Fibrinolyse, nouveaux concepts : vésicules et cross-talk fibrinolytiques

Full text

Revue
H´
ematologie 2011 ; 17 (6) : 423-34
Fibrinolyse, nouveaux concepts :
vésicules et cross-talk fibrinolytiques
Fibrinolysis, new concepts: fibrinolytic microvesicles and cross-talk
Laurent Plawinski
Tiphaine Dejouvencel
Eduardo Anglés-Cano
UMR6232-CNRS, CiNaps, Centre
d’imagerie et neurosciences appliquées
à la pathologie, Inserm U919 Serine
proteases in neurovascular
physiopathology, GIP Cyceron, bd Henri
Becquerel, 14074-cdx, Caen, rance
<Eduardo.Angles-Cano@inserm.fr>
Résumé. La phase lytique d’un caillot hémostatique résulte d’un nombre restreint
de réactions enzymatiques localisées à la surface de la fibrine ou des membranes
cellulaires. Un défaut fonctionnel, ou une insuffisance de cette activité fibrinolytique
peut conduire à la consolidation d’un thrombus dont les conséquences ischémiques
au niveau coronaire ou cérébral sont sévères, voire fatales. Nonobstant ce constat,
l’évaluation du fonctionnement de ce système demeure un véritable défi en hémo-
stase, et ce malgré une progression réelle dans la connaissance individuelle des
molécules agissant autour du système plasminogène/plasmine : activateurs, inhi-
biteurs, récepteurs et leurs régulateurs. La nécessité d’un assemblage moléculaire
restreint la formation de plasmine à une surface (fibrine, membrane) et limite son
activité à la lyse du caillot. L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) et la
plasmine active libérés dans le sang suite à la lyse de la surface d’attache sont
immédiatement neutralisées par des inhibiteurs (plasminogen activator inhibitor 1
[PAI-1], ␣2-antiplasmine). Il est donc difficile, voire impossible, de détecter ce phé-
nomène fibrinolytique à l’aide des méthodes actuellement utilisées. Si le caillot de
fibrine n’est pas accessible pour déterminer le degré ou l’intensité de la réponse
fibrinolytique, il a été récemment démontré qu’il existe dans la circulation des vec-
teurs pouvant diffuser cette information. En effet, la récente découverte de l’activité
fibrinolytique des microvésicules membranaires suggère que ces dernières seraient
un indicateur de la réponse fibrinolytique face à un processus inflammatoire ou
prothrombotique. Ces microvésicules fibrinolytiques, issues de cellules parentales
productrices d’activateurs du plasminogène, porteraient à leur surface la molé-
cule synthétisée par la cellule maternelle (cellules endothéliales : tPA ; leucocytes :
urokinase [uPA]). Ces molécules, localisées à la membrane cellulaire sur des sites
spécifiques, conservent leur capacité d’activation du plasminogène et sont donc
capables de générer de la plasmine à la surface des microvésicules. Plus intéressant
encore, il a été également découvert que ces microvésicules fibrinolytiques inter-
viennent dans un nouveau mécanisme de formation de plasmine au cours duquel
la plasmine formée est le résultat de l’interaction entre deux surfaces distinctes : il
s’agit donc d’un cross-talk fibrinolytique. Une des surfaces réactionnelles porte le
plasminogène, c’est le cas de la fibrine, de la membrane plaquettaire ou encore de
la matrice extracellulaire. La deuxième surface porte l’activateur du plasminogène
intervenant dans ce cross-talk. Il s’agit de l’uPA retrouvée sur la membrane des leu-
cocytes ou des microvésicules. Ces nouveaux acteurs et concepts d’activation du
plasminogène ouvrent de nouvelles voies dans la compréhension de la fibrinolyse
et de leur étude en pratique clinique.
Mots clés : fibrinolyse, microvésicule, plasminogène, activateurs du plasmino-
gène, cross-talk fibrinolytique
doi:10.1684/hma.2011.0656
Tir´
es `
a part :
E. Anglés-Cano 423
H´
ematologie, vol. 17, n o6, novembre-décembre 2011
Pour citer cet article : Plawinski L, Dejouvencel T, Anglés-Cano E. Fibrinolyse, nouveaux concepts : vésicules et cross-talk fibrinolytiques. H´
ematologie 2011 ;
17 (6) : 423-34 doi:10.1684/hma.2011.0656

Abstract. Thrombus lysis is the consequence of a restricted number of reactions
localised to the surface of fibrin. A functional defect or an insufficient fibrinolytic
response may lead to thrombosis with severe or fatal clinical consequences, e.g.
myocardial infarction and ischemic stroke. Despite this clinical exigency and a real
progress in the knowledge of the different components of this system (plasminogen
and its activators, inhibitors and receptors), its functional evaluation still remains
a challenge in haemostasis. The absolute requirement of a template for molecular
assembly of plasminogen and its activators (tissue- and urokinase-type plasmino-
gen activators: tPA and uPA) restricts the formation of plasmin and protection of its
activity to the surface of, respectively, fibrin and cells. In contrast, plasmin and tPA
released from the clot during its lysis are immediately neutralised by their respective
inhibitors 2-antiplasmin and plasminogen activator inhibitor 1, PAI-1). It seems there-
fore almost impossible to detect fibrinolytic activity in plasma with methods currently
in use. Because of its unavailability, it is also impossible to measure the degree of
fibrinolysis directly on the clot. Notwithstanding, it was recently discovered that cir-
culating membrane microvesicles might be indicators of the fibrinolytic response to
an inflammatory or prothrombotic process. These cell-derived fibrinolytic microve-
sicles bear at their membrane the plasminogen activators expressed by the parent
cell: tPA from endothelial cells and uPA from leukocytes. These molecules are loca-
lised at the membrane surface and have the capacity to activate plasminogen into
plasmin in situ. Moreover, it was recently discovered that this microvesicles might
participate in a new mechanism of plasmin formation requiring a cross-talk between
two different surfaces. In this fibrinolytic cross-talk one of the surfaces bear plas-
minogen (fibrin, extracellular matrix or platelets) whereas the other surface carry
the plasminogen activator, typically leukocyte-derived microvesicles bearing uPA.
These new actors and concepts in plasminogen activation represent hitherto unk-
nown pathways in our comprehension of fibrinolysis and potential novel biomarkers
in clinical practice.
Key words: fibrinolysis, microvesicle, plasminogen, plasminogen activators, fibri-
nolytic cross-talk
Introduction
L’activité fibrinolytique du compartiment intravasculaire est
un mécanisme majeur de défense contre la thrombose.
Elle permet la lyse spécifique de l’excédent de fibrine for-
mée après une lésion vasculaire afin de restaurer l’intégrité
vasculaire et le flux sanguin. Son efficacité repose sur le
fonctionnement du réseau de fibrine, à la fois comme :
- support du caillot hémostatique,
- surface d’assemblage d’un complexe ternaire formé avec
le plasminogène et son activateur tissulaire (tPA),
- surface d’activation du plasminogène,
- substrat de la plasmine engendrée par ce complexe [1].
Le tPA est synthétisé par l’endothélium [2]. Libéré au contact
du caillot, en réponse à la stimulation par la thrombine, il se
lie à la fibrine mais peut également engendrer de la plasmine
sur la surface endothéliale [3]. D’autres composants cellu-
laires intervenant dans la formation du thrombus participent
également à sa dissolution. Ainsi, les leucocytes qui forment
des agrégats avec les plaquettes libèrent un deuxième type
d’activateur du plasminogène : l’urokinase (uPA), qui peut,
sous certaines conditions, activer le plasminogène lié à la
fibrine [4]. Cependant, l’activation du plasminogène par
l’uPA se fait principalement au niveau de la membrane
cellulaire [5]. Si la membrane des cellules endothéliales
et des leucocytes est une surface d’assemblage pour la
production de plasmine, les plaquettes jouent un rôle profi-
brinolytique en apportant du plasminogène membranaire au
sein du thrombus [6]. Les plaquettes peuvent aussi dévelop-
per une activité régulatrice en libérant du PAI-1, l’inhibiteur
majeur des activateurs du plasminogène [7].
Récemment, nous avons montré qu’au-delà de cette parti-
cipation cellulaire, un mécanisme similaire d’activation du
plasminogène était présent à la membrane de microvési-
cules issues de la lignée HMEC-1 (pour human microvascular
endothelial cells) [8]. Au demeurant, des études plus récentes
nous ont permis de montrer l’existence d’un nouveau méca-
nisme de formation de plasmine, le cross-talk fibrinolytique,
requérant une première surface portant le plasminogène et
une deuxième surface portant l’activateur uPA [9]. La for-
mation de plasmine sur la fibrine ou sur les membranes
cellulaires est donc fondée sur la relation étroite exis-
tant entre la conformation moléculaire du plasminogène
adsorbé sur une surface et sa reconnaissance par les acti-
vateurs immobilisés sur la même surface, ou sur une surface
mobile.
Ces deux nouveaux mécanismes, l’activité fibrinolytique de
microvésicules membranaires et le cross-talk fibrinolytique,
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constituent une nouvelle voie d’approche de la fibrinolyse.
Ils seront analysés dans cette revue après avoir défini le
rôle majeur que jouent les changements de conformation
du plasminogène dans le mécanisme de production de
plasmine.
Structure du plasminogène
et changements de conformation
Les changements de conformation du plasminogène consti-
tuent un mécanisme clé de la fibrinolyse [10]. Cette
glycoprotéine de 92 kDa est composée de 791 acides ami-
nés (Glu1-Asn791, Glu-plasminogène) qui sont regroupés en
cinq modules, appelés kringles, et une région catalytique ;
ces éléments modulaires sont précédés d’un peptide amino-
terminal (Glu1-Lys77)(figure 1A,tableau 1). Les kringles 1
et 4 contiennent des sites de liaison aux résidus lysine (LBS
pour lysine-binding site) de la fibrine qui permettent une inter-
action et une liaison efficaces du plasminogène. Le kringle 5
contient un LBS modifié dont l’affinité pour les résidus lysine
du peptide aminoterminal favorise l’adoption d’une confor-
mation fermée en spirale (figure 1B) [11]. Cette forme fermée
du plasminogène prédomine dans la circulation. La libé-
ration du peptide aminoterminal après son clivage par la
plasmine caractérise une forme tronquée (Lys-plasminogène)
ayant une conformation ouverte dépliée. L’apparition d’une
forme ouverte semblable à celle-ci se produit quand le LBS
est occupé par les analogues de la lysine, comme l’acide
epsilon aminocaproïque (EACA) ou l’acide tranexamique
(TXA) [12]. En effet, l’invalidation de la fonction LBS par
ces molécules empêche l’interaction entre le kringle 5et
le peptide aminoterminal. Cette invalidation prévient égale-
ment la liaison du plasminogène à la fibrine, et de ce fait
son activation par le tPA. De fac¸on surprenante, il a été
constaté que cette forme ouverte (figure 1B) induite par des
faibles doses d’EACA est reconnue et transformée en plas-
mine par l’uPA. Ces transitions du plasminogène, entre forme
ouverte (obtenue par clivage protéolytique ou par induction
pharmacologique) et configuration fermée, ont été mises en
évidence par microscopie électronique [13], par la mesure
de la fluorescence intrinsèque [14] et par la réactivité dif-
férentielle d’anticorps monoclonaux spécifique de l’une ou
de l’autre forme [15]. Par homologie, il est couramment
accepté que l’interaction directe du plasminogène natif (Glu-
plasminogène) avec les résidus lysine de la fibrine ou des
glycoprotéines membranaires conduit à une transition de la
forme fermée vers la forme ouverte. Cette forme est effica-
cement activable par le tPA lié à la fibrine ou par l’uPA lié
à son récepteur. En résumé, la liaison du plasminogène à la
fibrine ou aux membranes cellulaires et sa transition en forme
ouverte sont des conditions nécessaires à sa transformation
en plasmine par des activateurs du plasminogène localisés à
proximité
Structure des activateurs
du plasminogène
Le tPA et l’uPA possèdent, comme le plasminogène, une struc-
ture en mosaïque constituée par plusieurs domaines [16].
Les caractéristiques de ces molécules sont signalées dans le
tableau 1. La principale fonction de la région catalytique des
activateurs du plasminogène est la transformation du plas-
minogène en plasmine par clivage de la liaison peptidique
Arg561-Val562. Le tPA est sécrété par les cellules endothéliales
sous forme monocaténaire, laquelle a un très faible index
de zymogénicité [2]. Ceci indique, fait exceptionnel, que la
molécule monocaténaire est aussi active que la forme bica-
ténaire produite après clivage de la liaison Arg275-Ile276 par
la plasmine. Cependant, l’adsorption de ces deux formes à
la surface de la fibrine via une interaction entre leur module
finger et le domaine D de la fibrine est une condition sine qua
non pour leur activité [1, 17]. Dans certains tissus comme le
cerveau, le kringle 2 du tPA interagit avec la sous-unité R1
du récepteur au NMDA. Cette interaction serait à l’origine
de la neurocytotoxicité du tPA décrite dans un modèle murin
[18]. On ne connaît pas de récepteur spécifique au tPA.
L’uPA libérée par les leucocytes est une sérine protéase clas-
sique, sécrétée sous forme de zymogène monocaténaire
(sc-uPA), qui doit être activée afin de manifester son acti-
vité protéase intégrale sous forme double chaîne (tc-uPA)
[5]. Ce clivage, au niveau de la liaison peptidique Lys158-
Ile, est principalement réalisé par la plasmine. La thrombine,
en revanche, inactive le sc-uPA en le clivant en deux rési-
dus, en amont du site de clivage par la plasmine [19]. En
position NH2-terminale de l’uPA, se trouve le module EGF,
lequel contient une séquence d’interaction permettant sa liai-
son au récepteur uPAR, lui-même ancré à la membrane via
le groupement glycosylphosphatidylinositol, qui possède une
large mobilité transmembranaire. Au-delà de cette fonction,
l’uPAR active, avec ses corécepteurs transmembranaires, plu-
sieurs voies de signalisation intracellulaire intervenant dans
la migration et la survie cellulaire [20].
La plasmine est formée au niveau
d’une surface
Dès la formation d’un caillot de fibrine, le plasminogène
et le tPA se lient à sa surface et acquièrent la conforma-
tion moléculaire nécessaire à la composition d’un complexe
enzyme/substrat aboutissant à la production de plasmine
in situ [17]. La plasmine formée reste liée à la fibrine par
l’intermédiaire de son site LBS, ce qui l’engage dans une
fonction exclusivement fibrinolytique tout en la protégeant
de l’␣2-antiplasmine. En effet, la formation d’un complexe
entre la région catalytique de la plasmine et le site réac-
tif de l’␣2-antiplasmine requiert une interaction avec le site
LBS du kringle 1 de la plasmine. Tant que la plasmine reste
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K1
NH2
Protéase
K5
K4
K3
K2
120
180
140
160
80 Pn/K77
Pn/R68
Pn/K62
40
60
620
640
580
780
720
700
740
440
360
340
300
320
260
200
220
240
280
∗∗
380
400
420
760
680
460
540
560
500
520
480
660
600
20
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A
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Y
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B
Forme fermée
K4
K4
K5
K5
K2
NH
2
Site de clivage
Protéase
K2
K1
K1
K3
K3
Forme ouverte
Figure 1. Structure et conformation du plasminogène.
A) Séquence d’acides aminés et structure secondaire du plasminogène. Les 791 acides aminés du Glu-plasminogène (Glu1-Asn791)
sont arrangés en une séquence aminoterminale (NH2) suivit par cinq domaines kringle (K) et une région sérine-protéinase conte-
nant les acides aminés du site actif (cercles noirs). Le site de clivage par les activateurs (Arg561-Val562) est indiqué par le
triangle ouvert. Les sites de clivage du peptide aminoterminal (NH2) par la plasmine sont indiqués (forme tronquée Lys77-Asp791 ).
(http://www.chem.cmu.edu.groups/Llinas/images/res/res-kringle-PLASMIN.gif)
B) Forme fermée (spirale) et forme ouverte du plasminogène. La forme fermée (interaction entre le peptide aminoterminal et le K5 du
plasminogène) est la conformation majoritaire circulante. La forme ouverte est adoptée par le plasminogène après liaison aux résidus Lys-
C-ter de la fibrine ou des glycoprotéines membranaires. Figure original (Lähteenmäki K, Edelman S, Korhonen T.K. Trends in Microbiology
2005, 13,79, reproduite avec la permission de Elsevier Limited).
adsorbée à la fibrine, elle ne peut pas être inhibée [21].
Ainsi, à cette réaction de surface, génératrice de plasmine
active, on peut opposer la réaction d’inhibition par l’␣2-
antiplasmine qui se déroule en phase soluble circulante. La
lyse d’un caillot est donc le résultat d’une réaction de surface
de haute spécificité, depuis la formation initiale de la plas-
mine jusqu’à la phase d’accélération et d’amplification de la
fibrinolyse.
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Tableau 1
Principaux composants du système d’activation du plasminogène.
Plasminogène Plasmine suPAR uPA tPA
Concentration plasmatique 0.12-0,18 mg/mL 0 <1 ng/mL 3,6 ±0,9 ng/mL 7,5 ±2,5 ng/mL
Molarité plasmatique 1,5à2␮m0 <1,5 pM 50 à 85 pM 70 à 140 pM
Poids moléculaire 92 kDa 84 kDa 65 kDa 54 kDa 70 kDa
Site de clivage Arg561-Val562 --Lys
158-Ile154 Arg275 -Ile274
Domaines P-K1-5-SP K1-5-SP D1-3 EGF-K1-SP F-EGF-K1-2-SP
Séquence polypeptidique
1 chaîne 2 chaînes 1 chaîne 1 chaîne →2 chaînes 1 chaîne →2 chaînes
Activité enzymatique - ++++ - +/- →++++ ++++ →++++
suPAR : uPAR soluble;P:peptide N-terminal;K:domaine kringle ; SP : domaine sérine protéase ; D : LU (Ly-6 uPAR) domaine ; EGF : domaine EGF ; F :
domaine finger
Surfaces d’assemblage et jeux
d’interactions
Le plasminogène est fixé aux résidus lysine de la fibrine par
l’intermédiaire des LBS des kringles 1 et 4. Le tPA, bien que
possédant un module kringle 2 avec un LBS actif, est adsorbé
à la fibrine par l’intermédiaire de son domaine finger, dont
l’affinité pour la région D est 1 000 fois supérieure à celle
du kringle 2 pour le résidu lysine. C’est précisément ce phé-
nomène d’interaction avec la fibrine qui permet l’expression
de l’activité du tPA. En absence de fibrine, le tPA ne pos-
sède qu’une très faible capacité à activer le plasminogène.
Les changements de conformation du plasminogène et du
tPA après adsorption sur leurs sites, et leur proximité sur la
surface de fibrine, permettent la composition d’un complexe
enzyme/substrat aboutissant à la production de plasmine
et in fine à la lyse du polymère de fibrine. Dans la paroi
vasculaire, la production de plasmine à la surface de macro-
molécules de la matrice extracellulaire suit le même principe :
le plasminogène est immobilisé, via ses domaines kringle, sur
la fibronectine ou la laminine où il est activé par l’uPA libéré
par les cellules inflammatoires [5].
Sur les membranes cellulaires, l’assemblage moléculaire se
fait sur des sites récepteurs pour le plasminogène (␣-énolase
[22], complexe tétramérique annexine A2-S100A10 [23],
histone H2B [24] ou le Plg-RKT [25]), qui est activé par l’uPA
immobilisé sur son récepteur uPAR. Sur certaines cellules,
comme la cellule endothéliale, la cellule musculaire lisse ou
encore les neurones, c’est le tPA fixé à certaines protéines
transmembranaires qui transforme le plasminogène en plas-
mine [26, 27].
Accélération et amplification
de la fibrinolyse
La plasmine formée in situ peut amplifier l’activation du plas-
minogène en générant des nouveaux sites de liaison pour
le plasminogène [28]. En effet, les premières molécules de
plasmine produites à la surface de la fibrine hydrolysent des
ponts lysyl et font apparaître des résidus lysine en position
carboxyterminale (Lys-C), qui représentent des nouveaux sites
de liaison [29]. Le plasminogène lié aux sites Lys-C adopte
une conformation ouverte permettant sa reconnaissance et
son activation par le tPA adsorbé à proximité, ou par l’uPA
libéré par les leucocytes. L’uPA ne se lie pas à la fibrine, mais
reconnaît spécifiquement le plasminogène lié à ces sites [4].
La liaison accrue de plasminogène multiplie le nombre de
molécules de plasmine formées par les activateurs et ampli-
fie le processus de dégradation de la fibrine et la lyse du
caillot. C’est la multiplication du nombre de sites de liai-
son du plasminogène et les changements de conformation
de celui-ci qui constituent les facteurs majeurs d’amplification
de la fibrinolyse. La transformation de l’uPA monocaténaire
en uPA bicaténaire active constitue un deuxième facteur
d’accélération dans la formation de plasmine [30].
Régulation
Le système d’activation du plasminogène est finement régulé
(1) par des inhibiteurs de sérine protéases (serpines), et
(2) par compétition ou (3) élimination des sites Lys-C de
liaison du plasminogène. La régulation par les serpines
intervient directement au niveau de la plasmine (principa-
lement l’␣2-antiplasmine) ou des activateurs (principalement
le PAI-1). En cas d’excès de tPA ou de plasmine, des inhi-
biteurs plasmatiques ayant une spécificité moins restreinte
peuvent également agir (l’␣2-macroglobuline ou l’inhibiteur
de la C1 estérase) [31]. Dans le système nerveux central,
des inhibiteurs spécifiques des activateurs du plasminogène
comme la neuroserpine et la protéase nexine 1 (PN-1) ont
été identifiés [32]. La PN-1 inhibe également la plasmine et
la thrombine ; des données récentes suggèrent que la PN-1
stockée dans les plaquettes pourrait jouer un rôle important
dans le système vasculaire [33]. PAI-2 est particulièrement
H´
ematologie, vol. 17, n o6, novembre-décembre 2011
427

produit par les syncytiotrophoblastes et les monocytes. Son
rôle physiologique comme inhibiteur de l’uPA et du tPA reste
encore une énigme ; il semblerait surtout avoir de fonctions
intracellulaires [34]. Il est à noter que dans tous les cas
l’inhibition des activateurs ou de la plasmine se fait dans
la phase circulante, et que de manière générale la plupart
des acteurs du système d’activation du plasminogène liés
à leur récepteur se trouvent partiellement protégés de leurs
inhibiteurs.
La lipoprotéine(a), notée Lp(a), peut exercer un effet antifibri-
nolytique, et de nombreux travaux attestent de la pertinence
clinique de ce mécanisme en pathologie cardio-vasculaire
[35]. Le mécanisme antifibrinolytique de cette lipoprotéine
peut s’expliquer par sa structure particulière : un composant
semblable aux lipoprotéines de faible densité (LDL) et une gly-
coprotéine, l’apolipoprotéine(a), ou Apo(a), structuralement
proche du plasminogène mais sans activité enzymatique
[36]. L’Apo(a) possède une copie non activable de la région
catalytique, une copie du kringle 5 et un nombre variable de
copies du kringle 4 ayant une forte affinité pour la fibrine.
Ainsi, une compétition entre le plasminogène et l’Apo(a)
pour la liaison à la fibrine limite la quantité de plasmino-
gène lié, diminue la formation de plasmine et inhibe la
fibrinolyse [37].
Enfin, le zymogène TAFI (pour thrombin-activated fibrinoly-
sis inhibitor ; procarboxypeptidase U) peut être activé par
la thrombine ou par la plasmine en TAFIa. Cette exopep-
tidase clive les résidus Lys-C de protéines, limitant ainsi la
liaison du plasminogène aux surfaces d’activation [38]. Son
activité in vitro est bien établie [39] mais TAFIa ne semble
pas jouer un rôle physiologique dans la fibrinolyse in vivo
(modèle murin) [40]. Les nombreuses études, témoins du vif
intérêt clinique pour ce régulateur de la fibrinolyse, n’ont pour
l’instant aboutit qu’à des résultats associationnels [41].
À l’opposé de ce mécanisme de régulation de récepteurs du
plasminogène par le TAFIa, se trouve l’utilisation d’inhibiteurs
de la liaison du plasminogène qui bloquent les sites LBS. Il
s’agit des analogues de la lysine comme l’EACA et le TXA
mentionnés plus haut. Ces composés interagissent avec le
LBS des kringles et bloquent ainsi de fac¸on compétitive la
liaison du plasminogène à la fibrine ou aux cellules. Leur
utilisation en clinique comme antifibrinolytiques et antihémor-
ragiques a été récemment évoquée dans plusieurs situations
clinicochirurgicales et dans une large étude multicentrique
[42, 43].
Fonctions du système d’activation
du plasminogène
On distingue les fonctions du système d’activation du plas-
minogène (fibrinolyse et protéolyse péricellulaire) selon la
nature de la surface sur laquelle cette réaction a lieu.
La fibrinolyse
Le clivage par la plasmine des ponts lysyl et arginyl de la
fibrine conduit à sa dissolution et à la libération de produits
de dégradation. Les fragments D-dimères retrouvés dans la
circulation témoignent à la fois de la formation d’un caillot et
de sa dissolution par la plasmine [1]. Une fibrinolyse efficace
permet la recanalisation du vaisseau obstrué. L’utilisation
d’agents thrombolytiques pour le traitement des accidents
ischémiques cérébraux ou coronaires est calquée sur ce
modèle physiologique.
La protéolyse péricellulaire
Elle a lieu lorsque la formation de plasmine se fait à la
surface des membranes cellulaires ou de la matrice extracel-
lulaire [26, 27, 44]. Au niveau cellulaire, la plasmine active
les récepteurs transmembranaires (PAR, protease-activated
receptor 1 et 4) et induit une signalisation intracellulaire [45]
et une réponse phénotypique caractérisée initialement par
une vésiculation membranaire [46]. Les microvésicules géné-
rées portent les activateurs du plasminogène de la cellule
parentale [46]. La plasmine formée in situ induit, directe-
ment ou via l’activation de prométalloprotéases (MMP-3, 9
et 12), la protéolyse des protéines matricielles : fibronec-
tine, laminine ou vitronectine [47]. Cette protéolyse entraîne
des modifications de l’adhérence cellulaire conduisant à dif-
férents phénomènes physiologiques (remodelage cellulaire,
angiogenèse, migration cellulaire) [39]. La plasmine for-
mée en excès ou par manque de régulateurs (inhibiteurs)
produit une dégradation in extenso de la matrice extracel-
lulaire. Ce processus peut entraîner la perte d’adhésion
cellulaire et la mort par apoptose, comme observé dans
certaines situations pathologiques (mort cellulaire, fragilisa-
tion/rupture de la plaque d’athérome, anévrisme) [48-50].
Ce processus d’apoptose induit par le détachement cellu-
laire peut être déjoué par des inhibiteurs comme le PAI-1
et la PN1 [49, 51, 52]. Il est important de différen-
cier ces étapes d’activation cellulaire et d’apoptose afin
d’évaluer les effets des médiateurs, inhibiteurs et agents
thérapeutiques.
Fibrinolyse, cas particuliers :
les plaquettes, les microvésicules
La voie classique d’activation du plasminogène présentée
précédemment requiert le coassemblage du plasminogène
et de son activateur (uPA ou tPA) sur la même surface afin
d’enclencher le processus fibrinolytique ou protéolytique.
Des surfaces mobiles comme celles des plaquettes et des
microvésicules requièrent des conditions particulières pour
la production de plasmine.
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ematologie, vol. 17, n o6, novembre-décembre 2011

Les mécanismes de liaison
du plasminogène aux plaquettes
Comme d’autres membranes cellulaires, les plaquettes
peuvent adsorber le plasminogène à leur surface par des
interactions dépendantes de résidus Lys-C dont le nombre
est multiplié par 5 sur les plaquettes activées (liaison spéci-
fique, saturable et réversible) [6]. Cette liaison se fait par
l’intermédiaire de la GPIIb/IIIa (␣IIb ␤3) et du fibrinogène
(fibrine) des plaquettes activées par la thrombine [53, 54].
Ce plasminogène adopte une conformation ouverte plus faci-
lement activable par l’uPA. Les plaquettes pourraient ainsi
contribuer à localiser et augmenter la concentration du plas-
minogène – et potentiellement de la plasmine – au sein du
caillot, malgré leur activité procoagulante.
Les microvésicules et le système
d’activation du plasminogène
Les microvésicules sont des vésicules membranaires émises
par les cellules activées ou en apoptose [55]. De taille com-
prise entre 0,1 et 1 ␮m, portant de la phosphatidylsérine
à leur surface et ne contenant pas de fragments d’ADN,
les microvésicules ne doivent pas être confondues avec les
corps apoptotiques ou les exosomes (figure 2) [56]. La
formation et la libération des microvésicules se font suite
à un stimulus extracellulaire (physique, chimique ou biolo-
gique) qui entraîne une entrée massive de calcium dans
la cellule. L’augmentation de calcium intracellulaire modifie
l’activité des transporteurs des phospholipides et stimule les
calpaïnes. Il en résulte une externalisation de la phospha-
tidylsérine, des modifications de l’intégrité du cytosquelette
et une contraction cellulaire conduisant au bourgeonne-
ment des microvésicules à partir de la membrane cellulaire
[57]. De nombreuses pathologies telles que les maladies
cardio-vasculaires, le diabète, le cancer ou les maladies
inflammatoires ont été associées avec une augmentation du
nombre de microvésicules [58, 59].
Ces microvésicules portent à leur surface et dans leur cyto-
plasme des protéines de la cellule parentale. Outre les
clusters de différenciation (CD, spécifiques du type cellu-
laire), différentes biomolécules, dont le facteur tissulaire et
des cytokines inflammatoires, peuvent être vectorisées par les
microvésicules [60, 61]. En 2007, il a été montré que des
microvésicules produites par des cultures cellulaires issues
de la lignée HMEC-1 (lignée singularisée par la produc-
tion d’uPA et de son récepteur uPAR), stimulées au TNF␣,
étaient capables de générer de la plasmine [8]. En effet,
E
D
C
= uPAR
= tc-uPA
= Plasminogène
= Plasmine
= GPI
= Phosphatidylsérine
= Récepteur
au plasminogène
B
A
Figure 2. Activation du plasminogène sur une microvésicule.
Représentation d’une microvésicule fibrinolytique portant à sa surface (A) le récepteur uPAR ancré à la membrane par le glycosylphospha-
tidylinositol (GPI) ; B) changement de conformation d’uPAR après liaison avec sc-uPA ; C) sc-uPA est transformé in situ en tc-uPA ; D) le
plasminogène fixé sur son récepteur adopte la forme ouverte ; E) plasmine formée par le tc-uPA.
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ce type de microvésicules portent à leur surface des com-
plexes uPA/uPAR et des sites uPAR disponibles pouvant fixer
de l’uPA exogène (figure 2). La formation de plasmine à cette
«nouvelle »surface mobile est impliquée de fac¸on dose-
dépendante dans la réponse angiogénique des progéniteurs
endothéliaux in vitro.
La liaison du plasminogène à la surface des microvésicules
implique également les résidus Lys-C. Un anticorps sélectif
dirigé contre l’␣-énolase a permis de confirmer que ce récep-
teur majoritaire du plasminogène à la surface cellulaire était
impliqué dans la liaison du plasminogène à la surface des
microvésicules endothéliales. Récemment il a été démontré
qu’une protéine intracellulaire, l’histone H2B, était impliquée
dans la liaison du plasminogène à la surface des micropar-
ticules [24]. L’histone H2B serait localisée au niveau de la
membrane cellulaire via une interaction avec la phosphatidyl-
sérine exposée dans le feuillet externe de la membrane [62].
Ainsi, ce phospholipide procoagulant permettrait également
d’accroître le nombre des sites de liaison du plasminogène
et de favoriser la fibrinolyse.
Nous avons confirmé la présence de microparticules fibri-
nolytiques dans la circulation (travaux en cours). Ces
microparticules présentent des caractéristiques fonction-
nelles semblables à celles précédemment décrites et portent
l’activateur du plasminogène synthétisé par la cellule paren-
tale (leucocytes : uPA, cellule endothéliale : tPA). Ces résultats
soulignent la signification physiopathologique que ce type de
microparticules pourraient avoir in vivo.
Nouvelle voie d’activation
du plasminogène : le cross-talk
fibrinolytique
Le plasminogène adsorbé sur la fibrine ou sur les membranes
cellulaires adopte la conformation moléculaire ouverte, dont
le site de clivage est facilement accessible aux activateurs
situés à proximité sur la même surface. C’est le cas de
la formation du complexe ternaire plasminogène-fibrine-tPA,
ou de l’assemblage plasminogène-membrane-uPAR/uPA. Il a
cependant été constaté que l’uPA en solution était un acti-
vateur efficace du Lys-plasminogène et du Glu-plasminogène
complexé à l’EACA, alors que celui-ci est un inhibiteur de
la fibrinolyse par le tPA. Ces observations nous ont permis
d’émettre l’hypothèse de l’existence d’une interaction met-
tant en jeu deux surfaces portant distinctement l’activateur ou
le plasminogène [9]. Il a ainsi été possible de montrer que
le plasminogène porté par les plaquettes peut être reconnu
par de microvésicules ou des cellules portant le complexe
uPA/uPAR. Une réaction semblable a permis de montrer que
le plasminogène lié à la fibrine ou à des protéines matri-
cielles pouvait être activé en plasmine par l’uPA/uPAR porté
par des microvésicules d’origine leucocytaire. Ce nouveau
mécanisme d’activation du plasminogène, appelé cross-talk
fibrinolytique (figure 3), est caractéristique de l’uPA et n’est
pas donc pas sensible aux microvésicules portant du tPA.
Cette spécificité pourrait s’expliquer par des arrangements
structuraux imposés par les différents domaines du tPA (finger-
EGF-K1-K2-SP) et de l’uPA (EGF-K1-SP) (tableau 1). Cette
réaction d’activation possède donc toutes les caractéris-
tiques d’une réaction spécifique et saturante dont l’efficacité
dépend du nombre de microvésicules actives agissant sur
les plaquettes ou la fibrine. Cette nouvelle voie d’activation
pourrait avoir un rôle physiologiquement pertinent. En effet,
l’activation du plasminogène à la surface des plaquettes par
de l’uPA microvésiculaire génère deux fois plus de plasmine
que l’uPA en solution. Des études récentes réalisées par des
laboratoires indépendants ont confirmé notre hypothèse et
nos résultats [63-65]. Deux études ont rapporté l’activation
du plasminogène lié à la fibrine par l’uPA porté par les leu-
cocytes [63, 65], quand une troisième étude s’est focalisée
sur l’activation de sc-uPA par la plasmine formée à la surface
de plaquettes [64].
Conséquences du cross-talk
fibrinolytique
Ce nouveau mécanisme d’activation du plasminogène en
plasmine à la surface des plaquettes et des microvésicules
par l’activateur de type uPA pose la question de l’implication
de ce processus en différentes situations physiopatholo-
giques.
La fibrinolyse
La liaison du plasminogène aux plaquettes au cours de la for-
mation d’un caillot, et la présence de microvésicules portant
de l’uPA, conduiraient à la formation de plasmine et per-
mettraient une recanalisation ad hoc du vaisseau. Est-ce ce
phénomène qui explique la recanalisation spontanée obser-
vée chez 10 à 15 % des patients ayant eu une occlusion
aiguë des artères coronaires ? A contrario, est-ce un défaut
de microvésicules fibrinolytiques qui aboutirait à l’obstruction
ischémique ? Une étude récente suggère que l’activation du
plasminogène lié à la fibrine par des leucocytes portant de
l’uPA joue un rôle dans la fibrinolyse endogène [65]. Au
niveau de la fibrine, la transformation du plasminogène en
plasmine par des leucocytes ou ses microvésicules produirait
un effet antiadhésif pour les leucocytes et les plaquettes sur
le caillot [63].
La migration cellulaire et l’angiogenèse
Outre son profil fibrinolytique, le système d’activation du plas-
minogène par le système uPA/uPAR est impliqué dans le
remodelage tissulaire en activant des proMMP et joue un
rôle critique dans la migration cellulaire et l’angiogenèse
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H´
ematologie, vol. 17, n o6, novembre-décembre 2011

Protéolyse matricielle
Plasminogène/Matrice
(laminine, fibronectine)
MoMV
EndMV
uPA
Plaquette Plaquettes activées
Monocyte
MVs/Fibrine
Fibrine
Cellules/Plaquettes
Cellules/Matrice
MVs/Matrice
Protéolyse péricellulaire
Macrophage
Pg
Pg
Pn
Pn
Cross-talk fibrinolytique
Figure 3. Cross-talk fibrinolytique.
Le cross-talk fibrinolytique fait référence à l’interaction qui s’établit entre deux surfaces biologiques, l’une portant le plasminogène et l’autre
l’uPA. Dans le schéma, les surfaces portant le plasminogène sont représentées par la membrane plaquettaire, la fibrine ou la matrice
extracellulaire. Les surfaces portant l’uPA sont représentées par les microvésicules émises par les leucocytes. Les microvésicules étant des
surfaces mobiles, ce système d’activation intersurface permet une génération efficace de plasmine à la surface de la fibrine ou des plaquettes
constituant le caillot. Dans les processus inflammatoires de la paroi vasculaire ce système d’activation du plasminogène lié à la matrice
extracellulaire constitue un mécanisme intermédiaire de protéolyse (remodellage matricielle, migration cellulaire...).
[20]. En effet, la régénération vasculaire implique à la
fois l’angiogenèse et la vasculogenèse dépendant des
progéniteurs endothéliaux. La capacité des microvésicules
endothéliales à être des supports pour la génération de
plasmine influence et module les processus de réparation
des cellules endothéliales progénitrices. Une faible quan-
tité de microvésicules porteuses du système d’activation du
plasminogène favorise la migration cellulaire et augmente
l’angiogenèse, tandis qu’à de fortes concentrations, l’excès
de plasmine conduit à la dégradation de la matrice, à
l’altération de l’adhérence de la cellule à la matrice et à son
apoptose [8, 39].
La dissémination des cellules cancéreuses
La dissémination des cellules cancéreuses est une consé-
quence de la dégradation de la matrice et de la perte
d’adhérence cellulaire. De hautes quantités d’uPA/uPAR ont
été associées avec des cancers métastasés avancés [66]. Il
est intéressant de noter que le mécanisme de cross-talk décrit
n’est possible qu’en présence d’un activateur de type uPA.
Cet activateur est impliqué dans la progression tumorale et
a été retrouvé sur les microvésicules émises par de cellules
cancéreuses. En outre, des microvésicules directement relar-
guées par des plaquettes peuvent promouvoir les métastases
et favoriser l’angiogenèse [67].
Conclusion et applications
potentielles
Grâce aux travaux sur l’origine, la structure et la fonction
des molécules du système d’activation du plasminogène,
son rôle dans le maintien de l’hémostase et la prévention
des thromboses est maintenant bien établi. Cependant, la
détection ou la mise en évidence d’une dysfonction de ce
système restent des défis majeurs pour l’hématologie et la
biologie vasculaire. La concentration circulante des activa-
teurs du plasminogène est extrêmement faible, par rapport
aux concentrations actives requises sur le site de la lésion
dans la microcirculation. D’ailleurs, les activateurs circulent
sous la forme d’un complexe inactif avec le PAI-1, et seules
les formes localisées sur la membrane cellulaire (uPA, tPA)
ou sur la fibrine (tPA) sont actives. Il est donc impossible
H´
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de quantifier une insuffisance de tPA/uPA pouvant être à
l’origine d’un défaut fibrinolytique, d’autant plus que toutes
les mesures se font en milieu plasmatique et font abstrac-
tion de l’apport cellulaire d’activateurs du plasminogène.
La découverte récente de microvésicules cellulaires fibrino-
lytiques et celle d’un nouveau mécanisme de formation de
plasmine, le cross-talk fibrinolytique, ouvrent de nouvelles
perspectives [8, 9]. Ces microvésicules agiraient au sein
même du caillot, ce qui permettrait d’expliquer l’absence
de fibrinolyse systémique comme démontré in vivo dans
le modèle de plaquettes fibrinolytiques murines [68]. Nous
proposons que l’activité fibrinolytique de ces microvésicules
compense localement l’activité ubiquitaire procoagulante de
l’ensemble des microvésicules. Ainsi, l’équilibre fonction-
nel entre ces deux types de microvésicules se traduirait
par une réponse hémostatique physiologique, alors que le
manque de microparticules fibrinolytiques pourrait favori-
ser la constitution d’un thrombus. L’existence d’un syndrome
hémorragique (platelet Quebec disorder) provoqué par des
plaquettes profibrinolytiques ayant une expression anormale
d’uPA est compatible avec cette hypothèse [69]. À l’aide d’un
modèle murin de cette maladie autosomique dominante, il a
été possible de démontrer que ces animaux sont résistants
à la thrombose artérielle, et que la transfusion de ces pla-
quettes prévient la formation de thrombi artériels occlusifs
chez la souris contrôle [69].
Dans ce contexte, la présence de plasminogène et de
son activateur, l’uPA, sur des surfaces mobiles (plaquettes,
microparticules), et l’identification du cross-talk fibrinolytique,
suggèrent la possibilité d’utiliser ces supports comme des
vecteurs de fibrinolyse et de protéolyse péricellulaire afin
d’induire localement les effets de la plasmine.
Les microvésicules, initialement apparentées à des débris
cellulaires, semblent capables d’influencer un large panel
de processus physiologiques et pathologiques. L’existence
des processus physiopathologiques dans lesquels les
microvésicules seraient impliquées (purpura thrombotique
thrombocytopénique, coagulation intravasculaire dissémi-
née, atteintes vasculaires, processus inflammatoires) permet
de proposer leur utilisation (a) comme des outils thérapeu-
tiques et des médiateurs pour un large nombre de maladies,
et (b) pour la réparation et le génie tissulaire. 
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