ПРОМОТОРЫ ГЕНОВ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ В МАКРОФАГЕ, СОДЕРЖАТ ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ САЙТЫ СВЯЗЫВАНИЯ АРИЛ-ГИДРОКАРБОНОВОГО РЕЦЕПТОРА

Abstract

В связи с интенсивным техногенным воздействием на биосферу и обусловленным этим увеличением содержания в окружающей среде токсичных ксенобиотиков различной природы, в частности, ПАУ (полиароматических углеводородов) и диоксинов, все большую актуальность приобретают исследования, касающиеся характера вызываемых ими эффектов, механизмов их воздействия и метаболизма в живых организмах и, прежде всего, организма человека. В группу ПАУ входят десятки веществ, для которых характерно наличие в химической структуре трех и более конденсированных бензольных колец. Группа диоксинов объединяет сотни соединений, содержащих в своем составе специфическую гетероциклическую структуру с атомами хлора в качестве заместителей. Среди ксенобиотиков-соединений диоксинового ряда наиболее токсичным является 2,3,7,8-тетрахлордибензо-пара-диоксин или, сокращенно — 2,3,7,8-ТХДД (TCDD) [1,2] .
Показано, что на уровне организма диоксин вызывает широкий спектр системных эффектов, среди которых и воздействие на иммунную систему, в том числе и на клеточный иммунитет. Одним из элементов, участвующих в клеточном иммунном ответе, являются макрофаги. Известно, что на воздействие диоксина клетка отвечает изменением уровня экспрессии значительного числа генов, причем характер ответной реакции является видо- и тканеспецифичным [3-6]. Опубликованы результаты многочисленных экспериментов, выполненных на разных видах организмов, типах клеток, in vivo и in vitro, однако набор генов, вовлекаемых в ответ макрофага на диоксин, и механизмы их активации исследованы недостаточно.
С использованием биоинформатического метода SITECON нами исследованы регуляторные районы генов транскрипционных факторов, экспрессирующихся в активированном макрофаге, и генов факторов, опосредующих участие макрофага в иммунном ответе. В структуре этих районов у генов обоих типов выявлены специфические сайты (DRE), ответственные за реакцию на диоксин. Анализ регуляторных районов генов, формирующих иммунный ответ, показывает, что при воздействии диоксина их экспрессия может регулироваться двояким образом: транскрипционным фактором, содержащим в своем составе диоксин в качестве лиганда, и имманентными транскрипционными факторами.
Действие диоксина, как и многих других ксенобиотиков, на внутриклеточные процессы у позвоночных опосредуется арилгидрокарбоновым рецептором (AHR). AHR является лиганд-активируемым транскрипционным фактором из семейства bHLH/PAS, который регулирует транскрипцию генов, содержащих в структуре 5’ районов опознаваемые этим фактором специфические сайты - т.н. dioxin responsive elements (DRE). (Для их обозначения используется также аббревиатура XRE или AHRE [5]). Одним из экзогенных лигандов для AHR является диоксин. В отсутствие лиганда AhR находится в цитоплазме клетки в комплексе с шапероновым белком Hsp90 и белками-кошаперонами p23 и иммунофилин-подобным белком XAP2 (известным также как ARA9 или AIP). После связывания с лигандом комплекс перемещается в ядро и диссоциирует [7-8]. Оставшийся связанным с лигандом AHR димеризуется с белком ARNT (AhR Nuclear Translocator), который также принадлежит к семейству bHLH. Комплекс лиганд-AHR-ARNT функционирует как транскрипционный фактор, связываясь с последовательностями DRE в регуляторных районах генов-мишеней [5, 9]. Коровой консенсусной последовательностью DRE является 5’-GCGTG-3’ [5]. При этом AHR контактирует с 5’-TNGC, а ARNT – с GTG-3’ полусайтами консенсусной последовательности [3]. Роль лиганда в этом комплексе пока не ясна.
При воздействии диоксина изменение экспрессии генов может происходить как вследствие прямого взаимодействия рецепторного комплекса с DRE в их регуляторных районах, так и опосредованно – по механизму каскадной регуляции через цепочку взаимодействующих генов с участием генов транскрипционных факторов.
Возможность прямой регуляции экспрессии показана экспериментально для целого ряда генов макрофага, экспрессирующихся в ответ на диоксин. Однако вклад транскрипционных факторов в ответе макрофага на диоксин изучен слабо.
В настоящее время, наряду с экспериментальными, все большее распространение получают биоинформатические методы выявления DRE в структуре генов. В основном эти методы базируются на контекстном анализе первичных последовательностей ДНК. В частности, с использованием метода весовых матриц потенциальные DRE были выявлены в структуре 48 из 2437 ортологичных генов, подвергнутых анализу [3].
Для поиска DRE в регуляторных районах генов нами использован метод SITECON [10]. Метод основан на выявлении консервативных контекстно-зависимых конформационных и физико-химических свойств, определенных для набора коротких фрагментов последовательностей сайтов ДНК, опознаваемых факторами транскрипции, и последующего сравнения выявленных консервативных свойств со свойствами анализируемой последовательности. Для обучения была использована выборка bona fide DRE, включающая 13 последовательностей [3]. Критерием принадлежности тестируемой последовательности к DRE функциональным сайтам является уровень ее конформационного сходства с последовательностями обучающей выборки при заданном значении ошибки распознавания. Для идентификации сайтов DRE был выбран уровень сходства P=0.95 при котором ошибка I-го рода (недопредсказание) равна нулю.
Cравнение результатов использования SITECON для поиска сайтов DRE с методом весовых матриц показало более высокую эффективность SITECON [11]. Высокая предсказательная способность метода SITECON метода получила и экспериментальное подтверждение при проверке связывания транскрипционных факторов SF-1 и SREBP с предсказанными потенциальными сайтами связывания [12].

Результаты распознавания суммированы в табл. 1.
Таблица 1. Сайты DRE в генах транскрипционных факторов, экспрессирующихся в активированном макрофаге

Короткое название гена Полное
название/синоним Позиция сайта Уровень сходства (P) Нуклеотидная последовательность потенциального DRE сайта
CEBPβ C/EBPβ (CCAAT/
enhancer binding protein)
NF-IL6 -68
-217 0.968
0.966 GGCCGGCGTGACGC AGGGGGCGTGAGGC
NFkB1 nuclear factor-kB1 p50/ p105 -65 0.985 CCGCTGCGTGCGCG
NFkB2 nuclear factor-kB2 p49/ p100/ p52 -132 0.967 GCGAGGCGTGACGC
RelA p65/ NFkB3 -110
-137
-199 0.970
0.987
0.972 GCGCGGCGTGCACT GCTGTGCGTGCAGC GGCTGGCGTGCCCG
RelB I-Rel/ v-rel
reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B -100
-249 0.968
0.967 CCCAGGCGTGACGT GTAAGGCGTGATGG
c-Rel c-Rel proto-oncogene -207
-346 0.975
0.974 GGGGAGCGTGCGCG TAGCAGCGTGAGAA
JUN Proto-oncogene c-jun -180 0.970 GAGAGGCGTGCGGC
IRF1 Interferon regulatory factor 1 -145 0.985 CGGCTGCGTGCCGT
IRF4 Interferon regulatory factor 4 -172 0.968 GGCCGGCGTGAAGG
STAT3 Signal Transducer and Activator of Transcription 3 -57
-349
-586 0.970
0.984
0.983 TGACGGCGTGCCTC GCAGTGCGTGACGT TTTCTGCGTGAGCA

Показателями, позволяющими оценить выявленные сайты как потенциально активные DRE, являлись их позиция и высокий уровень сходства по критерию SITECON.
Такие сайты обнаружены в промоторных районах десяти из тринадцати генов транскрипционных факторов, функционирующих в активированном макрофаге. Выявлено по три таких сайта для генов NFkB3 и STAT3, по два для CEBPβ и RelB и по одному для NFkB1, NFkB2, JUN, IRF1и IRF4 (табл. 1).
Одиночные DRE в промоторах во всех случаях расположены не далее, чем за 200 оснований от старта транскрипции (в положении -65, -135, -180, -145, -172 для NFkB1, NFkB2, JUN, IRF1 и IRF4 соответственно).
В промоторах обоих генов CEBPβ и RelB пары DRE разделены всего 135 основаниями.
Два из трех DRE в промоторе STAT3 расположены на более значительном расстоянии от старта, чем сайты в промоторах других генов – в позициях -349 и -586, зато третий DRE найден на минимальном расстоянии – ¬¬в позиции -57.
В промоторе NFkB3 три DRE расположены на участке длиной около девяноста оснований. Полагают, что наличие нескольких, в особенности тандемно расположенных функциональных DRE сайтов в составе регуляторного района могут за счет кооперативного эффекта обеспечивать реактивность соответствующего гена на более низкие концентрации комплекса лиганд-ксенобиотик и возможность более тонкой регуляции его активности [9].
Присутствующая нуклеотидная гетерогенность DRE может создавать более широкое разнообразие вариантов ответа на комплекс ксенобиотик-лиганд за счет разной афинности к комплексу сайтов различного состава [13-14].
Кроме указанных в табл. 1, потенциальные сайты DRE на более значительных расстояниях выше старта транскрипции, а также ниже позиции старта были обнаружены как в регуляторных районах генов, перечисленных в табл.1, так и генов IRF2, IRF7, STAT1α, не включенных в нее (данные не приведены). Учитывая, что DRE обладают свойствами энхансеров [14], эти элементы также могут оказаться функционально активными.
Одной из важнейших функций макрофага является выработка различных регуляторных факторов, участвующих в формировании иммунных реакций организма. Установлено, что экспрессия многих генов, кодирующих секретируемые макрофагом регуляторные белки или ферменты, участвующие в синтезе простагландинов, регулируются транскрипционными факторами, поименованными в табл. 1.
В табл. 2 приведен список генов, участвующих в формировании иммунного ответа, и транскрипционных факторов, регулирующих их активность. Экспрессия почти всех этих генов контролируется транскрипционным фактором NFkB (nuclear factor kappa B). Этому фактору принадлежит основная роль внутриклеточного медиатора разнообразных внешних воздействий в некоторых типах клеток, в том числе, макрофагах, где он инициирует запуск механизма системы неспецифического иммунного ответа через активацию экспрессии ряда генов ферментов, провоспалительных цитокинов (IFNα, β, IL-1, IL-6 и IL-8, TNFα), хемокинов (MCP-1, MIP-1, RANTES).

Таблица 2. Гены цитокинов и других факторов, участвующих в формировании иммунного ответа, содержащие в структуре регуляторных районов DRE, и транскрипционные факторы, регулирующие их активность.

Короткое название гена Полное название и функция продукта Транскрипционный фактор
COX-2 Cyclooxygenase 2,
фермент NFkB, C/EBPβ, JUN
IFNA Interferon alpha,
интерферон IRF1
IFNB Interferon beta,
интерферон NFkB, IRF1
IFN-γ Interferon gamma,
интерферон NFkB
IL1B Interleukin 1 beta,
монокин NFkB, C/EBPβ, IRF4
IL-6 interleukin 6,
лимфокин NFkB, C/EBPβ
IL-8 interleukin 8,
хемокин NFkB, C/EBPβ
IL12A Interleukin-12A,
монокин NFkB, IRF1, C/EBPβ
IL12B interleukin 12B,
монокин NFkB, IRF1
MCP-1 macrophage chemotactic protein-1, хемокин NFkB
MIP1α macrophage inflammatory protein 1 alpha,
провоспалительный хемокин NFkB, C/EBPβ
MIP1β macrophage inflammatory protein 1 beta, провоспалительный хемокин NFkB
RANTES Regulated on Activation, Normal T- lymphocyte Expressed and Secreted,
хемокин NFkB, IRF1, JUN,
C/EBPβ
TNF-α Tumor necrosis factor alpha,
провоспалительный цитокин NFkB, C/EBPβ, JUN

Следует отметить, что, согласно литературным данным, экспрессия гена одного и того же цитокина в большинстве случаев регулируется несколькими транскрипционными факторами, что увеличивает реактивность системы ответа, создавая возможность синергичного эффекта при их сочетанном действии [15].
Значительная часть из списка генов, приведенных в табл.2, регулируется комплексом транскрипционных факторов, располагающих в структуре своих промоторных районов. По нашим данным, некоторые из названных генов также обладают DRE. Так, в регуляторных областях генов Il12A и Il12B DRE выявлены на расстоянии -612 и -598 от старта транскрипции соответственно (данные не опубл.). Таким образом, создается возможность двойного контроля активности цитокиновых генов с каскадной регуляцией интегрированного ответа макрофага на ксенобиотик.
Вероятно, что механизмы ответа макрофага на ксенобиотик и на факторы, активирующие формирование реакций иммунного ответа, тесно связаны. Так, например, на ранних стадиях инфекционного заболевания макрофаги секретируют провоспалительные цитокины: интерлейкины–1, 2, 6, 12 и фактор некроза опухоли (TNF-a), а также хемокины. Но экспрессия одноименных генов может стимулироваться и воздействием диоксина.
Все приведенные в табл.1 гены транскрипционных факторов не только содержат в составе своих регуляторных районов DRE, что обеспечивает возможность прямого ответа на воздействие ПАУ, но и являются важнейшими компонентами, участвующими в выполнении макрофагами их основной функции – осуществлении иммунного ответа.
Логично предположить, что система реакции на ксенобиотик организована по иерархическому принципу. Роль иммунотропного пускового звена в этой системе отводится ксенобиотику. В комплексе с AhR ксенобиотик контролирует экспрессию DRE-содержащих генов транскрипционных факторов, которые, в свою очередь, регулируют экспрессию генов цитокинов и других белков, обеспечивающих как неспецифический иммунный ответ, так и/или иммунную реакцию специфического типа.
Поскольку гены, задействованные в реализации иммунного ответа, располагают и DRE, принципиально возможно и одновременное, а не последовательное, выполнение этих процессов. Таким образом, ксенобиотик способен активировать и/ или модифицировать иммунный ответ организма, подвергшегося его воздействию.
Наличие двойной регуляции – через DRE и сайты связывания соответствующих транскрипционных факторов, а также отношения взаимной регуляции между генами, входящими в систему обеспечения иммунного ответа, создают возможность быстрой реакции системы на провоцирующий агент (ксенобиотик) и точную подстройку ее функционирования.

Работа поддержана проектами “Компьютерное моделирование и экспериментальное конструирование генных сетей” по Программе фундаментальных исследований РАН “Молекулярная и клеточная биология” и интеграционным проектом СО РАН “Эволюция молекулярно-генетических систем: компьютерный анализ и моделирование” по Подпрограмме II Программы РАН “Происхождение и эволюция биосферы”.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Walker N.J., Portier C.J., Lax S.F., Crofts F.G., Li Y., Lucier G.W., Sutter T.R. // Toxicol Appl Pharmacol. 1999. V. 154(3). P. 279-286.
2. Zodrow J.M., Stegeman J.J., Tanguay R.L. // Aquat Toxicol.. 2004. V. 66. P. 25-38.
3. Sun Y. V., Boverho f D. R., Burgoon L. D., Fielden M. R., Zacharewski T. R. // Nucleic Acids Research. 2004. V. 32. No. 15. P. 4512–4523.
4. Connor K. T., .Aylward L. L. // Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 2006. V. 9. No. 2. P. 147-171.
5. Boutros P.C., Moffat I.D., Franc M.A., Tuomisto J., Okey A.B. // J. Bichem. Biphys. Res. Commun. 2004. P. 707-715.
6. Frericks M., Meissner M., Esser Ch. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2007, doi:10.1016/j.taap.2007.01.014.
7. Kazlauskas A., Sundstrom S., Poellinger L., Pongratz I. // Mol Cell Biol. 2001. V. 21. P. 2594–2607.
8. Okey, A.B. // Toxicol. Sci. 2007. V. 98. P. 5–38
9. Fujita, H., Samejima, H., Kitagawa, N., Mitsuhashi, T., Washio, T., Yonemoto, J., Tomita, M., Takahashi, T., and Kosaki, K. // Cong. Anom. 2006. V. 46. P. 135–143.
10. Oshchepkov D.Y., Vityaev E.E., Grigorovich D.A., Ignatieva E.V., Khlebodarova T.M. // Nucl. Acids Res. 2004. V. 32 (Web Server issue). W208-212.
11. Nedosekina EA, Oshchepkov DY, Katokhin AV, Kuznetsova TN, Shamanina MY, Mordvinov VA, Tsyrlov I . // Organohalogen Compounds. 2007.V. 69. P. 1889-1892.
12. Kolchanov N.A., Merkulova T.I., Ignatieva E.V., Ananko E.A., Oshchepkov D.Yu., Levitsky V.G., Vasiliev G. V., Klimova N.V., Merkulov V.M., Hodgman Ch. T. // Briefings in Bioinformatics. 2007. V.8. P. 266-274.
13. Lusska, A., Shen, E., and James, P.W., Jr. // J. Biol.Chem. 1993. V. 268. P. 6575-6580.
14. Denison M.S., Fisher J.M., Whitlock J.P. Jr. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 2528-2532.
15. Baer, M., Williams, S.C., Dillner, A., Schwartz, R.C. and Johnson, P. F. // Blood. 1998. V. 92. P. 4353-4365.

1Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, д.10
2Новосибирский государственный университет, 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, д.2
3Медицинская Школа Маунт Синай, Нью-Йорк, США

Full text

БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ






 

Д.П. Фурман1,2, Е.А. Ощепкова1, Д.Ю. Ощепков1, М.Ю.
Шаманина1, И.Б. Цырлов3, В.А. Мордвинов1

В связи с интенсивным техногенным воздействием на
биосферу и обусловленным этим увеличением содержания в
окружающей среде токсичных ксенобиотиков различной
природы, в частности, ПАУ (полиароматических углеводородов)
и диоксинов, все большую актуальность приобретают
исследования, касающиеся характера вызываемых ими
эффектов, механизмов их воздействия и метаболизма в живых
организмах и, прежде всего, организма человека. В группу ПАУ
входят десятки веществ, для которых характерно наличие в
химической структуре трех и более конденсированных
бензольных колец. Группа диоксинов объединяет сотни
соединений, содержащих в своем составе специфическую
гетероциклическую структуру с атомами хлора в качестве
заместителей. Среди ксенобиотиков-соединений диоксинового
ряда наиболее токсичным является 2,3,7,8-тетрахлордибензо-
пара-диоксин или, сокращенно — 2,3,7,8-ТХДД (TCDD) [1,2] . 

Показано, что на уровне организма диоксин вызывает
широкий спектр системных эффектов, среди которых и
воздействие на иммунную систему, в том числе и на клеточный
иммунитет. Одним из элементов, участвующих в клеточном
иммунном ответе, являются макрофаги. Известно, что на
воздействие диоксина клетка отвечает изменением уровня
экспрессии значительного числа генов, причем характер
ответной реакции является видо- и тканеспецифичным [3-6].
Опубликованы результаты многочисленных экспериментов,
выполненных на разных видах организмов, типах клеток, 
и однако набор генов, вовлекаемых в ответ макрофага на
диоксин, и механизмы их активации исследованы недостаточно.
С использованием биоинформатического метода SITECON
нами исследованы регуляторные районы генов
транскрипционных факторов, экспрессирующихся в
активированном макрофаге, и генов факторов, опосредующих
участие макрофага в иммунном ответе. В структуре этих
районов у генов обоих типов выявлены специфические сайты
(DRE), ответственные за реакцию на диоксин. Анализ
регуляторных районов генов, формирующих иммунный ответ,
показывает, что при воздействии диоксина их экспрессия может
регулироваться двояким образом: транскрипционным фактором,
содержащим в своем составе диоксин в качестве лиганда, и
имманентными транскрипционными факторами.
Действие диоксина, как и многих других ксенобиотиков, на
внутриклеточные процессы у позвоночных опосредуется
арилгидрокарбоновым рецептором (AHR). AHR является

лиганд-активируемым транскрипционным фактором из
семейства bHLH/PAS, который регулирует транскрипцию генов,
содержащих в структуре 5’ районов опознаваемые этим
фактором специфические сайты - т.н. dioxin responsive elements
(DRE). (Для их обозначения используется также аббревиатура
XRE или AHRE [5]). Одним из экзогенных лигандов для AHR
является диоксин. В отсутствие лиганда AhR находится в
цитоплазме клетки в комплексе с шапероновым белком Hsp90 и
белками-кошаперонами p23 и иммунофилин-подобным белком
XAP2 (известным также как ARA9 или AIP). После связывания
с лигандом комплекс перемещается в ядро и диссоциирует [7-8].
Оставшийся связанным с лигандом AHR димеризуется с белком
ARNT (AhR Nuclear Translocator), который также принадлежит к
семейству bHLH. Комплекс лиганд-AHR-ARNT функционирует
как транскрипционный фактор, связываясь с
последовательностями DRE в регуляторных районах генов-
мишеней [5, 9]. Коровой консенсусной последовательностью
DRE является 5’-GCGTG-3’ [5]. При этом AHR контактирует с
5’-TNGC, а ARNT – с GTG-3’ полусайтами консенсусной
последовательности [3]. Роль лиганда в этом комплексе пока не
ясна.
При воздействии диоксина изменение экспрессии генов
может происходить как вследствие прямого взаимодействия
рецепторного комплекса с DRE в их регуляторных районах, так
и опосредованно – по механизму каскадной регуляции через
цепочку взаимодействующих генов с участием генов
транскрипционных факторов.

Возможность прямой регуляции экспрессии показана
экспериментально для целого ряда генов макрофага,
экспрессирующихся в ответ на диоксин. Однако вклад
транскрипционных факторов в ответе макрофага на диоксин
изучен слабо.
В настоящее время, наряду с экспериментальными, все
большее распространение получают биоинформатические
методы выявления DRE в структуре генов. В основном эти
методы базируются на контекстном анализе первичных
последовательностей ДНК. В частности, с использованием
метода весовых матриц потенциальные DRE были выявлены в
структуре 48 из 2437 ортологичных генов, подвергнутых
анализу [3].
Для поиска DRE в регуляторных районах генов нами
использован метод SITECON [10]. Метод основан на
выявлении консервативных контекстно-зависимых
конформационных и физико-химических свойств, определенных
для набора коротких фрагментов последовательностей сайтов
ДНК, опознаваемых факторами транскрипции, и последующего
сравнения выявленных консервативных свойств со свойствами
анализируемой последовательности. Для обучения была
использована выборка  DRE, включающая 13
последовательностей [3]. Критерием принадлежности
тестируемой последовательности к DRE функциональным
сайтам является уровень ее конформационного сходства с
последовательностями обучающей выборки при заданном
значении ошибки распознавания. Для идентификации сайтов

DRE был выбран уровень сходства P=0.95 при котором ошибка
I-го рода (недопредсказание) равна нулю.
Cравнение результатов использования SITECON для поиска
сайтов DRE с методом весовых матриц показало более высокую
эффективность SITECON [11]. Высокая предсказательная
способность метода SITECON метода получила и
экспериментальное подтверждение при проверке связывания
транскрипционных факторов SF-1 и SREBP с предсказанными
потенциальными сайтами связывания [12].

Результаты распознавания суммированы в табл. 1.
!"#$%!  &' Сайты DRE в генах транскрипционных факторов,
экспрессирующихся в активированном макрофаге

Короткое
название
гена
Полное
название/синоним
Позиция
сайта
Уровень
сходства
(P)
Нуклеотидная
последовательность
потенциального DRE сайта


C/EBPβ (CCAAT/
enhancer binding
protein)
NF-IL6
-68
-217
0.968
0.966
GGCCGGCGTGACGC
AGGGGGCGTGAGGC
  nuclear factor-kB1
p50/ p105
-65 0.985 CCGCTGCGTGCGCG
 ! nuclear factor-kB2
p49/ p100/ p52
-132 0.967 GCGAGGCGTGACGC
"#$
p65/ NFkB3 -110
-137
-199
0.970
0.987
0.972
GCGCGGCGTGCACT
GCTGTGCGTGCAGC
GGCTGGCGTGCCCG
"# I-Rel/ v-rel
reticuloendotheliosis
viral oncogene
homolog B
-100
-249
0.968
0.967
CCCAGGCGTGACGT
GTAAGGCGTGATGG
%&"# c-Rel proto-oncogene -207
-346
0.975
0.974
GGGGAGCGTGCGCG
TAGCAGCGTGAGAA
'( Proto-oncogene c-jun -180 0.970 GAGAGGCGTGCGGC
)" Interferon regulatory
factor 1
-145 0.985 CGGCTGCGTGCCGT
)" Interferon regulatory
factor 4
-172 0.968 GGCCGGCGTGAAGG
*+$+ Signal Transducer
and Activator of
Transcription 3
-57
-349
-586
0.970
0.984
0.983
TGACGGCGTGCCTC
GCAGTGCGTGACGT
TTTCTGCGTGAGCA


Показателями, позволяющими оценить выявленные сайты
как потенциально активные DRE, являлись их позиция и
высокий уровень сходства по критерию SITECON.
Такие сайты обнаружены в промоторных районах десяти из
тринадцати генов транскрипционных факторов,
функционирующих в активированном макрофаге. Выявлено по
три таких сайта для генов   и*+$+по два для 

,и
"# и по одному для  !'()"-)"(табл. 1).
Одиночные DRE в промоторах во всех случаях расположены
не далее, чем за 200 оснований от старта транскрипции (в
положении -65, -135, -180, -145, -172 для  !'(
)"-)" соответственно).
В промоторах обоих генов 

,и"# пары DRE
разделены всего 135 основаниями.
Два из трех DRE в промоторе *+$+расположены на более
значительном расстоянии от старта, чем сайты в промоторах
других генов – в позициях -349 и -586, зато третий DRE найден
на минимальном расстоянии – в позиции -57.
В промоторе  три DRE расположены на участке
длиной около девяноста оснований. Полагают, что наличие
нескольких, в особенности тандемно расположенных
функциональных DRE сайтов в составе регуляторного района
могут за счет кооперативного эффекта обеспечивать
реактивность соответствующего гена на более низкие
концентрации комплекса лиганд-ксенобиотик и возможность
более тонкой регуляции его активности [9].

Присутствующая нуклеотидная гетерогенность DRE может
создавать более широкое разнообразие вариантов ответа на
комплекс ксенобиотик-лиганд за счет разной афинности к
комплексу сайтов различного состава [13-14].
Кроме указанных в табл. 1, потенциальные сайты DRE на
более значительных расстояниях выше старта транскрипции, а
также ниже позиции старта были обнаружены как в
регуляторных районах генов, перечисленных в табл.1, так и
генов)"!)"*+$+., не включенных в нее (данные не
приведены). Учитывая, что DRE обладают свойствами
энхансеров [14], эти элементы также могут оказаться
функционально активными.
Одной из важнейших функций макрофага является
выработка различных регуляторных факторов, участвующих в
формировании иммунных реакций организма. Установлено, что
экспрессия многих генов, кодирующих секретируемые
макрофагом регуляторные белки или ферменты, участвующие в
синтезе простагландинов, регулируются транскрипционными
факторами, поименованными в табл. 1.
В табл. 2 приведен список генов, участвующих в
формировании иммунного ответа, и транскрипционных
факторов, регулирующих их активность. Экспрессия почти всех
этих генов контролируется транскрипционным фактором ()*+
(nuclear factor kappa B). Этому фактору принадлежит основная
роль внутриклеточного медиатора разнообразных внешних
воздействий в некоторых типах клеток, в том числе, макрофагах,
где он инициирует запуск механизма системы неспецифического

иммунного ответа через активацию экспрессии ряда генов
ферментов, провоспалительных цитокинов ()./)0&,)0&-
)0&1+.), хемокинов (2&2)&"$+*).
,
!"#$%!  -' Гены цитокинов и других факторов, участвующих в
формировании иммунного ответа, содержащие в структуре регуляторных
районов DRE, и транскрипционные факторы, регулирующие их активность.

Короткое
название
гена
Полное названиеи функция
продукта Транскрипционный
фактор
34&! Cyclooxygenase 2, 
фермент
()*+./0+1,23(
)$ Interferon alpha,
интерферон
45)&
) Interferon beta,
интерферон
()*+45)&
)&5 Interferon gamma,
интерферон
()*+
)0 Interleukin 1 beta,
монокин
()*+,./0+1
45)6
)0& interleukin 6,
лимфокин
()*+,./0+1
)0&1 interleukin 8,
хемокин
()*+./0+1
)0!$ Interleukin-12A,
монокин
()*+45)&./0+1
)0! interleukin 12B,
монокин
()*+45)&
2& macrophage chemotactic protein-1,
хемокин
()*+
2)

macrophage inflammatory protein 1
alpha,
провоспалительный хемокин
()*+./0+1
2)

macrophage inflammatory protein 1
beta, провоспалительный хемокин
()*+
"$+* Regulated on Activation, Normal T-
lymphocyte Expressed and Secreted,
хемокин
()*+,45)&23(
./0+1
+&

Tumor necrosis factor alpha,
провоспалительный цитокин
()*+./0+1,23(


Следует отметить, что, согласно литературным данным,
экспрессия гена одного и того же цитокина в большинстве
случаев регулируется несколькими транскрипционными
факторами, что увеличивает реактивность системы ответа,
создавая возможность синергичного эффекта при их сочетанном
действии [15].
Значительная часть из списка генов, приведенных в табл.2,
регулируется комплексом транскрипционных факторов,
располагающих в структуре своих промоторных районов. По
нашим данным, некоторые из названных генов также обладают
DRE. Так, в регуляторных областях генов )#!$ и )#! DRE
выявлены на расстоянии -612 и -598 от старта транскрипции
соответственно (данные не опубл.). Таким образом, создается
возможность двойного контроля активности цитокиновых генов
с каскадной регуляцией интегрированного ответа макрофага на
ксенобиотик.
Вероятно, что механизмы ответа макрофага на ксенобиотик и
на факторы, активирующие формирование реакций иммунного
ответа, тесно связаны. Так, например, на ранних стадиях
инфекционного заболевания макрофаги секретируют
провоспалительные цитокины: интерлейкины–1, 2, 6, 12 и
фактор некроза опухоли (TNF-a), а также хемокины. Но
экспрессия одноименных генов может стимулироваться и
воздействием диоксина.
Все приведенные в табл.1 гены транскрипционных факторов
не только содержат в составе своих регуляторных районов DRE,
что обеспечивает возможность прямого ответа на воздействие

ПАУ, но и являются важнейшими компонентами,
участвующими в выполнении макрофагами их основной
функции – осуществлении иммунного ответа.
Логично предположить, что система реакции на ксенобиотик
организована по иерархическому принципу. Роль
иммунотропного пускового звена в этой системе отводится
ксенобиотику. В комплексе с AhR ксенобиотик контролирует
экспрессию DRE-содержащих генов транскрипционных
факторов, которые, в свою очередь, регулируют экспрессию
генов цитокинов и других белков, обеспечивающих как
неспецифический иммунный ответ, так и/или иммунную
реакцию специфического типа.
Поскольку гены, задействованные в реализации иммунного
ответа, располагают и DRE, принципиально возможно и
одновременное, а не последовательное, выполнение этих
процессов. Таким образом, ксенобиотик способен активировать
и/ или модифицировать иммунный ответ организма,
подвергшегося его воздействию.
Наличие двойной регуляции – через DRE и сайты связывания
соответствующих транскрипционных факторов, а также
отношения взаимной регуляции между генами, входящими в
систему обеспечения иммунного ответа, создают возможность
быстрой реакции системы на провоцирующий агент
(ксенобиотик) и точную подстройку ее функционирования.

Работа поддержана проектами “Компьютерное
моделирование и экспериментальное конструирование генных

сетей” по Программе фундаментальных исследований РАН
“Молекулярная и клеточная биология” и интеграционным
проектом СО РАН “Эволюция молекулярно-генетических
систем: компьютерный анализ и моделирование” по
Подпрограмме II Программы РАН “Происхождение и эволюция
биосферы”.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. 6# ''07*890:0;%
96*;+"// Toxicol Appl Pharmacol. 1999. V. 154(3). P.
279-286.
2. <='2*>?''+>;@"0// Aquat Toxicol..
2004. V. 66. P. 25-38.
3. *;:ABC";>0C#2"
<%B=8 +"// Nucleic Acids Research. 2004. V. 32. No. 15.
P. 4512–4523.
4. D+$@#=00 // Journal of Toxicology and
Environmental Health, Part B. 2006. V. 9. No. 2. P. 147-171.
5. ;82)C%2$+;?8'3 @$//
J. Bichem. Biphys. Res. Commun. 2004. P. 707-715.
6. % 82288288B // Toxicol. Appl. Pharmacol.
2007, doi:10.1016/j.taap.2007.01.014.
7. DE#;8 8$*;8?*##>0>E)// Mol
Cell Biol. 2001. V. 21. P. 2594–2607.
8. 3 @$. // Toxicol. Sci. 2007. V. 98. P. 5–38

9. ;FG*?F?GD>=28;B8B+68B
+:?'+?2+ B8B+D8 D //
Cong. Anom. 2006. V. 46. P. 135–143.
10. 38B%BH C:A@9>%BC$)>
ADB#+2 // Nucl. Acids Res. 2004. V. 32 (Web
Server issue). W208-212.
11. 8 $38B%BH C:D B$AD;E8+
*B?2:2A$+8@#) // Organohalogen
Compounds. 2007.V. 69. P. 1889-1892.
12. D#%B$2 ;#+))>A$ $
38B%BH C:;08 @A9A8#9AD#?A
2 ;#A2,G>?B +// Briefings in Bioinformatics.
2007. V.8. P. 266-274.
13. 0;88 $*B'?86'// J. Biol.Chem. 1993.
V. 268. P. 6575-6580.
14. C82*8B'26B#% '' // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 1988. V. 85. P. 2528-2532.
15. 26##?8*,C##$*%B=E"
'B8// Blood. 1998. V. 92. P. 4353-4365.
,


1Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090 Новосибирск,
пр. Лаврентьева, д.10
2Новосибирский государственный университет, 630090
Новосибирск, ул. Пирогова, д.2
3Медицинская Школа Маунт Синай, Нью-Йорк, США
