Figure 2 - uploaded by Jerome Vialaret
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1D gel electrophoresis with PageBlue staining of proteins before and after albumin depletion. The albumin volume band comparison was done with Quantity One 1-D Analysis software (Bio-Rad). Left to right: Raw serum; FT: Flow Through (contains albumin); W1: first Wash; W2: second Wash; W3: third Wash; E: Elution; MW: Molecular weight.
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Human biological fluids are complex matrices containing many elements (ions, lipids, sugars, proteins, etc.). Proteins are essential for biomarker and disease discovery though the most abundant proteins often provide very limited clinically relevant data, as can be the case for albumin or immunoglobulins. In this work, we focused on depleting album...
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Citations
... Le taux de protéines retenues et d'environ 96%. Grâce à cela, 20 protéines n'ayant jamais été observées expérimentalement ont pu être validées par analyse de spectrométrie de masse[95].D'autres techniques existent aussi pour la déplétion d'albumine comme le Cibacron bleu[101,102] ou le kit AlbuVoid de Biotech Support[103]. Ces méthodes sont moins onéreuses et plus faciles à mettre en oeuvre. Cette dernière approche permet une déplétion de 91% de l'albumine. ...
Depuis quelques années, la spectrométrie de masse est considérée comme la méthode de référence en chimie analytique. La « protéomique », concept qui a émergé dans les années 2000, consiste en l’identification et/ou la quantification d’un ensemble de peptides et protéines présentes dans un échantillon donné (cellules, tissus, ou des prélèvements biologiques), à un instant donné. Un champ plus spécifique de ce concept, la « protéomique clinique » concerne plus particulièrement l’étude du protéome pour la recherche d’une part, de marqueurs diagnostiques, pronostiques et de suivi thérapeutique des pathologies humaines et, d’autre part, d’acteurs physiopathologiques pouvant servir de cible thérapeutique. Actuellement, la technologie de choix utilisée pour l’analyse des protéines en biochimie clinique est le dosage immuno-enzymatique de type ELISA qui possède des inconvénients majeurs : pas ou peu multiplexable, une grande variabilité, pas de standardisation interne et l’incapacité à distinguer des protéoformes d'une même protéine. La protéomique ciblée de type Liquid Chromatography/Multiple Reaction Monitoring (LC-MRM) permet de surpasser ces inconvénients car elle est multiplexable (>200 protéines/expérimentations), robuste, permet l’utilisation de standard protéique/peptidique interne, et permet de distinguer une grande variété de modifications post traductionnelles.Ce projet de thèse consiste donc à évaluer et valider des techniques de spectrométrie de masse ciblées de type LC-MRM pour la quantification de protéines d’intérêt cliniques. Dans ce cadre, nous allons présenter trois développements de méthode de protéomique clinique : le phénotypage de l’Apolipoprotéine E, facteur de risque de la maladie d’Alzheimer ; la quantification sérique d’un anticorps monoclonal thérapeutique (Bevacizumab) avec immuno-enrichissement ; et la quantification absolue de l’hepcidine dans le cadre des pathologies liées au métabolisme du fer.
Proteomic workflows that support serum proteomics can be especially challenging for two reasons: 1) the presence of highly abundant proteins, Albumin alone accounts for about 50% of the total protein mass, and 2) a particularly proteolytic resistant sample type due the large concentration of antibodies present. Many proteomic enrichment strategies employ the use of immuno-affinity depletion to remove one or more high abundance proteins. Some common limitations of immuno-affinity however are high costs, regeneration requirements which may result in a diminished and inconsistent performance, as well as a required marriage of species to antibody. Because of these limitations, researchers need ways to enrich differently. We have previously reported a variety of tools that can bias towards or against select sub-proteomes of serum without the use of immuno-affinity. Now we report the serum proteome bias characteristics of AlbuVoid™ & NuGel™ Protein A, alone or in serial combination, using LC-MS reporting metrics. Products and digest conditions produce different proteome qualitative and quantitative windows of observation. For biomarker discovery, we solicit the value for enrichment of categorical sub-proteomes to provide mechanistic insight into disease pathologies. For this, a knowledgebase of over 1000 serum proteins is now available to help proteomic researchers choose the best available products and methods for their particular needs.
