
Alimentaria, 7(1), 59-65.
[80] EUCAST, (2018). European Committee on
Antimicrobial Susceptibility Testing, 20p (Erişim
tarihi: 27.07.2019,
https://www.ipna.csic.es/sites/default/files/users/us
er282/EUCAST%202018.pdf).
[81] Sreeramulu, G., Zhu, Y. Knol, W. (2001).
Characterization of antimicrobial activity in
Kombucha fermentation. Acta Biotechnologica,
21(1), 49-56.
[82] Mani-López, E., García, H.S., López-Malo, A.
(2012). Organic acids as antimicrobials to control
Salmonella inmeat and poultry products. Food
Research International, 45(2), 713-721.
[83] Ayed, L., Abid, S.B., Hamdi, M. (2017).
Development of a beverage from red grape juice
fermented with the Kombucha consortium. Annals
of Microbiology, 67(1), 111-121.
[84] Battıkh, H., Bakhrouf, A. Ammar, E. (2012).
Antimicrobial effect of Kombucha analogues. LWT -
Food Science and Technology, 47(1), 71-77.