Scheme of the imprinted gene cluster on chromosome 11p15. “ Mat ” indiciates a maternal allele, “ Pat ” indicates a paternal allele, and “ Ch3 ” represents a methylation site. Arrows indicate the directions. Two BWSICs are shown below the genes. 

Context in source publication

Context 1

... Wiedemann 증후군 (BWS) 는 1963 년 Beckwith JB 와 1964 년 Wiedemann HR 에 의해 처음 보고된 질환으로 1, 2) , 거구증 (macrosomia), 대설증 (macroglossia), 배꼽탈장 (omphalocele), ear creases, viceromeglay ( 신장이나 간 등 의 비대증 ), embryonal tumor, hemihyperplasia, 부신피질세 포거대증 (adrenocortical cytomegaly), 그리고 저혈당증 등의 주요 증상을 특징으로 한다 . BWS 는 11 번 염색체에서의 유전 체 각인 (genomic imprinting) 의 이상에 의해 발생되며 , 11p15 위치에 있는 H19 DMR (differentially methylated region) 로 알려진 BWSIC1 과 KCNQ1 DMR 로 알려진 BWSIC2 인 두 개의 imprinting center 가 연관되어 있다 3) . BWSIC1 은 종양 억제 기능을 가지는 non-coding RNA 에 대 한 유전자인 H19와 IGF2 (insulin- like growth factor2) 유 전자의 발현 조절에 관여하는 메칠화 군집으로 부계로부터 유 래된 allele 이 메칠화되어 있다 . BWSIC2는 voltage-gated potassium channel 유전자인 KCNQ1의 LIT1 (Long QT intronic transcript 1, 또는 KCNQ1OT1) 에서의 메칠화된 군 집으로 모계로부터 유래된 allele 이 메칠화되어 존재한다 (Fig. 1). BWS 환자의 약 40% 는 BWSIC2에서 메칠화 이상을 보이 며 , 이는 가장 흔한 빈도를 보이는 유전적 이상이다 . BWS 환자 의 20-25% 는 11p15 부위에서 부계 유래의 uni-parental disomy (UPD) 를 보이고 , 약 10% 의 BWS 환자는 B WSIC1 의 돌연변이에 의한 H19 및 IGF2의 비정상적 메칠화를 보이며 , 나 머지 약 30% 의 환자는 정상 메칠화 양상을 보인다 4) . 따라서 , 11 번 염색체의 메칠화 양상을 확인함으로써 전체 BWS 환자의 약 70% 에 대한 유전적 진단이 가능하다 . 일반적으로 유전체 메칠 화 양상을 확인하는 방법은 DNA 에 bisulfite 를 처리하여 메칠화 되지 않은 cytosine 염기를 uracil 로 변성시킨 후 , 변성이 방지 된 메칠화된 cytosine 과 구분하는 methylation specific PCR (MS-PCR) 방법 5) 이 이용되고 있다 . 따라서 본 연구에서는 11 번 염색체의 BWSIC1 과 BWSIC2의 메칠화 양상을 확인할 수 있는 MS-PCR 방법을 이용한 BWS 의 유전적 진단에 관하여 보 고하고자 한다. 서울아산병원 의학유전학클리닉으로 의뢰된 12 명의 BWS 환자를 대상으로 하였다 . Genomic DNA 는 PUREGENE DNA isolation kit (Gentra, Minneapolis, USA) 를 이용하여 환자의 말초혈액으로부터 분리하였다 . 분리된 genomic DNA 1ug 에 bisulfite 용액을 처리하여 50 °C 에서 16 시간 동안 DNA 변성을 유도한다 . Bisulfite 용액은 20 mM hydroquinone 를 포함한 1N NaOH 에 3.5M sodium bisulfate 를 녹여 사용하였 다 . 변성된 DNA 는 잔존하는 bisulfite 를 제거하기 위하여 column 방식의 DNA 분리키트인 GeneAll (Generalbiosys- tems, Korea) 를 이용하여 정제한 후 PCR 반응의 주형으로 사 용하였다 . PCR 반응에 사용된 시발체의 염기서열은 bisulfite 에 의해 변성된 염기들에 대한 염기서열을 반영하였고 Table 1 과 같다 . PCR 반응은 20 ul 를 최종용적으로 100 ng 의 변성 된 주형 DNA, 1pmole 의 각각의 시발체 , 200 uM dNTPs, 1.5 mM MgCl 2 , 50 mM KCl, 10 mM TrisCl (pH 8.3) 조건에서 1 unit 의 Taq polymerase (Promega, USA) 를 이용하여 , 94 °C 30 초 분리 , 60 °C 에서 30 초간 교잡 , 72 °C 에서 45 초간 반응과정 을 PTC200 (MJ-Research, USA) 을 이용하여 35 회 반복하 였다 . 증폭된 산물은 1.5% agarose 젤에서 증폭 여부를 확인하 였고 , 증폭된 산물 4 ul 에 제한효소 XmnI, BsaBI, NlaIII (NEB, USA) 을 각각 1 unit 처리하여 37 °C 에서 3 시간 반응하였다 . 그 후 제한효소의 절단 여부를 확인하기 위해 8% polyacrylamide 젤 전기영동을 시행하였다. 총 12 명의 BWS 환자 ( 남 : 6 명 , 여 : 6 명 ) 중 in vitro fertili- zation 에 의하여 쌍둥이로 출생한 환자는 1 명 (8.3%) 이었다 . 8 명 (66.7%) 의 환자가 미숙아로 출생하였다 . 진단 시 나이는 0.6 ± 1.4 세 (0.0-4.9) 였다 . 모든 환자가 대설증을 보였고 , 8 명 (66.7%) 이 일시적 저혈당증을 경험하였다 . 6 명 (50.0%) 의 환자가 귀의 기형을 가졌고 , 4 명 (33.3%) 의 환자가 배꼽 탈장 을 보였다 . 2 명 (16.7%) 에서 편측비대 (hemihyperplasia) 가 발견되었다 . 복부 장기에 대한 검사 상 간비대 (2 명 , 16.7%), 콩팥비대 (2 명 , 16.7%), 췌장비대 (1 명 , 8.3%) 가 발견되었다 . 이들 12 명의 환자들을 대상으로 염색체 검사를 시행하였고 , 모두 정상이었다 . MS-PCR 을 시행하였으며 , H19, IGF2, LIT1 부위는 각각 230bp, 255bp, 179bp 의 크기로 증폭되었 다 (Fig. 2A). 제한효소 처리 후 결과에서 H19의 경우 메칠화 된 부계 allele 에 제한효소 Xmn I 이 작용하여 , 162bp 와 68bp 의 절단산물이 나타났고 , IGF2 는 메칠화된 모계 allele 에 제한 효소 BsaB I 이 작용하여 235bp 와 20bp 의 절단산물이 나타냈 다. LIT1은 비메칠화된 부계 allele 에 제한효소 Nla III 가 작용 하여 149bp 와 30bp 의 절단산물이 나타냈다 (Fig. 2B). 12 명의 BWS 환자 중 , 7 명의 환자 (58.3%) 에게서 Nla III 에 의해 모두 절단되어지는 비정상적 메칠화 양상이 LIT1 부위에 서 관찰되었다 . 이는 모두 비메칠화된 양상을 보이는 것으로 , 부계로부터 유래된 LIT1만을 가지고 있는 것을 의미한다. H19와 IGF2에서의 비정상적 메칠화 양상은 관찰되지 않았다. BWS 는 임상적으로 overgrowth malformation syndrome 을 특징으로 하며 , 11 번 염색체의 유전체 각인이상에 의한 질환 으로 알려져 있다 . 세포유전학적 방법인 말초혈액의 염색체 분 석이나 fluorescent in situ hybridization (FISH) 등을 통해 11 번 염색체의 중복 , 전좌 , 역위 등을 확인할 수 있으며 , 이는 BWS 환자의 약 1-2% 에 해당한다 . 또한 , micro satellite 분석 을 통해 부계 유전 UPD 여부를 확인 가능하며 , 이는 전체 환 자 의 10-20% 정도에서 발견된다 . 현재까지의 보고에 의하면 MS-PCR 을 통하여 약 50-60% 의 BWS 환자에서 비정상적인 메칠화 양상을 확인할 수 있으며 4) , 대부분은 BWSIC2 즉 LIT1 부위에서 비정상적 메칠화 양상이 발견된다 . 본 연구에서도 이 와 비슷하게 58.3% 의 환자에서 이상이 발견되었다 . 최근 에 소 개된 MS-MLPA (methylation specific-multiplex ligation dependent probe amplification) 방법은 microdeletion, UPD, imprinting defect 의 확인이 가능한 방법으로서 6,7) , 이를 통하여 부분적 메칠화 이상을 발견할 수 있으므로 BWS 환 자에서의 유전적 진단 양성률을 70-80% 까지 높일 수 있다 . 또 한 , BWSIC2 에 의해 발현에 영향을 받는 CDKN1C (Cyclin- dependent kinase inhib itor 1C) 유전자의 돌연변이에 의한 BWS 도 보고되고 있다 . 우성유전의 가족력이 있는 환자의 약 40%, 그리고 가족력이 없는 환자의 5-10% 의 BWS 환자가 CDKN1C 유전자의 돌연변이를 보인다 8,9) . BWS 의 진단에 관련 된 분자유전학적 방법은 Table 2 에 정리하였다 . BWSIC1 에 위치 하는 H19는 종양 억제 기능을 가지며, IGF2는 성장인자로 서로 길항적으로 작용한다. H19의 경우 , 부계 allele 이 메칠화되어 있 어 zinc finger protein 인 CTCF (CCCTC-binding factor) 의 영향을 받지 않아 부계로부터 유래된 allele 에서는 발현이 되지 않 는 반면 IGF2가 발현이 되고 , 모계로부터 유래된 allele 에서는 CFCF binding domain 이 비메칠화되어 있어 CTCF 가 결합하게 되고 결과적으로 H19가 발현됨으로써 IGF2의 발현이 억제된다. H19 DMR 부위에서 모계 allele 이 메칠화되면 , 결과적으로 IGF2 가 과메칠화 (hypermethylation) 되면서 H19 의 발현억제과 IGF2의 과발현을 초래함으로써 BWS 가 유래된다 . 반대로 부계 의 H19 DMR 이 비메칠화되어 IGF2가 저메칠화(hypomethy- latin) 이 되면 , H19가 과발현되고 IGF2의 발현이 억제됨으로써 성장이 저해되는 Silver-Russell syn drome 이 초래된다 10) . 이 러한 과메칠화 또는 저메칠화는 완전한 LOM 또는 GOM (Loss of -, Gain of methylation) 이 아닌 부분적인 메칠화 이상에 의해 서도 야기될 수 있다 10) . MS-PCR RFLP 방법을 이용하면 , 완전 한 LOM/GOM 이 아닌 부분적인 메칠화에 의해 정상 혹은 비정상 의 allele 의 증폭이 이루어지므로 비정상여부의 판별이 불가능하 며 , MS-MLPA 를 통하여 확인이 가능하다 . 본 연구를 통하여 bisulfite 처리를 이용한 MS-PCR RFLP 방법으로 약 60% 의 BWS 환자에 대한 유전적 진단이 가능하 였다 . 하지만 , 본 방법으로는 부분적 메칠화 이상을 발견할 수 는 없었으며 , 진단 양성률을 높이기 위한 방법의 도입이 필요하 다고 판단된다 . 그러나 FISH, microsatellite 분석 , MS- MLPA 방법 등이 고가의 장비와 시약 비용이 필요한 방법이므 로 , 여기서 소개한 MS-PCR RFLP 방법은 비교적 경제적이고 사용자에게 친화적인 손쉬운 방법으로 선별적 유전자 검사로 용의하게 이용될 수 있을 것이다. 본 연구는 보건복지가족부 희귀내분비질환의 분자유전학적 진단 및 치료지침 개발 과제 (A080588) 의 연구비 지원에 의하 여 이루어졌음. 목 적 : Beckwith-Wiedemann 증후군 (BWS) 은 11p15 부 위의 메칠화 양상의 이상으로 인한 overgrowth malformation symdrome 이다 . 11p15 부위에는 두 가지 imprinting center, 즉 BWSIC1 (IGF2, H19 ) 와 BWSIC2 (LIT1 , KvDMR) 가 존재 한다 . 본 연구에서는 methylation-specific (MS) PCR RFLP 방법을 이용한 BWS 의 유전적 진단을 보고하고자 한다 . 대상 및 방법 : 임상 소견을 바탕으로 12 명의 BWS 환자가 포함되었다 . 환자의 말초혈액으로부터 염색체 핵형을 조사하 였다 . 분리한 DNA 에 bisulfite 를 처리한 후 , LIT1, H19, IGF2 DMR 부위는 각각의 MS primer 를 이용하여 증폭하였다 . 적절 한 제한효소를 이용하여 절단 여부를 PAGE 로 확인함으로써 각각의 DMR 부위에 대한 메칠화 이상 여부를 확인하였다 . 결 과 : 12 명의 환자는 모두 정상 핵형을 보였다 . MS-PCR RFLP 상 총 7 명 (53.8%) 의 환자가 이상 소견을 보였으며 , 모 두 BWSIC2 (LIT1 ) 에 비정상적 메칠화를 보였고 모두 부계 유래의 비메칠화된 allele 만이 발견되었다 . 결 론 : 본 연구를 통해 MS-PCR RFLP 검사로 BWS 환자 의 약 50-60% 정도에서 유전적 진단이 가능함을 알 수 있었 으며 , 이는 BWSIC2 부위의 메칠화 이상을 발견하는데 손쉽게 이용될 수 있을 것으로 판단된다 . 그러나 , BWSIC1 부위의 메 칠화 이상은 발견이 어려우며 , 이 부위의 이상을 발견하기 위해 서는 메칠화를 정량적으로 분석할 수 있는 방법이 ...