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De nombreuses réactions enzymatiques sont à l’origine de processus physiologiques au sein des organismes vivants. Ces réactions sont basées sur des transferts de protons et d’électrons et con-duisent souvent à la production d’espèces secondaires. Parmi elles, les espèces réactives de l’oxygène et de l’azote (ROS, RNS) présentent un intérêt particul...
Contexts in source publication
Context 1
... au sein du cytoplasme se trouvent également un noyau entouré d'une membrane nucléaire et de nombreux organites, tels que les mitochondries ou encore l'appareil de Golgi. La membrane plasmique est formée par une bicouche phospholipidique contenant de nombreuses biomolécules dont des protéines de transport, assurant des échanges entre intérieur et extérieur de la cellule, des enzymes ou des glucides (glyco- protéines, glycolipides) ayant un rôle d'agent de reconnaissance et de structuration (Figure 1). ...
Context 2
... µí°¹ = í µí°¸íµí°¸í µí°µí µí±í µí±í µí± + í µí°¸íµí°¸í µí±í µí±í µí±í µí±í µí± + í µí°¸íµí°¸í µí±í µí±í µí±í µí±í µí±í µí± + í µí°¸íµí°¸í µí±í µí±í µí±¢í µí±¡í µí±í µí± L'énergie libre F est la somme de l'énergie de Born, de l'énergie « image », de l'énergie dipolaire et de l'énergie neutre. Ces différents termes sont explicités brièvement ici : L'énergie de Born correspond à l'énergie de transfert (énergie électrostatique) d'un ion de charge q et de rayon r d'un milieu de constante diélectrique í µí¼ 2 vers un milieu de constante diélectrique í µí¼ 1 ( Figure 10) ...
Context 3
... dans la membrane d'épaisseur í µí± et de constante diélectrique í µí¼ 1 à une distance í µí±¥ de l'interface diélectrique ( Figure 10) : ...
Context 4
... A la température de transition, les deux conformations coexistent et des domaines de phases se for- ment, on parle alors de « séparation de phase latérale » [36], [37]. Les zones interfaciales entre ces domaines de phases sont décrites comme des régions instables conduisant à une diminution d'énergie d'activation pour la perméation d'un ion ( Figure 11) [18], [38]. D'autres études ont montré que cette théorie était en accord avec les premiers résultats de Papahadjopoulos sur la diffusion des ions sodium [32], [39], [40]. ...
Context 5
... fluctuations thermiques entrainent le mouvement des chaines hydrocarbures. Une molécule peut alors être piégée entre deux chaines et les mouvements oscillants entrainent le déplacement de Figure 11 Modélisation des domaines de phases pouvant exister au sein d'une membrane de lipide proche de la température de transition. Le rouge représente les lipides en phase gel, le bleu représente les lipides en phase fluide et le mélange bleu clair et rose représente une interface dans laquelle les deux phases coexistent. ...
Context 6
... la molécule le long du lipide, lui permettant ainsi de diffuser à travers la membrane. Ces « espaces » entre lipides sont des pores statistiques générés par une isomérisation rotationnelle le long de la chaine carbonée ( Figure 12) [47]. Träuble explique que ces trous se forment à partir d'une chaine carbonée droite dont les liaisons C-C sont en conformation trans. ...
Context 7
... réactions enzymatiques multi-étapes ont ainsi été étudiées dans des vésicules multi-compartiments dites DIB (Droplets Interface Bilayer). Notamment, la réaction en cascade mettant en jeu la lactase, la glucose oxydase et la peroxydase a été étudiée par Elani et al. dans des vésicules double-ou triple-comparti- ments [56] (Figure 14). ...
Context 8
... cette étude, les réactifs sont encapsulés chacun dans un compartiment et les propriétés de perméabilité des membranes, où l'insertion de pores α-hémolysine ( Figure 15) permettent le pas- sage des produits d'un compartiment à l'autre ( Figure 16 b-d). La taille des pores formés par le ton- neau β complet de l'α-hémolysine est donnée à environ 1,5 nm de diamètre, permettant le passage de petites molécules (inférieures à 2000 g.mol -1 ) comme le glucose (1 nm). ...
Context 9
... cette étude, les réactifs sont encapsulés chacun dans un compartiment et les propriétés de perméabilité des membranes, où l'insertion de pores α-hémolysine ( Figure 15) permettent le pas- sage des produits d'un compartiment à l'autre ( Figure 16 b-d). La taille des pores formés par le ton- neau β complet de l'α-hémolysine est donnée à environ 1,5 nm de diamètre, permettant le passage de petites molécules (inférieures à 2000 g.mol -1 ) comme le glucose (1 nm). ...
Context 10
... taille des pores formés par le ton- neau β complet de l'α-hémolysine est donnée à environ 1,5 nm de diamètre, permettant le passage de petites molécules (inférieures à 2000 g.mol -1 ) comme le glucose (1 nm). La réaction étudiée comporte trois étapes : la première étape correspond à la transformation du lactose en glucose par la lactase (réaction 1), puis ce glucose est oxydé en peroxyde d'hydrogène et gluconolactone par la glucose oxydase (réaction 2) et enfin le peroxyde d'hydrogène oxyde l'Amplex Red en resorufine en présence [56] a b de peroxydase (réaction 3) (Figure 16 a). La resorufine est une espèce fluorescente facilement obser- vable par microscopie de fluorescence, comme nous le verrons dans nos propres études, et permet donc de visualiser la réussite de la réaction en cascade. ...
Context 11
... le premier compartiment sont encapsulés le glucose et la glucose oxydase. Le peroxyde d'hydrogène est alors produit dans ce premier compartiment et diffuse dans le second compartiment contenant l'Amplex Red et la peroxydase, produisant le produit fluorescent, la resorufine (Figure 16 b). La seconde expérience consiste à nouveau à réaliser l'enchaînement des réactions 2 et 3 mais cette fois, des pores (α-hémolysine) sont présents dans la membrane d'un des compartiments. ...
Context 12
... seconde expérience consiste à nouveau à réaliser l'enchaînement des réactions 2 et 3 mais cette fois, des pores (α-hémolysine) sont présents dans la membrane d'un des compartiments. Le glucose est présent dans le milieu extérieur et diffuse dans le premier compartiment via les pores (Figure 16 c). Enfin, une vésicule triple-compartiments est utilisée dans la dernière expérience pour réaliser les trois réactions en cascade dans chacun des trois compartiments. ...
Context 13
... glucose est alors converti en gluconolactone et peroxyde d'hydrogène. Ce dernier diffuse alors à travers la membrane vers le troisième compartiment où il oxyde l'Amplex Red en resorufine en présence de peroxydase (Figure 16 d). ...
Context 14
... et al. ont récemment, et pour la première fois, mis au point une technique de microfluidique utilisant le phénomène de démouillage, couramment employé dans la préparation des polymersomes, pour former ces microréacteurs multi-compartiments [59]. Ils ont formé des liposomes unilamellaires monodisperses comptant entre un et quatre compartiments ( Figure 17). Ils ont également intégré des nanopores à la membrane, grâce à l'α-hémolysine (décrite précédemment) et à la melittine (pores de 1 à 3 nm ou 3,5 à 4,5 nm) pour démontrer l'unilamellarité de leurs systèmes. ...
Context 15
... ont également intégré des nanopores à la membrane, grâce à l'α-hémolysine (décrite précédemment) et à la melittine (pores de 1 à 3 nm ou 3,5 à 4,5 nm) pour démontrer l'unilamellarité de leurs systèmes. L'encapsulation de calcéine (623 g.mol -1 ) dans un compartiment d'un liposome double-compartiment et de rhodamine B dextran isothiocyanate (70 000 g.mol -1 ) et de pores α-hémo- lysine dans le second compartiment, a permis de mettre en évidence que la membrane interne entre deux compartiments est bien une bicouche ( Figure 18). Ce paramètre classe donc ces systèmes comme utilisables pour l'étude de la communication entre deux cellules biomimétiques. ...
Context 16
... systèmes sont formés par une capsule (diamètre supérieur à 100 µm) possédant un coeur gel réticulé et une écorce polymère semi-perméable. A l'intérieur se trouvent des microcapsules me- surant environ 3 µm de diamètre, composées d'un coeur gel réticulé sensible à l'eau, et d'une écorce polymère semi-perméable ( Figure 19). Dans les deux cas, l'écorce est obtenue par un dépôt couche par couche (Layer by Layer ou LbL) à partir de l'alternance de polymères chargés positivement (poly- L-arginine) et de polymères chargés négativement (sulfate de dextran). ...
Context 17
... glucose oxydase d'Aspergillus niger transforme le D-glucose en D-δ-gluconolactone et peroxyde d'hydrogène selon un mécanisme en deux étapes, dit mécanisme ping pong Bi Bi [71]. Dans ce type de mécanisme, un produit est relargué avant que tous les substrats ne soient fixés et le passage par des états intermédiaires impliquant la formation de complexes [Enzyme-Substrat] et [EnzymeProduit] est observé ( [ES] et [EP]) [72] (Figure 21). ...
Context 18
... Cinétique enzymatique La cinétique à l'état stationnaire de l'oxydation du glucose par la glucose oxydase obéit au mécanisme ping pong Bi Bi décrit par la Figure 21 ...
Context 19
... Controverse autour des mécanismes réactionnels des NO-Synthases L'oxydation du substrat L-arginine par les NO-synthases implique un mécanisme en deux étapes : la première étape correspond à l'hydroxylation de l'arginine en N ω -hydroxyarginine, elle- même oxydée en L-citrulline et monoxyde d'azote dans la seconde étape (Figure 31). Les NO-synthases, tout comme les cytochromes P450, possèdent un fer hémique lié à un groupement thiol et leur mécanisme réactionnel a naturellement été associé à celui des P450 [131]. ...
Context 20
... enfin, les intensités de courant à 450 et 300 mV correspondent à la contribu- tion de H 2 O 2 et ONOO -. Ceci se traduit par un système de quatre équations à quatre inconnues, qui peut être résolu grâce aux données de la Figure 51. [195]- [197] dont le noir de platine qui est électrodéposé et conduit à la cristalli- sation d'une nanostructure poreuse de Pt de très grande surface spécifique permettant une détection très sensible du peroxyde d'hydrogène (jusqu'à quelques nanomolaires). ...
Context 21
... que cette technique de modification de surface soit connue depuis une trentaine d'an- nées, ce n'est seulement que récemment que Badets et al. ont pu déchiffrer le mécanisme catalytique du noir de Pt lors de l'oxydation d'H 2 O 2 en tampon phosphate (PBS 10 mM, pH 7,4) [200]. Ils ont Figure 51 Intensités des courants détectés par chro- noampérométrie à différents potentiels d'oxyda- tion (+300 mV, +450 mV, +650 mV et +850 mV vs. ECSS) sur des cellules uniques (macrophages). La flèche représente le moment où la dépolarisation de la membrane est déclenchée, entrainant la libé- ration des ROS et RNS. ...
Context 22
... première phase où l'amplitude augmente permet le gonflement du film de lipides et des premières vésicules commencent à apparaitre. Une seconde phase de croissance où les premières petites vésicules fusionnent pour en former de plus grosses est ensuite nécessaire ( Figure 61). ...
Context 23
... champ électrique serait alors responsable d'une agitation mécanique douce permettant d'assister les phénomènes d'osmoses déjà explicités, et donc la formation, puis fu- sion et détachement des vésicules. Ce mouvement d'électroosmose est décrit comme perpendiculaire au film de lipides [236] (Figure 61 a). ...
Context 24
... capillaire est façonné de manière à former une pointe de diamètre variable en fonction de l'applica- tion, on parlera de micropipette (voir Annexe II.2 pour le protocole de fabrication). Dans le cas de l'injection de liposomes unilamellaires, un diamètre de moins d'un micromètre (200-250 nm) est op- timal pour garantir l'efficacité de la microinjection tout en limitant la fuite de la solution en dehors du capillaire (Figure 100) [263]. Les volumes injectés sont de l'ordre du femtoliltre et sont régulés en temps et en pression par un système pressurisé à air (voir Annexe I.2). ...
Context 25
... est donc basée sur la théorie de l'électro-perméabilisation et consiste à utiliser une micropipette équipée d'une électrode pour injecter une solution tout en appliquant des impulsions électriques (pulses) de courte durée grâce à un générateur (Figure 101). Un second fil de platine est placé dans le milieu environnant comme contre électrode. ...
Context 26
... pipette est placée en contact avec la membrane de manière à appliquer une légère con- trainte mécanique (Figure 102 a). Un pulse électrique déstabilise la membrane et il y a création d'un pore localisé au niveau de la pointe de la pipette. ...
Context 27
... fait de la légère pression mécanique appliquée sur la membrane, la pénétration de la pipette dans la vésicule est immédiate lorsque l'impulsion élec- trique est envoyée. Dès lors que le pulse est terminé, le pore se referme autour du capillaire et la vésicule regagne sa forme sphérique (Figure 102 b). ...
Context 28
... pression est ensuite appliquée vers la solution contenue dans la pipette grâce au système pressurisé d'injection ( Figure 103). La présence du réservoir de lipides permet, à cette étape, de compenser la tension de membrane induite par l'injection d'une solution dans un volume « fini ». ...
Context 29
... combinant la microinjection et l'électroporation, nous avons pu injecter de petites molécules telles que la fluorescéine, la calcéine, l'Amplex Red ou la resorufine ; ou des macromolécules comme la glucose oxydase, la peroxydase de raifort (HRP) ou encore la NO-synthase inductible. Par ailleurs, des particules de polystyrène fluorescentes ont également pu être encapsulées ( Figure 104). Un autre avantage de l'électro-microinjection est son caractère non invasif puisque les ampli- tudes de champ électrique et le temps des impulsions utilisées permettent aux pores membranaires de se refermer. ...
Context 30
... aspect est important sur cette expérience en particulier, puisqu'il s'agit de microscopie plein champ et non con- focale. L'épifluorescence a été utilisée ici uniquement dans le but de comparer ce résultat avec celui présenté en Figure 105. Le signal de fluorescence obtenu est légèrement bruité mais ne décroit que très faiblement au cours de l'analyse ( Figure 106). ...
Context 31
... a été utilisée ici uniquement dans le but de comparer ce résultat avec celui présenté en Figure 105. Le signal de fluorescence obtenu est légèrement bruité mais ne décroit que très faiblement au cours de l'analyse ( Figure 106). Ceci confirme que les observations faites précé- demment ne sont pas dues au phénomène de photoblanchiment. ...
Context 32
... molécule possède un rayon hydrodynamique (R h ) de 6,0 nm [292]. Après microinjection, le suivi de la fluorescence à l'in- térieur de la vésicule est assuré par microscopie plein champ à raison d'une image enregistrée toutes les 10 secondes pendant 1h (Figure 107). Le signal de fluorescence décroit au cours du temps, mon- trant que les molécules de Dextran FITC encapsulées sortent de la vésicule. ...
Context 33
... des vésicules analysées sont présentées sur les Figure 108 à Figure 111. Pour chaque composition de lipides, une inhomogénéité en termes de cinétique de diffusion est constatée mais une tendance est observée avec une cinétique plus lente pour les deux compositions à base d'Egg PC. ...
Context 34
... des vésicules analysées sont présentées sur les Figure 108 à Figure 111. Pour chaque composition de lipides, une inhomogénéité en termes de cinétique de diffusion est constatée mais une tendance est observée avec une cinétique plus lente pour les deux compositions à base d'Egg PC. ...
Context 35
... est d'enregistrer des images dans un plan donné de la solution puis d'analyser toutes vésicules passant dans le champ, poussées par la convection. Une analyse statistique sur plusieurs centaines d'images a mis en évidence que, pour environ 60% des vésicules observées (dans l'approximation où chaque vésicule n'est observée qu'une seule fois), le signal de fluorescence dans le milieu intravési- culaire augmente mais que 30% d'entre elles semblent « imperméables » à la calcéine contrairement à ce qui avait été observé précédemment (Figure 105). La différence réside très certainement dans la statistique. ...
Context 36
... expérience permet donc de faire un double contrôle : (1) pas de tension mécanique donc pas de pores transitoires et (2) absence d'impul- sions électriques donc pas d'oxydation des phospholipides. Le signal de fluorescence au niveau de la vésicule est suivi par microscopie confocale (Figure 112). Comme sur les essais effectués avec les GUVs électroformées, nous observons une augmen- tation de la fluorescence dans la vésicule indiquant que le polymère diffuse progressivement de l'ex- térieur vers l'intérieur du liposome. ...
Context 37
... sur les essais effectués avec les GUVs électroformées, nous observons une augmen- tation de la fluorescence dans la vésicule indiquant que le polymère diffuse progressivement de l'ex- térieur vers l'intérieur du liposome. Cependant sur la Figure 112, le signal de fluorescence est enre- gistré pendant plus de 4h. Ainsi si la cinétique de diffusion observée ici est comparée avec celles obtenues pour les vésicules électroformées, il en résulte que celle des GUVs avec réservoir semble a priori plus lente. ...
Context 38
... seconde condition physique nécessaire à la formation d'un nanotube est l'application d'une force localisée sur un point en surface de la vésicule et d'énergie suffisante pour tirer un nanotube, c'est-à- dire pour modifier considérablement le rayon de courbure des lipides ; la micromanipulation répond à cette exigence. Cette force est donnée par l'Equation 40 [303]: (26) de la pointe de la pipette (Figure 113 d). La nouvelle vésicule est ensuite immobilisée sur un substrat (lame de verre recouverte d'une résine époxy de type SU-8, voir protocole détaillé en Annexe II.4.b) (Figure 113 e). ...
Context 39
... force est donnée par l'Equation 40 [303]: (26) de la pointe de la pipette (Figure 113 d). La nouvelle vésicule est ensuite immobilisée sur un substrat (lame de verre recouverte d'une résine époxy de type SU-8, voir protocole détaillé en Annexe II.4.b) (Figure 113 e). Enfin, la micropipette est retirée de la vésicule par application d'impulsions électriques cathodiques (Figure 113 f). ...
Context 40
... nouvelle vésicule est ensuite immobilisée sur un substrat (lame de verre recouverte d'une résine époxy de type SU-8, voir protocole détaillé en Annexe II.4.b) (Figure 113 e). Enfin, la micropipette est retirée de la vésicule par application d'impulsions électriques cathodiques (Figure 113 f). Ces étapes constituent la base de la formation des réseaux de vésicules. ...
Context 41
... plusieurs géométries de NVN existent et sont plus ou moins complexes. En effet, la première possibilité est de répéter les étapes de la Figure 113 et un réseau de vésicules filles toutes connectées à la vésicule mère peut être ainsi obtenu. Par ailleurs, il est également possible, après formation de la première vésicule fille et immobilisation, de poursuivre la formation d'une seconde vésicule fille de manière analogue aux étapes b à e. La vésicule mère continue de fournir les lipides nécessaires pour la création de cette vésicule même via l'intermédiaire de la première vésicule fille. ...
Context 42
... le cadre de notre projet, l'idée de base était d'utiliser cette technologie pour déclencher la réaction enzymatique de manière contrôlée. Dans le cas de l'étude de la NO-Synthase, une première vésicule fille pourrait être formée avec l'enzyme et les cofacteurs lui permettant d'être dans sa con- formation active (BH 4 , L-Arginine, calmoduline) (Figure 114 a-c). La GUV serait ensuite déposée sur le substrat SU-8 puis la pipette serait retirée. ...
Context 43
... GUV serait ensuite déposée sur le substrat SU-8 puis la pipette serait retirée. Une seconde vésicule est formée mais, cette fois, avec le substrat (NADPH) (Figure 114 d). Le système est alors dans une configuration où deux vési- cules filles sont connectées à la vésicule mère et une des vésicules est toujours connectée à la pointe de la pipette. ...
Context 44
... système est alors dans une configuration où deux vési- cules filles sont connectées à la vésicule mère et une des vésicules est toujours connectée à la pointe de la pipette. Cette dernière est alors déplacée de sorte que les deux nanotubes se réarrangent sous l'effet de la minimisation de l'énergie libre du système (Figure 114 e-f). En effet, du fait la continuité de la membrane, les propriétés d'auto-assemblage constituent alors un outil fascinant. ...
Context 45
... libre d'un nanotube de lipide est si élevée que celui-ci ne peut pas exister naturellement s'il n'est pas attaché entre deux points. En cas de former une jonction à trois voies (three-way junctions) avec un angle de 120° entre les trois voies (Figure 114 e, Figure 115), ceci constituant la configuration de moindre énergie. La vésicule fille continue d'être déplacée jusqu'à ce que les nanotubes se soient réarrangés pour former une connexion directe entre les deux vésicules filles, l'une contenant l'enzyme et l'autre le substrat (Figure 114 f). ...
Context 46
... libre d'un nanotube de lipide est si élevée que celui-ci ne peut pas exister naturellement s'il n'est pas attaché entre deux points. En cas de former une jonction à trois voies (three-way junctions) avec un angle de 120° entre les trois voies (Figure 114 e, Figure 115), ceci constituant la configuration de moindre énergie. La vésicule fille continue d'être déplacée jusqu'à ce que les nanotubes se soient réarrangés pour former une connexion directe entre les deux vésicules filles, l'une contenant l'enzyme et l'autre le substrat (Figure 114 f). ...
Context 47
... cas de former une jonction à trois voies (three-way junctions) avec un angle de 120° entre les trois voies (Figure 114 e, Figure 115), ceci constituant la configuration de moindre énergie. La vésicule fille continue d'être déplacée jusqu'à ce que les nanotubes se soient réarrangés pour former une connexion directe entre les deux vésicules filles, l'une contenant l'enzyme et l'autre le substrat (Figure 114 f). La dernière étape consiste simplement à rapprocher les deux vésicules filles (Figure 114 g). ...
Context 48
... vésicule fille continue d'être déplacée jusqu'à ce que les nanotubes se soient réarrangés pour former une connexion directe entre les deux vésicules filles, l'une contenant l'enzyme et l'autre le substrat (Figure 114 f). La dernière étape consiste simplement à rapprocher les deux vésicules filles (Figure 114 g). Au-delà d'une certaine distance, les deux vésicules filles fusionnent et les réactifs sont mis en présence les uns des autres quasi-instantanément : la réaction enzymatique est initiée (Figure 114 h). ...
Context 49
... dernière étape consiste simplement à rapprocher les deux vésicules filles (Figure 114 g). Au-delà d'une certaine distance, les deux vésicules filles fusionnent et les réactifs sont mis en présence les uns des autres quasi-instantanément : la réaction enzymatique est initiée (Figure 114 h). ...
Context 50
... technique a été mise en place au laboratoire et nous a permis de former les réseaux nécessaires pour déclencher une réaction enzymatique (Figure 116). ...
Context 51
... également une espèce fluo- rescente dont le maximum d'émission se trouve à 583 nm pour un rendement quantique équivalent à Φ = 0,81 dans l'eau à pH 8,5 [326]. En termes de propriétés redox, la RS présente un groupement iminoquinone électroactif (Figure 117). Une réduction réversible à deux électrons conduit à la forma- tion de la dihydroresorufine (DH), forme qui ne présente pas de propriété photochimique particulière. ...
Context 52
... (N-acetyl-3,7-dihydrophenoxazine) est une sonde moléculaire largement utilisée en biochimie. Cette molécule porte un groupement acétyl sur l'azote du cycle 1,4-oxazine de la dihy- droresorufine, ce qui équivaut donc à une forme protégée de celle-ci et lui permet d'être stable en présence d'oxygène (Figure 117). L'AR est aujourd'hui commercialisé, souvent sous forme de kit, et sert de test de routine pour la détection d'espèces réactives de l'oxygène et de l'azote (ROS et RNS), catalysée par des enzymes (peroxydases, oxygénases, hydrogénases) [327]- [329]. ...
Context 53
... la Figure 118 a, le balayage en potentiel est effectué de 0 V à -0,85 V. On observe pour la resorufine une vague de réduction (I < 0) dont le potentiel de pic est proche de -0,5 V, puis sur le balayage retour, une vague d'oxydation (I > 0) à -0,25 V. Ce couple de vagues correspond à un système électrochimique réversible de transition de la resorufine à la dihydroresorufine (RS ↔ DH) impliquant le transfert de deux électrons et deux protons (Figure 117 b). Le voltampérogramme de l'AR ne présente qu'un épaulement à environ -0,65 V correspondant à une réduction qui semble irréversible bien qu'un large épaulement soit observé en oxydation à environ + 0,5 V. Aucun courant faradique n'est clairement identifié ce qui semble montrer que la resorufine ne soit pas formée par électrochimie dans ces conditions expérimentales. ...
Context 54
... la Figure 118 a, le balayage en potentiel est effectué de 0 V à -0,85 V. On observe pour la resorufine une vague de réduction (I < 0) dont le potentiel de pic est proche de -0,5 V, puis sur le balayage retour, une vague d'oxydation (I > 0) à -0,25 V. Ce couple de vagues correspond à un système électrochimique réversible de transition de la resorufine à la dihydroresorufine (RS ↔ DH) impliquant le transfert de deux électrons et deux protons (Figure 117 b). Le voltampérogramme de l'AR ne présente qu'un épaulement à environ -0,65 V correspondant à une réduction qui semble irréversible bien qu'un large épaulement soit observé en oxydation à environ + 0,5 V. Aucun courant faradique n'est clairement identifié ce qui semble montrer que la resorufine ne soit pas formée par électrochimie dans ces conditions expérimentales. ...
Context 55
... relation linéaire entre le courant du pic anodique (vague d'oxydation) de l'AR et la racine carrée de la vitesse de balayage est mise en évidence, démontrant alors que le mécanisme redox est sous contrôle diffusionnel. Le coefficient de diffusion de l'AR peut être déterminé à partir des données de la Figure 118 d. Le calcul, basé sur l'équation de Randles-Ševcik, prend en compte la pente de la droite et est fait dans l'hypothèse d'une réaction redox à deux électrons suivie d'une réac- tion chimique de dismutation [331]. ...
Context 56
... cette expérience, nous avons fabriqué une cellule d'électrochimie hermétique permettant le passage d'un flux d'azote et la présence des trois électrodes (électrode de travail : macroélectrode de Pt, disque de diamètre 1,7 mm -électrode de référence : fil d'Ag/AgCl -contre-électrode : fil de Pt). Cette cellule, dont le fond est constitué d'une lamelle de verre d'épaisseur 0,17 mm est adaptée à la microscopie inverse (Figure 120). Un laser de longueur d'onde 514 nm est utilisé comme source lumineuse pour la microscopie et permet l'excitation de la RS. ...
Context 57
... série d'images est enregistrée au niveau de la surface de l'électrode au cours d'une ex- périence de chronoampérométrie à double saut de potentiels (Figure 121 a-b). Les potentiels de -0,7 V pendant 20 s puis + 0,5 V pendant 20 s sont appliqués de manière séquentielle (Figure 121 a). ...
Context 58
... série d'images est enregistrée au niveau de la surface de l'électrode au cours d'une ex- périence de chronoampérométrie à double saut de potentiels (Figure 121 a-b). Les potentiels de -0,7 V pendant 20 s puis + 0,5 V pendant 20 s sont appliqués de manière séquentielle (Figure 121 a). Les images de microscopie confocale permettant l'observation alternative de la génération puis de la dis- parition de la fluorescence sont enregistrées au cours des 20 s d'application de chaque potentiel à t = 3, 10 et 18 s (Figure 121 b). ...
Context 59
... potentiels de -0,7 V pendant 20 s puis + 0,5 V pendant 20 s sont appliqués de manière séquentielle (Figure 121 a). Les images de microscopie confocale permettant l'observation alternative de la génération puis de la dis- parition de la fluorescence sont enregistrées au cours des 20 s d'application de chaque potentiel à t = 3, 10 et 18 s (Figure 121 b). ...
Context 60
... séquence commence par l'application d'un potentiel de -0,7 V et aucun signal de fluores- cence n'est observé puis le passage au potentiel de + 0,5 V conduit à la formation de RS par oxydation de l'AR directement observable par l'apparition d'un fort signal d'émission de fluorescence ( Figure 121 b). L'intensité de fluorescence correspondante apparaît de façon progressive jusqu'au prochain saut de potentiel permettant la réduction de la RS fluorescente vers la DH non fluorescente : le signal diminue alors progressivement à la surface de l'électrode. ...
Context 61
... une série d'images est enregistrée sur une faible gamme de longueurs d'onde d'émission (bande passante = 10 nm) alors que la longueur d'onde d'excitation est fixée à 488 nm et le potentiel de l'électrode à + 0,5 V. L'in- tensité de fluorescence sur chaque gamme d'émission de 10 nm est ensuite extraite des images dans une région d'intérêt (ROI) correspondant à la surface de l'électrode. Le spectre d'émission peut alors être construit indirectement à partir de ces images (Figure 121 c). Le maximum d'émission se situe à ~ 590 nm et un épaulement est observé à ~ 640 nm, ce qui est caractéristique de la signature spectrale de la RS. ...
Context 62
... un premier temps, la production de resorufine via l'oxydation de l'AR catalysée par la HRP a été caractérisée en spectroscopie de fluorescence (Figure 123 a). La cinétique enzymatique est suivie en enregistrant l'émission de fluorescence de la RS (λ exc. ...
Context 63
... cette base, nous avons ensuite déterminé les concentrations optimales à utiliser en glucose et glucose oxydase. A nouveau, c'est le signal d'émission de fluorescence de la resorufine qui est suivi au cours du temps (Figure 123 b). Les concentrations en AR et HRP restent inchangées et dif- férentes concentrations en GOX ont été testées et ce, pour différentes concentrations en substrat (glu- cose). ...
Context 64
... chaque concentration en H 2 O 2 , la mesure est réalisée sur trois mélanges puis les résultats de ces trois essais sont moyennés. L'ensemble des intensités de fluorescence moyennées pour chaque concentration permettent d'obte- nir la courbe d'étalonnage ( Figure 124). L'intensité de fluorescence est linéaire par rapport à la concentration en peroxyde d'hydro- gène avec un coefficient de corrélation de 0,998 et une pente de 50,98 a.u. ...
Context 65
... première expérience consiste à faire gonfler les vésicules avec une solution de tampon PBS à pH 7,4 contenant le glucose (100 µM). Un mélange contenant la GOX (1 U.mL -1 final), la HRP (0,4 U.mL -1 final) et l'AR (50 µM final) est ensuite injecté dans la vésicule par électro-microinjection ( Figure 125). Une augmentation du signal de fluorescence au sein de la GUV est observée rapidement après injection. ...
Context 66
... que l'injection est arrêtée, le signal de fluorescence diminue en quelques dizaines de secondes jusqu'à un retour au niveau basal. Plusieurs injections successives montrent la reproduc- tibilité de la mesure (Figure 126). Cette première expérience met tout d'abord en évidence la perméa- bilité de vésicules vis-à-vis de la resorufine, mais pas uniquement. ...
Context 67
... mélange de GOX (5 U.mL -1 final) et HRP (0,4 U.mL -1 final) diluées dans le même tampon est injecté dans le milieu intra- vésiculaire. Le signal de fluorescence d'émission de la RS au niveau de la GUV est représenté sur la Figure 127. Une augmentation du signal est visualisée durant la première minute d'enregistrement puis une stabilisation indique qu'un état stationnaire est atteint. ...
Context 68
... enfin, bien que la resorufine puisse diffuser vers l'extérieur, dans le cas où la cinétique de diffusion de celle-ci est plus lente que la cinétique de production enzymatique, alors un signal de fluorescence au sein de la GUV sera observé. Ici, le plateau observé (Figure 127) correspond à un équilibre entre diffusion et produc- tion de la RS. En complément de cette analyse qualitative et de manière analogue aux calculs de cinétique de conversion utilisés pour le glucose, le temps nécessaire pour consommer l'AR peut être déterminé. ...
Context 69
... partie de la fibre qui est à l'extérieur du capillaire est d'abord entièrement isolée par électrodéposition d'un polymère (polyoxyphénylène). L'extrémité de la fibre est ensuite micro-polie avec un angle de 45° ce qui a pour effet de retirer le polymère de la zone polie et de mettre à jour un disque de carbone conducteur uniquement au niveau de la pointe de l'électrode ( Figure 128). Enfin, du noir de Pt est électro-déposé sur la surface de l'électrode dans le but d'augmenter la surface spécifique de celle-ci et donc de gagner en sensibilité lors de la détection ( Figure 129). ...
Context 70
... de la fibre est ensuite micro-polie avec un angle de 45° ce qui a pour effet de retirer le polymère de la zone polie et de mettre à jour un disque de carbone conducteur uniquement au niveau de la pointe de l'électrode ( Figure 128). Enfin, du noir de Pt est électro-déposé sur la surface de l'électrode dans le but d'augmenter la surface spécifique de celle-ci et donc de gagner en sensibilité lors de la détection ( Figure 129). Cependant, le dépôt d'une trop grande quantité de noir de Pt provoque la diminution du rapport signal/bruit en faisant augmenter le courant capacitif au détriment d'une bonne résolution du courant faradique. ...
Context 71
... petite par rapport au volume total de la solution (6 mL), seule une très faible quantité de H 2 O 2 est oxydée, et la concentration ne diminue pas au cours du temps assurant la stabilité du niveau de courant. Le zoom aux faibles concentrations présenté sur la Figure 130 nous permet d'établir que la limite minimale de détection des UME utilisées se trouve autour de 500 nM. En deçà, le rapport signal/bruit ne nous permet pas distinguer un changement de courant significatif lors des ajouts d'H 2 O 2 . ...
Context 72
... établir la droite d'étalonnage, la valeur de l'intensité du courant de chaque palier (af- franchi du courant de base) est moyennée et est mise en rapport avec la concentration en H 2 O 2 cor- respondante ( Figure 131). Le domaine de linéarité est respecté sur la gamme de concentration étudiée (R² = 0,998) et la pente de la courbe d'étalonnage est établie à 0,29 nA.µM -1 . ...
Context 73
... cela, des solutions d'H 2 O 2 sont préparées (gamme de concentration : 0,1 à 1 mM) en tampon PBS (10 mM, pH 7,4) et de la fluorescéine est ajoutée (60 µM). Cette expérience est réalisée sous contrôle microscopique et la fluo- rescéine permet de visualiser le flux fourni par la microinjection de solutions d'H 2 O 2 ( Figure 132). Lorsqu'un flux continu de fluorescéine est envoyé sur l'électrode, aucune modification du signal de courant n'est observée, démontrant alors la transparence de cette espèce lors de la mesure chronoampérométrique. ...
Context 74
... pression d'injection doit être calibrée de façon à négliger la dilution établie lors l'injection de la solution dans le volume, autrement dit, de façon à ce que la concentration du flux détecté corresponde à la concentration de la solution dans la pipette d'injection. Pour se faire, Figure 133 Chronoampérométrie enregistrée à + 0,9 V vs. Ag/AgCl avec une UME fibre de carbone (10 µm de diamètre) platinée (10 µC). L'injection continue d'une solution de fluores- céine à 60 µM (diluée dans le PBS 10 mM, pH 7,4) n'entraine pas de modification du signal. ...
Context 75
... étape est dépendante de la micropipette d'injection et doit être renouvelée pour chaque solution de peroxyde d'hydrogène. Chaque solution est injectée pendant 20 secondes à quatre reprises, dans le but de s'assurer de la reproductibilité de la mesure ( Figure 134). Le profil du signal de variation de courant adopte une forme en créneaux. ...
Context 76
... par chronoampérométrie (+ 0,35 V vs. Ag/AgCl). La démarche à suivre pour ce type d'expé- rience se déroule comme suit : les vésicules sont d'abord formées en tampon PBS (10 mM, pH 7,4) et une quinzaine de minutes après leur gonflement, elles sont récupérées et transférées sur une lame en verre recouverte de résine SU-8 directement disposée sur le microscope (Figure 136). Les élec- trodes sont ensuite positionnées dans la solution : d'une part, une UME à fibre de carbone platinée (10 µm diamètre, charge de platination = 10 µC) sert d'électrode de travail pour l'électrochimie et un fil d'argent recouvert d'un dépôt de chlorure d'argent sert à la fois d'électrode de référence et de contre électrode (la quantité d'espèce produite à la contre électrode étant négligeable dans le cas des UME, un système à 2 électrodes peut être utilisé ici). ...
Context 77
... parallèle, les vésicules ont le temps de sédimenter et s'immobilisent sur la résine. Il s'agit ensuite de sélectionner une GUV de façon à ce que le réservoir ne gène ni lors de la microinjection ni lors de la détection, puis, un mélange d'H 2 O 2 (2,5 mM) et de fluorescéine (60 µM) est microinjecté dans le liposome choisi (Figure 137 a). Ici, l'injection dure 50 s mais l'électrode n'est positionnée au voisinage de la membrane qu'après le début de l'injection, ce qui explique les quelques secondes de latence entre le début de l'injection et la variation de courant observée sur la Figure 137 b. ...
Context 78
... s'agit ensuite de sélectionner une GUV de façon à ce que le réservoir ne gène ni lors de la microinjection ni lors de la détection, puis, un mélange d'H 2 O 2 (2,5 mM) et de fluorescéine (60 µM) est microinjecté dans le liposome choisi (Figure 137 a). Ici, l'injection dure 50 s mais l'électrode n'est positionnée au voisinage de la membrane qu'après le début de l'injection, ce qui explique les quelques secondes de latence entre le début de l'injection et la variation de courant observée sur la Figure 137 b. Lorsque l'injection est terminée, l'intensité du signal électrochimique diminue jusqu'à un retour à la ligne de base. ...
Context 79
... polarisation de l'électrode, une solution de GOX (134 pL à 2,5 U.mL -1 , soit 3,36.10 -7 U) est injectée au sein du microréacteur conduisant au déclenchement de la réaction enzymatique. Le peroxyde d'hydrogène est produit au sein de la vésicule puis diffuse à travers la membrane et est détecté à la surface de l'électrode placée au voisinage de la membrane ( Figure 138 La production de peroxyde d'hydrogène est suivie par chronoampérométrie dès que la réac- tion est déclenchée par injection de la GOX (Figure 139). Comme démontré au paragraphe précédent, le glucose peut diffuser à travers la membrane ce qui permet un apport constant en substrat au sein du microréacteur tandis que l'enzyme reste confinée dans le milieu intravésiculaire. ...
Context 80
... polarisation de l'électrode, une solution de GOX (134 pL à 2,5 U.mL -1 , soit 3,36.10 -7 U) est injectée au sein du microréacteur conduisant au déclenchement de la réaction enzymatique. Le peroxyde d'hydrogène est produit au sein de la vésicule puis diffuse à travers la membrane et est détecté à la surface de l'électrode placée au voisinage de la membrane ( Figure 138 La production de peroxyde d'hydrogène est suivie par chronoampérométrie dès que la réac- tion est déclenchée par injection de la GOX (Figure 139). Comme démontré au paragraphe précédent, le glucose peut diffuser à travers la membrane ce qui permet un apport constant en substrat au sein du microréacteur tandis que l'enzyme reste confinée dans le milieu intravésiculaire. ...
Context 81
... signifie qu'après injection de la GOX dans le liposome, une production continue d'H 2 O 2 est attendue, et ce, a priori, jusqu'à épuisement du substrat. Dans les conditions de l'expérience et en se basant sur l'activité de la GOX, nous avons modélisé la courbe théorique de production du peroxyde d'hydrogène en considérant le volume total de solution et la concentration en glucose (1 mM dans 500 µL, soit 5.10 -7 mol au total) et nous avons pu estimer la vitesse de production à 5,6.10 -15 mol.s -1 (Figure 140 a). Ainsi, il apparait que plusieurs milliers d'heures seraient nécessaires pour consommer la totalité du glucose. ...
Context 82
... partir du signal de chronoampérométrie, on observe le profil de la cinétique enzymatique avec une augmentation progressive du courant jusqu'à un plateau marquant l'état stationnaire de la production enzymatique (Figure 139 zone 1). Au plateau, l'enzyme produit du peroxyde d'hydrogène à une vitesse constante : cette vitesse est conditionnée par la cinétique d'apport du substrat au sein du microréacteur, et donc de la cinétique de diffusion du glucose du milieu extravésiculaire vers le milieu intravésiculaire. ...
Context 83
... plateau, l'enzyme produit du peroxyde d'hydrogène à une vitesse constante : cette vitesse est conditionnée par la cinétique d'apport du substrat au sein du microréacteur, et donc de la cinétique de diffusion du glucose du milieu extravésiculaire vers le milieu intravésiculaire. A partir du signal dans la zone 1 de la Figure 139, il est possible de calculer la charge à partir de l'intégration de la courbe et, par suite, de déterminer la quantité de peroxyde d'hydrogène détecté grâce à la loi de Faraday : Où í µí± est la quantité d'espèce électrolysée (mol), í µí± est la charge (C), í µí± § est le nombre d'électrons échangés, ℱ est la constante de Faraday (96 485 C.mol -1 ) et í µí°¼ í µí±¡ est le courant (A). Ainsi, il est possible de calculer la quantité de peroxyde d'hydrogène oxydée à la surface de l'électrode à chaque moment de la mesure (Figure 140 b). ...
Context 84
... partir du signal dans la zone 1 de la Figure 139, il est possible de calculer la charge à partir de l'intégration de la courbe et, par suite, de déterminer la quantité de peroxyde d'hydrogène détecté grâce à la loi de Faraday : Où í µí± est la quantité d'espèce électrolysée (mol), í µí± est la charge (C), í µí± § est le nombre d'électrons échangés, ℱ est la constante de Faraday (96 485 C.mol -1 ) et í µí°¼ í µí±¡ est le courant (A). Ainsi, il est possible de calculer la quantité de peroxyde d'hydrogène oxydée à la surface de l'électrode à chaque moment de la mesure (Figure 140 b). A partir de cette donnée, la vitesse de la réaction peut être obtenue en faisant une régression linéaire de la courbe n H2O2 = f(t) et est estimée à 6,6.10 -17 mol.s -1 . ...
Context 85
... partir de cette donnée, la vitesse de la réaction peut être obtenue en faisant une régression linéaire de la courbe n H2O2 = f(t) et est estimée à 6,6.10 -17 mol.s -1 . Cette valeur est bien inférieure à la vitesse simulée présentée sur la Figure 140 a. Cependant, la quantité de pe- roxyde d'hydrogène réellement oxydée est sous-estimée par rapport à la quantité réelle produite puisque la réaction anodique n'a lieu qu'à la surface de l'électrode mais le H 2 O 2 produit diffuse dans l'ensemble du volume. Ici la surface de l'électrode ne représente que 2% de la surface totale de la vésicule. ...
Context 86
... la surface de l'électrode ne représente que 2% de la surface totale de la vésicule. Ainsi pour estimer quelle quantité de peroxyde d'hydrogène est réellement produite par la réaction enzymatique, il faut multiplier la quantité d'espèce oxydée par le facteur de collecte (x 50) (Figure 140 c). Dans ce cas, la valeur de la vitesse de production est de 3,3.10 -15 mol.s -1 ce qui correspond à 60% de la valeur théorique calculée sur la modélisation (5,6.10 -15 mol.s -1 ). ...
Context 87
... nouveau, il serait intéressant de pouvoir simuler ces effets pour pouvoir calculer une vitesse de production d'H 2 O 2 plus précisément. Par ailleurs, dans la zone 2 de la Figure 139, l'électrode est éloignée d'environ 100 µm puis repositionnée au voisinage de la membrane de manière périodique conduisant au profil en créneau du signal de chronoampérométrie. Lorsque l'électrode est éloignée de la vésicule, c'est-à-dire de la source de peroxyde d'hydrogène, le courant diminue instantanément. ...
Context 88
... une étude de la sensibilité in situ des UME en considérant la distance entre l'électrode et la membrane de la vésicule a été réalisée. La détection par chronoampérométrie de l'expérience décrite dans ce paragraphe est poursuivie avec le même microréacteur contenant la glucose oxydase : la Figure 141 (a) fait suite à la Figure 139. De la même façon que représentée sur la zone 2 de la Figure 139, ici l'électrode est éloignée puis rapprochée de la membrane à des distances contrôlées. ...
Context 89
... une étude de la sensibilité in situ des UME en considérant la distance entre l'électrode et la membrane de la vésicule a été réalisée. La détection par chronoampérométrie de l'expérience décrite dans ce paragraphe est poursuivie avec le même microréacteur contenant la glucose oxydase : la Figure 141 (a) fait suite à la Figure 139. De la même façon que représentée sur la zone 2 de la Figure 139, ici l'électrode est éloignée puis rapprochée de la membrane à des distances contrôlées. ...
Context 90
... détection par chronoampérométrie de l'expérience décrite dans ce paragraphe est poursuivie avec le même microréacteur contenant la glucose oxydase : la Figure 141 (a) fait suite à la Figure 139. De la même façon que représentée sur la zone 2 de la Figure 139, ici l'électrode est éloignée puis rapprochée de la membrane à des distances contrôlées. Ainsi, une relation entre l'intensité du courant et la distance entre l'UME et la membrane de la GUV peut être établie (Figure 141 b), elle correspond à une perte de 0,90 pA.µm -1 . ...
Context 91
... la même façon que représentée sur la zone 2 de la Figure 139, ici l'électrode est éloignée puis rapprochée de la membrane à des distances contrôlées. Ainsi, une relation entre l'intensité du courant et la distance entre l'UME et la membrane de la GUV peut être établie (Figure 141 b), elle correspond à une perte de 0,90 pA.µm -1 . Ici, le maximum d'in- tensité de courant est de 34 pA et la ligne de base se situe à 21,5 pA ce qui signifie que le signal maximal (lorsque l'électrode est au plus proche de la membrane) est de 12,5 pA. ...
Context 92
... vu de ce dernier résultat, les 3 µm qui séparent l'électrode et la membrane au cours de la mesure (zone 1 de la Figure 139 conditions, il est raisonnable de penser que cet effet de distance est partiellement responsable de l'écart entre la modélisation et l'expérience de la Figure 140 c. A cela s'ajoute les approximations faites sur le calcul de la courbe de modélisation précédemment discutées. ...
Context 93
... vu de ce dernier résultat, les 3 µm qui séparent l'électrode et la membrane au cours de la mesure (zone 1 de la Figure 139 conditions, il est raisonnable de penser que cet effet de distance est partiellement responsable de l'écart entre la modélisation et l'expérience de la Figure 140 c. A cela s'ajoute les approximations faites sur le calcul de la courbe de modélisation précédemment discutées. ...
Context 94
... profil obtenu est différent de celui attendu : une augmentation de courant est bien observée à chaque ajout mais le signal diminue rapidement juste après (Figure 143). Cette chute post-ajout est la marque d'une instabilité du système de détection du NO • . ...
Context 95
... l'hypothèse où cette espèce serait l'oxygène, un traitement des données est proposé en annexe (Annexe IV) dans le but de calculer la concentration résiduelle en oxygène dans la solution à partir des cinétiques de décroissance du courant de la Figure 145). Le fournisseur indique que le temps de demi-vie du DEA-NONOates est de 16 min à 25°C et à pH 7,4 [341]. ...
Context 96
... suivi par spectroscopie UV-visible a été réalisé et permet de calculer la constante de vi- tesse associée au NONOate utilisé (Figure 146). L'évolution de l'absorbance à 250 nm permet de calculer la concentration en NONOates au cours du temps (ɛ DEA = 8 000 M -1 .cm ...
Context 97
... temps avant injection est difficilement contrôlable et il n'a pas été possible, dans cette expérience de preuve de principe, de connaître exactement la concentration de NO • formée. Néanmoins, l'analyse par chronoampérométrie à + 0,65 V (Figure 148) montre qu'un flux d'espèce est détecté, qui ne peut être ni celui des nitrites ni du groupement diéthylamine du DEA-NONOate à ce potentiel. La variation de courant est faible, de l'ordre de 10-15 pA mais soutenue pendant chaque injection. ...
Context 98
... vs. Ag/AgCl (potentiel de détection simultanée de NO • et NO 2 -) et leurs réponses électrochimiques ont été suivies par chronoampérométrie ( Figure 149). A la vue de ces résultats, il apparait clair que ces espèces s'oxydent électrochimiquement et risquent d'interférer avec le signal des espèces d'intérêt. ...
Context 99
... le capillaire dans le rail prévu à cet effet et bloquer le dans les mâchoires de façon à ce que le milieu du capillaire soit positionné en face du point d'irradiation laser ( Figure 156). Pour obtenir les pipettes souhaitées, il faut faire varier un paramètre après l'autre en se référant au guide proposé par le fabriquant [346], [347]: Paramètre Augmenter Diminuer Heat -Diamètre de la pointe plus petit -Longueur de la pointe plus grande -Résistance plus élevée -Diamètre de la pointe plus large -Longueur de la pointe plus courte -Résistance plus faible Velocity -Diamètre de la pointe plus petit -Diamètre de la pointe plus large Delay -Longueur de la pointe plus courte -Longueur de la pointe plus grande Pull -Diamètre de la pointe plus petit -Longueur de la pointe plus grande -Diamètre de la pointe plus large -Longueur de la pointe plus courte Tableau 10 Influence de la modification des paramètres de l'étireuse laser sur la morphologie de la pointe de la pipette. ...
Context 100
... dilution, chacune des solutions contient 1,25 v/v% de DMSO. Mesurer l'absorbance de chacune des solutions ( Figure 164) puis tracer la courbe de l'absorbance à 571 nm (maximum d'absorbance) en fonction du pH. La méthode de la double tangente donne direc- tement accès au pKa de la resorufine, à savoir 5,95 ( Figure 165). ...
Context 101
... l'absorbance de chacune des solutions ( Figure 164) puis tracer la courbe de l'absorbance à 571 nm (maximum d'absorbance) en fonction du pH. La méthode de la double tangente donne direc- tement accès au pKa de la resorufine, à savoir 5,95 ( Figure 165). b. ...
Context 102
... Calibration du réactif de Griess : préparer la gamme étalon de NO 2 -d'après le tableau ci- dessous et enregistrer l'absorbance à 548 nm de chaque échantillon ( Figure 167). ...
Context 103
... un spectre de 300 à 700 nm de la solution de départ (HbO 2 ) puis après chaque ajout de NO • (conversion progressive d'HbO 2 en MetHb) ( Figure 169). ...
Context 104
... partir des données de l'expérience de calibration en solution pour le NO • réalisée par chro- noampérométrie (Chapitre 4, Figure 143) et en faisant l'approximation que la sensibilité de l'électrode est d'environ 0,009 nA.µM -1 , il est possible de calculer une constante de vitesse associée à la disso- ciation du NO • . L'hypothèse prise en compte pour le calcul de la constante í µí± est que l'instabilité du courant est liée à la présence d'oxygène au sein de la solution selon la réaction : La détermination de la constante í µí± ′ peut être déterminée en traçant la fonction : Pour traiter les données, nous avons procédé comme suit : ...
