GERMINAÇÃO e CALOGÊNESE in vitro DE BARBATIMÃO (Stryphnodendron adstringens): UMA ESTRATÉGIA PARA PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS

Full text

Anais do III CoBICET – Trabalho completo
Congresso Brasileiro Interdisciplinar em Ciência e Tecnologiaa
“15 anos dos BIs e LIs: retrospectiva, resistência e futuro”
Evento online – 29 de agosto a 02 de setembro de 2022
www.even3.com.br/cobicet2022
GERMINAÇÃO e CALOGÊNESE in vitro DE BARBATIMÃO
(Stryphnodendron adstringens): UMA ESTRATÉGIA PARA PRODUÇÃO
DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
Marion Nayon Braga Soares1, Maria Cristina Rocha Silva1, Givago Lopes Alves1, Thais
Roseli Corrêa1, Fábio Afonso Mazzei Moura de Assis Figueiredo1, Marcos Vinícius
Marques Pinheiro1*
1Universidade Estadual do Maranhão, São Luís, MA, Brasil. *E-mail:
macvini@gmail.com
Resumo: Objetivou-se realizar a calogênese in vitro de barbatimão a partir de diferentes
concentrações de fitohormônios. Para isso, os explantes foram inoculados em meios de
cultura com concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP, 10, 20, 30μM) e ácido
naftalenoacético (ANA, 10, 20, 30μM), e posterior manutenção em sala de crescimento
(escuro). Aos 21 dias, folhas verdadeiras e cotiledonares mantidas em T1-
MS+BAP(10μM)+ANA(10μM) e T6-MS+BAP(30μM)+ANA(30μM) produziram maior
formação de calos.
Palavras-chave: Fabaceae; Cultura de Tecidos; Micropropagação; Metabólitos
secundários
INTRODUÇÃO
O Cerrado é conhecido pela sua riqueza biológica,
tornando-se um dos 35 hotspots em biodiversidade
do mundo, possuindo, aproximadamente, 11.627
espécies de plantas nativas (MMA, 2019). É o
segundo maior bioma do Brasil, ocupando 22% do
território nacional, distribuído nos estados de Minas
Gerais, Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul,
Tocantins, Bahia, Piauí, Maranhão, São Paulo e
Distrito Federal (IBGE, 2019). Este bioma possui
extensa fonte de plantas medicinais, possuindo
variedade de espécies farmacológicas; com o uso
extensivo na medicina popular, corroborando para
que o estudo destas plantas tornasse uma ciência
fundamentada em procedimentos experimentais.
Dentre as espécies deste bioma, destaca-se o
barbatimão (Stryphnodendron adstringens), árvore de
pequeno porte, hermafrodita, caducifólia, tronco
tortuoso, áspero grosso e de cor clara. O barbatimão
tem sido usado por comunidades tradicionais,
principalmente por meio da administração tópica de
preparações por infusões, macerações e decocções
das cascas do caule (de Carvalho et al., 2019; de
Carvalho et al., 2020), justificado pelas suas
propriedades antimicrobianas, atividades
cicatrizantes, anti-inflamatória, antioxidante (Souza-
Moreira et al., 2018).
Em regiões com pouco desenvolvimento
socioeconômico, a utilização de plantas medicinais,
geralmente é empírica, e os conhecimentos são
passados entre gerações, sendo que, essa cultura
ainda persiste nas regiões do Cerrado brasileiro (Neto
et al., 2020). Dessa forma, devido às inúmeras
aplicações e benefícios, o barbatimão está ameaçado
pelo excesso de cortes ilegais, urbanização
desordenada e agravada pela irregularidade
germinativa (dormência), fragmentando seu hábitat,
deixando-as expostas aos efeitos de borda,
comprometendo a sua estrutura populacional dentro
da comunidade na qual está inserida (Meira et al.,
2013). A dormência germinativa desta espécie é uma
estratégia de sobrevivência, o que permite superar
condições ambientais desfavoráveis, tais como o fogo
e os períodos de seca, comumente observados nesse
bioma, e durante épocas de frutificação e dispersão
das sementes de barbatimão (Martins et al., 2008).
Com a utilização das técnicas de cultura de tecidos,
dentre estas a micropropagação, será possível a
obtenção de plantas em larga escala, em curto espaço
de tempo e dentro de uma pequena área, produzindo
mudas livres de doenças, independentemente da
época e das condições meteorológicas, assim,
desponta como uma ferramenta eficaz para reverter a
maturação de material adulto utilizado como fonte de
explante (Esposito-Polesi, 2020).
Plantas inteiras podem ser regeneradas a partir de
células vegetais cultivadas in vitro, direta ou
indiretamente (sendo esta intervindo pela formação
de calos) via organogênese ou embriogênese
somática, processos estes que necessariamente
necessitam ser induzidos (Feher, 2019).
O calo é um tecido transitório, com células
indiferenciadas (Feher, 2019), e este vem sendo

Anais do III CoBICET – Trabalho completo
Congresso Brasileiro Interdisciplinar em Ciência e Tecnologiaa
“15 anos dos BIs e LIs: retrospectiva, resistência e futuro”
Evento online – 29 de agosto a 02 de setembro de 2022
www.even3.com.br/cobicet2022
utilizado não apenas para a propagação in vitro de
espécies vegetais, mas também para a produção de
metabólitos secundários. Muitas vezes, é necessário
um suprimento exógeno com reguladores de
crescimento vegetal, principalmente auxinas e
citocininas, para que ocorra estímulo da proliferação
celular, de forma geral (Oliveira et al., 2020).
Assim, o objetivo deste trabalho foi realizar a
micropropagação a partir da indução da calogênese
em diferentes explantes de plântulas previamente
germinadas in vitro de barbatimão (Stryphnodendron
adstringens) submetidos a meios de cultura com
concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP) e ácido
naftalenoacético (ANA).
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta e condução do experimento
Foram utilizadas sementes de barbatimão
(Stryphnodendron adstringens), aproximadamente
1,0 cm de largura, extraídas de áreas nativas do
sudoeste maranhense, doadas pelo viveiro do
consórcio operador da UHE Estreito/MA (latitude
5°20’31.5”S, longitude 47°24’24.88”O e altitude
187,22m).
Desinfestação e estabelecimento in vitro das
sementes de barbatimão
Em condições de laboratório, com auxílio de bisturi,
realizou-se uma pequena excisão nas sementes para
auxiliar e facilitar o processo germinativo de S.
adstringens, em seguida, utilizando uma câmara de
fluxo laminar, houve a imersão das sementes de
barbatimão em solução de álcool etílico 70% em
agitação por 2 minutos, e após este período, as
sementes foram mergulhadas em solução de
hipoclorito de sódio (a 2% de cloro ativo) com 2
gotas de Tween® a cada 100 mL de solução, por 15
minutos. Após este processo, foi realizada lavagem
das sementes em água destilada autoclavada por dois
minutos cada, repetindo este processo por três vezes.
Após a desinfestação (Figura 1A), as sementes,
previamente excisadas (Figura 1B), foram inoculadas
em tubos de ensaio de vidro (25x150mm) contendo
10 mL de meio de cultura MS ½ (Murashige e
Skoog, 1962), contendo macro, micronutrientes e
vitaminas pela metade, suplementado com 15 g L-1
de sacarose, 50 mg L-1 de mio-inositol, 3,25 g L-1 de
ágar (Agargel®) e pH ajustado para 5,8 antes da
autoclavagem a 121 ºC durante 15 minutos, sendo
mantidas em condições controladas de sala de
crescimento por 40 dias, dos quais sete dias iniciais
foram no escuro, com seguida manutenção em
condições de luz com fotoperíodo de 16 horas, a
25±2ºC, e intensidade luminosa de 85 μmol m-2 s-1
proveniente de duas lâmpadas tubulares LEDs
(diodos emissores de luz) de cor branco (T8, 10w,
Brilia, Brasil).
Aos 40 dias, foi possível observar germinação de
86,25% das sementes (Figura 1C), dentre as quais,
65% apresentaram folhas cotiledonares e 33,75%
folhas verdadeiras (Figura 1D). A partir das plantas
previamente germinadas in vitro, foram utilizados
diferentes tipos de explantes para a realização da
experimentação, relatada a seguir.
Figura 1. Desinfestação de sementes de barbatimão
(Stryphnodendron adstringens) (A, B), inoculadas
em tubos de ensaio e permanecendo em condições de
sala de crescimento por 40 dias de cultivo in vitro
(C, D).
Inoculação de diferentes explantes de plântulas de
barbatimão previamente estabelecidos in vitro
Após 40 dias de germinação in vitro, as plântulas
foram utilizados como fontes de explantes, sendo:
folhas cotiledonares, folhas verdadeiras, base
caulinar, ápice caulinar e cicatriz do cotilédone, com
cerca de 1 cm de comprimento, cada (Figura 2A-B).
Para isso, estes explantes foram inoculados, com a
parte abaxial voltada para o meio de cultura, em
placas de Petri (90 mm) contendo 20 mL de meio de
cultura MS, suplementado com 30 g L-1 de sacarose,
100 mg L-1 de mio-inositol, 2 g L-1 de Phytagel®,
1 g L-1 de arginina, 500 mg L-1 de asparagina, 1 g L-1
de glutamina, e concentrações de 10, 20 ou 30 μM de
BAP e 10, 20 ou 30 μM de ANA, dependendo do
tratamento (Tabela 1), e o pH foi ajustado para 5,8
antes da autoclavagem. por 15 minutos. As placas de
Petri permaneceram em sala de crescimento por 25
dias no escuro e temperatura de 25 ± 2°C.

Anais do III CoBICET – Trabalho completo
Congresso Brasileiro Interdisciplinar em Ciência e Tecnologiaa
“15 anos dos BIs e LIs: retrospectiva, resistência e futuro”
Evento online – 29 de agosto a 02 de setembro de 2022
www.even3.com.br/cobicet2022
Figura 2. Explantes de Stryphnodendron adstringens
(A), mantidos por 25 dias em condições de cultivo in
vitro em meios de cultura contendo diferentes
concentrações dos fitohormônios BAP e ANA (B).
Tabela 1. Meios de cultura para indução a calogênese
in vitro a partir de diferentes explantes de plântulas
de barbatimão, Stryphnodendron adstringens, (folhas
cotiledonares, folhas verdadeiras, base caulinar, ápice
caulinar e cicatriz do cotilédone).
Tratamentos
BAP (μM)
ANA(μM)
T1
10
10
T2
10
20
T3
10
30
T4
30
10
T5
30
20
T6
30
30
Delineamento experimental, variáveis analisadas e
análise estatística
O experimento foi conduzido em delineamento
inteiramente casualizado (DIC) em esquema fatorial
6x5, sendo seis tratamentos (Tabela 1) e cinco
diferentes tipos de explantes (folhas cotiledonares,
folhas verdadeiras, base caulinar, ápice caulinar e
cicatriz do cotilédone) de S. adstringens, com dez
repetições cada, sendo a unidade experimental
composta por cinco diferentes tipos de explante, ou
seja, um de cada tipo de explante por placa de Petri.
Aos 25 dias após inoculação, foram realizadas
avaliações quanto a formação de calos (onde foi
adotado um sistema de notas em que: 0, nenhuma
formação de calos; 1, pouca formação de calos; 2,
média formação de calos; e 3, muita formação de
calos) e porcentagem de oxidação. Os dados foram
submetidos a análise de variância, e quando
significativos, foram comparados pelo teste de Tukey
a 5% de significância, a partir do programa estatístico
SISVAR (Ferreira, 2011).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A partir da análise de variância, nós observamos que,
houve diferença significativa apenas para o fator
tipos de explantes para ambas as variáveis, formação
de calos e porcentagem de oxidação (p<0,05).
Para porcentagem de oxidação, foi possível observar
que folhas cotiledonares e cicatriz do cotilédone
foram superiores aos demais explantes analisados,
alcançando elevadas oxidações com 83,25% e 83%,
respectivamente, sendo o explante de ápice caulinar
aquele no qual houve menor oxidação, com 44,71%
(Figura 3A). Werner et al. (2009) também relata
dificuldades com a oxidação fenólica para a
micropropagação de pau-brasil (Caesalpinia
echinata) in vitro.
Figura 3. Formação de calos (A) e porcentagem de
oxidação (B) em explantes de folha cotiledonar (Fc),
folha verdadeira (Fv), base caulinar (Bc), ápice
caulinar (Ac) e cicatriz do cotilédone (Cc) de
Stryphnodendron adstringens em meio de cultura
com diferentes concentrações de BAP e ANA, aos 25
dias de cultivo in vitro. Letras iguais não diferem
entre si pelo teste de Tukey, a 5% de significância.
No entanto, para formação de calos, observou-se que
o explante de folha verdadeira (1,57) foi superior aos
demais tipos de explantes, não diferindo apenas de
folha cotiledonar (1,38), sendo base caulinar o menos
responsivo (0,98) (Figura 3B). O balanço hormonal
obtido entre os níveis de citocininas e auxinas,
exógenas e endógenas à planta, estimulou a
proliferação celular em explantes foliares de murici-
pequeno (Byrsonima intermedia), iniciando a
formação de calos (Nogueira et al., 2007). Nós
observamos o mesmo no presente trabalho, no qual
houve maior formação de calos nos tratamentos com
balanço entre citocinina e auxina, ou seja, T1 - MS +
10μM de BAP + 10μM de ANA (Figura 3A-E) e T6 -
MS + 30μM de BAP + 30μM de ANA (Figura 3F-J);
e menor formação de calos em T3 - MS + 10μM de
BAP + 30μM de ANA (Figura 3K-O) aos 25 dias de
cultivo in vitro.
Werner et al., (2009) também observaram indução de
calos em Caesalpinia echinata aos 7 e 21 dias após
inoculação em meio com adição de auxina e
citocininas (MS + 45 μM de 2,4-D e 8,88 μM de
BAP), deixando claro que a calogênese desta espécie
foi dependente da concentração da auxina. O calo é o
resultado da reprogramação celular/tecidual devido

Anais do III CoBICET – Trabalho completo
Congresso Brasileiro Interdisciplinar em Ciência e Tecnologiaa
“15 anos dos BIs e LIs: retrospectiva, resistência e futuro”
Evento online – 29 de agosto a 02 de setembro de 2022
www.even3.com.br/cobicet2022
às condições que se sobrepõem às restrições de
diferenciação celular/tecidual (com gradientes
hormonais, regulação da cromatina, bloquei da
divisão celular, dentre outros) (Feher, 2019).
Figura 3. Formação de calos aos 25 dias de cultivo in
vitro em explantes de Stryphnodendron adstringens
mantidos nos tratamentos com diferentes
concentrações de BAP e ANA. (A-E) T1 (MS +
10μM de BAP + 10μM de ANA); (F-J) T6 (MS +
30μM de BAP + 30μM de ANA); e (K-O) T3 (MS +
10μM de BAP + 30μM de ANA) contendo explantes
de folhas cotiledonares (Fc), folhas verdadeiras (Fv),
base caulinar (Bc), ápice caulinar (Ac) e cicatrização
do cotilédone (Cc). Abreviaturas: Br – brotações em
calos.
CONCLUSÃO
Para a calogênese in vitro de barbatimão
(Stryphnodendron adstringens) sugere-se adoção de
explantes de folhas cotiledonares e verdadeiras
mantidas em meio de cultura com equimolaridade de
auxina/citocininas, como nos tratamentos T1 - MS +
10μM de BAP + 10μM de ANA e T6 - MS + 30μM
de BAP + 30μM de ANA devido a elevada formação
de calos, sendo mantidos em subcultivos sucessivos
de 25 dias cada, para evitar a oxidação do material
vegetal e aumentar a formação de calos desta espécie.
Assim, a partir deste protocolo desenvolvido, será
possível a produção em larga escala de biomassa
vegetal no afã de produzir, de forma homogênea,
extratos de interesse farmacológicos.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Universidade Estadual do
Maranhão e ao Programa Institucional de Bolsas de
Iniciação Científica (PIBIC / UEMA) pelo apoio
financeiro às atividades científicas do primeiro autor.
REFERÊNCIAS
DE CARVALHO, J.T.G.; AGUDELO, J.S.H.;
BALDIVIA, D.D.S.; CAROLLO, C.A.; SILVA,
D.B.; DE PICOLI SOUZA, K.; DOS SANTOS, E.L.
Hydroethanolic stem bark extracts of
Stryphnodendron adstringens impair M1
macrophages and promote M2 polarization. Journal
of Ethnopharmacology, v.254, p.112684, 2020. doi:
https://doi.org/10.1016/j.jep.2020.112684
DE CARVALHO, J. T. G.; BALDIVIA, D.S.;
LEITE, D. F.; ARAÚJO, L.C.A.; ESPINDOLA, P. P.
T.; ANTUNES, K.A.; ROCHA, P.S.; SOUZA, K.P.;
DOS SANTOS, E.L. Medicinal plants from Brazilian
Cerrado: antioxidant and anticancer potential and
protection against chemotherapy toxicity. Oxidative
Medicine and Cellular Longevity, v.1, p.3685264,
2019. doi: https://doi.org/10.1155/2019/3685264
ESPOSITO-POLESI, N.P. Contaminação versus
manifestação endofítica: implicações no cultivo in
vitro de plantas. Rodriguésia, v.71, p.1-15, 2020. doi:
https://doi.org/10.1590/2175-7860202071072
FEHER, A. Callus, dedifferentiation, totipotency,
somatic embryogenesis: what these terms mean in the
era of molecular plant biology? Frontiers in Plant
Science, v.10, p.536, 2019. doi:
https://doi.org/10.3389/fpls.2019.00536
FERREIRA, D.F. Sisvar: a computer statistical
analysis system. Ciência e Agrotecnologia (UFLA),
v.35, n.6, p.1039-1042, 2011. doi:
https://doi.org/10.1590/S1413-70542011000600001
INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E
ESTATÍSTICA (IBGE). Produção da Extração
Vegetal e da Silvicultura, 2018. Disponível em:
https://sidra.ibge.gov.br/tabela/289. Acesso em: 08
fev. 2022.
MARTINS, C.C.; CAMARA, A.T.R.; MACHADO,
C.G.; NAKAGAWA, J. Métodos de superação de
dormência de sementes de barbatimão, Acta
Scientiarum. Agronomy, v.30, p. 381-385, 2008. doi:
https://doi.org/10.4025/actasciagron.v30i3.3548
MEIRA, M.R.; CABACINHA, C.D.; FIGUEIREDO,
L.S.; MARTINS, E.R. Barbatimão: ecologia,
produção de tanino e potencial sócio econômico na
região norte mineira. Enciclopédia Biosfera, v.9,
p.466-494, 2013.
MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE (MMA). O
Bioma Cerrado, 2019. Disponível em:
https://www.mma.gov.br/biomas/cerrado. Acesso
em: 08 fev. 2022.
MURASHIGE, T, SKOOG, F. A revised medium for
rapid growth and bio assays with tobacco tissue
cultures. Physiologia Plantarum. V.15, p.473-497.
doi:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x
NETO, J.A.R.; TARÔCO, B.R.P.; DOS SANTOS,
H.B.; THOMÉ, R.G.; WOLFRAM, E.; RIBEIRO,
R.I.M.A. (2020). Using the plants of Brazilian
Cerrado for wound healing: From traditional use to
scientific approach. Journal of Ethnopharmacology,
v.260, p.112547, 2020. doi: https://doi.org/10.1016/j.
jep.2020.112547

Anais do III CoBICET – Trabalho completo
Congresso Brasileiro Interdisciplinar em Ciência e Tecnologiaa
“15 anos dos BIs e LIs: retrospectiva, resistência e futuro”
Evento online – 29 de agosto a 02 de setembro de 2022
www.even3.com.br/cobicet2022
NOGUEIRA, R.C.; PAIVA, R.; DE OLIVEIRA,
L.M.; SOARES, G.A.; SOARES, F.P.; CASTRO,
A.H.F.; PAIVA, P.D.O. Indução de calos em
explantes foliares de murici-pequeno (Byrsonima
intermedia A. Juss.). Ciência e Agrotecnologia, v.31,
p.366-370, 2007.
OLIVEIRA, A.C.A. de; SANTANA, R.V.;
MACHADO, C. de A.; OLIVEIRA, L.A.R. de;
PADILHA, F.F.; SILVA, A.V.C. da; SILVA
JUNIOR, J.F. da; LEDO, A. da S. Calogênese in
vitro a partir de explantes de jenipapeiro. Embrapa
Tabuleiros Costeiros. Boletim de Pesquisa e
Desenvolvimento, 149. 2020. Disponível em:
https://www.embrapa.br/busca-de-publicacoes/-
/publicacao/1127098/calogenese-in-vitro-a-partir-de-
explantes-de-jenipapeiro. Acesso em: 23 fev. 2022.
SOUZA-MOREIRA, T.M.; QUEIROZ-
FERNANDES, G.M.; PIETRO, R.C.L.R.
Stryphnodendron Species Known as "Barbatimão": A
Comprehensive Report. Molecules, v.23, p.910,
2018. doi: https://doi.org/10.3390/molecules2304091
0
WERNER, E.T.; CUZZUOL, G.R.F.; PESSOTTI,
K.V.; LOPES, F.P.; ROGER, J.A. Controle da
calogênese do pau-brasil in vitro. Revista Árvore,
v.33, p.987-996, 2009. doi:
https://doi.org/10.1590/S0100-67622009000600001