Figura 1 - uploaded by Alexsandro Galdino
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Polímeros do amido. (A) um pequeno segmento da amilose, um polímero linear de moléculas de D-glicose. (B) Estrutura da amilopectina mostrando um ponto de ramificação. (C) Disposição das moléculas de amilose e amilopectina no grão de amido. Fonte: Lehninger et al. (2002).
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Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. α-Amilases têm aplicações nas indústrias de processamento do amido, produção de álcool, têxtil e outras. Na busca por fontes de amilases na biodiversidade do cerrado, uma levedura foi isolada e classificada como Cryptococcus flavus....
Context in source publication
Context 1
... growth and reached a maximal value (3.93 U mL À1 ) at 60 h of incubation (Fig. 3a). Cell growth was equivalent to that of the clone transformed with the vector alone (data not shown), indicating that the amylase production did not impair cell growth, and resulted in constitutive and cumulative production of a-amylase. Amylolytic activity was Fig. 1. Multiple sequence alignment of the conserved signature regions (I, II, III and IV) of a-amylases from several organisms. The figure compares amino acids of Bacli (Bacillus liqueniformis strain ATCC 27811, accession no. P06278), Bacsu (Bacillus subtilis, accession no. P00691), Ecoli (Escherichia coli strain JA11, accession no. P26612), ...
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Background:
The most important occupational allergens in baking include flour and enzymes, especially α-amylase. Although xylanolytic enzymes have previously been described as sensitizers, they may be overlooked during assessment of bakery workers with work-related symptoms.
Aims:
To report a case of a baker who suffered from work-related respir...
Citations
... Promoters P PGK1 and P ADH1 were further analyzed by placing the AMY1 gene from C. flavus, under control of promoters from JPU and S288C strains. This α-amylase has been selected because it is of eukaryotic origin and has been shown to function properly in S. cerevisiae (Galdino 2008;Galdino et al. 2008a). Thus, we try to eliminate the incompatibility variable of the gene to be expressed with the host yeast (Brat et al. 2009;Hoshida et al. 2013;Ilmén et al. 2011). ...
Polymorphism is well known in Saccharomyces cerevisiae strains used for different industrial applications, however little is known about its effects on promoter efficiency. In order to test this, five different promoters derived from an industrial and a laboratory (S288c) strain were used to drive the expression of eGFP reporter gene in both cells. The ADH1 promoter (P ADH1 ) in particular, which showed more polymorphism among the promoters analyzed, also exhibited the highest differences in intracellular fluorescence production. This was further confirmed by Northern blot analysis. The same behavior was also observed when the gene coding for secreted α-amylase from Cryptococcus flavus was placed under the control of either P ADH1 . These results underline the importance of the careful choice of the source of the promoter to be used in industrial yeast strains for heterologous expression.
... A literatura descreve a propriedade de inibição da atividade enzimática pelo íon mercúrio. A adição de mercúrio na reação ocasionou um aumento na atividade enzimática em percentual relativo de atividade, resultado que contradiz a literatura relacionada ao estudo de diferentes enzimas e ou complexos enzimáticos (Ding et al., 2002;De-Marco & Felix, 2007;Picart et al., 2007;Galdino, 2008). Com o propósito de avaliar melhor este resultado, foram utilizadas diferentes concentrações do íon mercúrio para observar as concentrações inibitórias da atividade da EGL1 recombinante. ...
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. Neste trabalho foram realizados estudos pioneiros de Biologia Molecular com o fungo Penicillium echinulatum linhagem 9A02S1 (DSM 18942), que resultaram no primeiro isolamento e caracterização de um cDNA correspondente ao gene egl1, codificador da endoglicanase 1 (EGL1). O cDNA egl1 foi obtido a partir de uma biblioteca construída sob condições de indução do sistema celulolitico deste fungo. Sua sequência, de 1161 pares de bases, exibe alto grau de identidade com genes de endoglicanases fúngicas da família 5A. Este codifica uma proteína predita de 387 resíduos de aminoácidos, com massa molecular de 41,1 kDa, ponto isoelétrico teórico de 4,99 e um sitio potencial de N glicosilação. A proteína predita possui três diferentes domínios: um domínio catalítico, um domínio de ligação à celulose (CBD) altamente conservado, e uma região de conexão entre os dois domínios (hinge). A partir da seqüência predita de aminoácidos de EGL1 foi possível realizar a modelagem tridimensional, utilizando-se proteínas existentes em banco de dados (PDB). Tal proteína apresenta propriedades estruturais similares às endoglicanases da família 5A. O cDNA egl1 foi clonado em um vetor de expressão de Pichia pastoris, pPIC9. Após a transformação, clones recombinantes exibindo maior atividade enzimática foram selecionados, utilizando-se micro-fermentações em placa Deep Well. Após a seleção do melhor clone produtor, foram avaliadas as propriedades bioquímicas da enzima recombinante, bem como a otimização das condições de cultivo e posterior caracterização de sua cinética enzimática. A enzima recombinante expressa em P. pastoris apresenta características de particular interesse para a utilização em processos indústriais: uma atividade ótima na faixa de pH 5,0 – 9,0, temperatura ótima a 60°C, exibindo alta termoestabilidade a 70°C após uma hora de pré-incubação, sendo a atividade da EGL1 recombinante fortemente estimulada pela adição do íon cálcio na reação. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT This work describes the pioneering molecular biology studies with the fungus Penicillium echinulatum lineage 9A02S1 (DSM 18942), which resulted in the first isolation and characterization of a cDNA corresponding to an egl1 gene, encoding a endoglucanase 1 (EGL1). The egl1 cDNA was obtained from a library constructed under induction conditions of the cellulolytic system of this fungus. The cDNA sequence is 1,161 base pairs long, showing high identity scores with genes of fungal endoglicanases family 5A. It encodes a predicted protein of 387 amino acid residues, with molecular mass of 41.1 kDa, theoretical isoelectric point of 4.99 and a potential site of N-glycosylation. The predicted protein has three different domains: a catalytic domain, a highly conserved carbohydrate binding domain (CBD), and a region linking the two domains (hinge). From the predicted amino acid sequence of EGL1 it was possible to perform a three-dimensional modeli, using protein sequences deposited in data bank (PDB). The solved structure revealed that this protein displays structural properties similar to those observed in family 5A endoglucanases. The egl1 cDNA was cloned in a Pichia pastoris expression vector, pPIC9. Following transformation, recombinant clones with higher enzymatic activity were selected, using microfermentations in Deep Well plates. After selecting the best producer clone, we evaluated the biochemical properties of recombinant enzyme, as well as the optimization of culture conditions and subsequent characterization of the enzyme kinetics. The recombinant EGL1 secreted by the recombinant P. pastoris revealed characteristics of particular interest for industrial applications: an optimal activity over a broad range pH (5.0 – 9.0) and an optimal temperature of 60°C. The recombinant EGL1 showed high thermostability at 70°C after 1 h of pre-incubation, and the activity of recombinant EGL1 was strongly stimulated by the addition of calcium ion in the reaction.
